Summary
ويقتصر عمل مع فيروسات الإيبولا المعدية لمستوى السلامة الأحيائية 4 مختبرات. تكرار وفيروس النسخ المختصة مثل الجزيئات التي تحتوي على minigenome Tetracistronic (trVLPs) تمثل نظام نمذجة دورة حياة تسمح لنا نموذج بأمان دورات المعدية متعددة تحت مستوى السلامة الحيوية 2 الظروف، والاعتماد حصرا على مكونات فيروس إيبولا.
Abstract
تسبب فيروسات الإيبولا النزفية الحادة في البشر والرئيسيات غير البشرية، مع حالة معدلات الوفيات تصل إلى 90٪. لا توجد اللقاحات المعتمدة أو علاجات محددة لهذا المرض التي تسببها هذه الفيروسات، والعمل مع الفيروسات المعدية إيبولا يقتصر على مستوى السلامة الأحيائية 4 مختبرات، مما يحد بشكل كبير من البحوث حول هذه الفيروسات. نظم النمذجة دورة حياة نموذج دورة حياة الفيروس تحت مستوى السلامة الحيوية 2 شروط؛ ومع ذلك، حتى وقت قريب مثل هذه الأنظمة قد اقتصرت على الجوانب الفردية سواء من دورة حياة الفيروس، أو دورة واحدة المعدية. minigenomes Tetracistronic، والتي تتكون من مناطق فيروس إيبولا غير الترميز، الجين المراسل، وثلاثة جينات فيروس إيبولا المشاركة في التشكل، في مهدها، ودخول (VP40، GP 1،2، وVP24)، ويمكن أن تستخدم لإنتاج التكرار والنسخ الجسيمات -competent الفيروسات مثل (trVLPs) التي تحتوي على هذه minigenomes. يمكن لهذه trVLPs تصيب باستمرار الخلايا معربا عن الإيبولابروتينات الفيروس المسؤول عن تكرار الجينوم والنسخ، مما يسمح لنا نموذج بأمان دورات المعدية متعددة تحت مستوى السلامة الحيوية 2 الظروف. الأهم من ذلك، وتستمد مكونات الفيروسية من هذه الأنظمة فقط من فيروس الإيبولا وليس من الفيروسات الأخرى (كما هو، على سبيل المثال، في حالة النظم التي تستخدم الفيروسات pseudotyped) لا overexpressed، وVP40، GP 1،2 و VP24 في هذا النظام ، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة التشكل، في مهدها والدخول، على الرغم من الجوانب الأخرى من دورة حياة الفيروس مثل تكرار الجينوم والنسخ ويمكن أيضا أن تكون على غرار مع هذا النظام. وبالتالي، يمثل trVLP فحص tetracistronic نظام النمذجة دورة حياة المتوفرة الأكثر شمولا لفيروسات الإيبولا، ولديه إمكانيات هائلة للاستخدام في التحقيق في البيولوجيا من الفيروسات فيروس إيبولا في المستقبل. هنا، ونحن نقدم معلومات مفصلة عن استخدام هذا النظام، فضلا عن النتائج المتوقعة.
Introduction
فيروسات الإيبولا هي العامل المسبب لحمى نزفية حادة في البشر والرئيسيات غير البشرية مع معدلات الوفيات تصل إلى 90٪ في تفشي الإنسان 1. بينما تم إحراز تقدم كبير في السنوات الأخيرة في تطوير لقاحات وكذلك علاجات محددة (استعرضت في 2،3)، لا يتم الموافقة عليها هذه للاستخدام البشري. إيبولا جزيئات الفيروس لديها مميزة مثل موضوع ظهور بطول حوالي 1 ميكرون ويبلغ قطرها 96-98 نانومتر 4. وهناك أشكال قفيصة منواة جوهر الجسيمات الفيروسية وتتكون من 1) وغير مجزأة واحد الذين تقطعت بهم السبل، بالمعنى السلبي الجينوم RNA، الذي يشفر الجينات 7 ebolavirus (الشكل 1)، 2) البروتين النووي NP، التي encapsidates الجينوم، 3 ) مجمع الفيروسي البلمرة يتألف من L البلمرة وVP35 العامل المساعد لها، و4) المنشط VP30 النسخي. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين مؤخرا أن VP24 بروتين يرتبط أيضا مع قفيصة منواةث 4. ويحيط قفيصة منواة من مساحة المصفوفة التي البروتين مصفوفة VP40، وهي المسؤولة عن التشكل والناشئين من virions، ويقع. ويلفها مزيد من جزيئات الفيروس، وجزءا لا يتجزأ في هذا الظرف هو بروتين السطح الوحيد GP 1،2، وهي المسؤولة عن مرفق الفيريون والدخول.
العمل مع فيروسات الإيبولا المعدية لابد من القيام بها في مختبر الاحتواء الأقصى تحت مستوى السلامة الحيوية (BSL) 4 شروط، الذي يقيد هذا العمل إلى عدد قليل من المرافق في جميع أنحاء العالم. من أجل دراسة بيولوجية هذه الفيروسات أو لتطوير علاجات جديدة في ظل ظروف BSL2 والباحثين تعتمد إما على overexpression المؤتلف من فيروس إيبولا البروتينات، أو على نظم النمذجة دورة حياة، وكلاهما يمكن أن يعمل مع في غياب فيروس الايبولا المعدي. يتحقق التعبير المؤتلف من فيروس إيبولا البروتينات إما من البلازميدات التعبير أو ناقلات فيروسية. وهناك حالة خاصة لهذه الاستراتيجية هيجيل من virions أو جزيئات الفيروسات مثل الفيروسات الأخرى على أساس من فيروسات الإيبولا (الفيروسات القهقرية الأكثر شيوعا أو فيروس التهاب الفم الحويصلي) بحضور recombinantly أعرب GP 1،2، مما يؤدي إلى توليد جسيمات pseudotyped، والتي يمكن استخدامها لدراسة عملية دخول filoviruses والشاشة لمثبطات دخول 5. بدلا من ذلك، المؤتلف الفيروسات (مثل فيروس التهاب الفم الحويصلي) التي تكود فيروس إيبولا GP 1،2 بدلا من بروتين سكري الخاصة بهم يمكن توليدها واستخدامها لدراسة دخول الفيروس تحت مستوى السلامة الحيوية 2 شروط 6.
نظم النمذجة دورة حياة هي أشكال من أنظمة الوراثة العكسية وشارك فيها استخدام اقتطاع نظائرها جينوم فيروس إيبولا (minigenomes)، التي يتم إنتاجها في البداية من [كدنا] ثم تكرارها ونسخها بواسطة بروتينات فيروس إيبولا في المقدمة العابرة. وقد تم تطوير نظام minigenome الأول لفيروس إيبولا منذ أكثر من 15 عاما 7، ومنذ ذلك الحين تستخدم لدراسة فيروس إيبولا تكرار الجينوم والنسخ (استعرضت في 8،9). في هذا النظام على minigenome monocistronic تتألف من الجين مراسل واحد يحيط بها من المناطق الطرفية غير الترميز من الجينوم فيروس إيبولا (دعا الزعيم ومقطورة) (الشكل 1) يتم التعبير في خلايا الثدييات (عادة عن طريق النسخ باستخدام T7 RNA البلمرة) جنبا إلى جنب مع البروتينات الفيروسية L، VP35، VP30 وNP. وencapsidated على minigenome بواسطة NP، ومن ثم تكرارها وكتب من قبل البروتينات قفيصة منواة أخرى باستخدام إشارات رابطة الدول المستقلة المفعول المحلية في الزعيم ومقطورة، مما أدى إلى النشاط الصحفي الذي يعكس هذين الجانبين من دورة حياة فيروس (الشكل 2).
من أجل نمذجة خطوات إضافية من دورة حياة الفيروس، النسخ والتكرار المختصة للفيروسات مثل الجسيمات وقد وضعت أنظمة (trVLP)، والتي تقوم على أنظمة minigenome الكلاسيكية، ولكن ميزة لالتعبير dditional من البروتينات الفيروسية الأخرى VP24، VP40 وGP 1،2 من البلازميدات التعبير 10،11. وجود VP40 يؤدي إلى تشكيل trVLPs التي تتحمل GP 1،2 على سطحها، وتحمل قفيصة منواة التي تحتوي على minigenome في الداخل. هذه trVLPs يمكن استخدامها لتصيب الخلايا المستهدفة، والتي إما أن تكون قد pretransfected مع البلازميدات التعبير عن L، VP35، VP30 وNP، لتسهيل التكرار والنسخ من minigenomes جلبت الى الخلايا المستهدفة ضمن trVLPs 11، أو هي ساذجة الخلايا المستهدفة (أي دون التعبير يحركها بلازميد من فيروس إيبولا البروتينات) 10. هذه النتائج في النشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة، وهو ما يعكس تكرار minigenomes في الخلايا المنتجة، والتشكل مهدها من trVLPs، دخولهم إلى الخلايا المستهدفة، و1) في حالة الخلايا المستهدفة pretransfected أيضا مضاعفة الجينوم والنسخ الثانوي ( أي نسخ من البروتينات الفيروسية همزuced في الخلايا المستهدفة) في الخلايا المستهدفة، أو 2) في حالة الخلايا المستهدفة ساذجة أيضا النسخ الأولية (أي النسخ من البروتينات الفيروسية جلبت الى الخلايا المستهدفة ضمن trVLPs) (الشكل 3). الأهم من ذلك، فقط قد تم استخدام هذه النظم في تصميم نموذج لدورة واحدة المعدية، والاعتماد على overexpression من جميع البروتينات الفيروسية، والتي في حالة وVP24 VP40 هو إشكالية خاصة، حيث ثبت أن هذه البروتينات المنظمين سلبية قوية من تكرار الجينوم وعندما overexpressed النسخ من البلازميدات 12،13. علاوة على ذلك، الاستعدادات trVLP المنتجة في هذه النظم تحتوي على نسبة عالية من الجسيمات غير معدية مما يشكل تحديات خطيرة لتحليل الكيمياء الحيوية من trVLPs المعدية 14.
من أجل التغلب على هذه المشاكل، وقد وضعنا مؤخرا نظام minigenome tetracistronic أنه بالإضافة إلى الجين المراسل، يحتوي أيضا على الجينات التي تكود للVP40، GP 1،2 وVP24 (الشكل 1). على غرار نظام minigenome monocistronic الكلاسيكية، وهذا النظام يؤدي إلى إنتاج trVLPs التي يمكن ان تصيب الخلايا المستهدفة (الشكل 4) 15. ومع ذلك، وعلى النقيض من نظام minigenome الكلاسيكية، ويتم إنتاج VP40، GP 1،2، وVP24 بعد الجينوم الفيروسي النسخ بدلا من أن overexpressed من البلازميدات. ونتيجة لذلك، حركية ومستويات التعبير عن هذه البروتينات تقليد أكثر من ذلك بكثير عن كثب تلك التي وجدت خلال دورة الحياة الفيروسية، وبالتالي نسبة من الأمراض المعدية إلى trVLPs غير المعدية يزداد حوالي 500 أضعاف في هذا النظام 15. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام هذا النظام كان من الممكن باستمرار مرور trVLPs التي تحتوي على minigenome tetracistronic، ووضع نماذج دورات المعدية متعددة. على هذا النحو، trVLPs tetracistronic حاليا نظام النمذجة دورة حياة أشمل المتاحة لدراسة فيروس إيبولا البيولوجيا في ظل ظروف BSL2. هنا، ونحن نقدم معلومات مفصلة عن استخدام سو هذا النظام، فضلا عن النتائج المتوقعة.
Protocol
1. تقسيم الخلايا المنتجة للإنتاج الأولي من trVLPs
- إزالة المتوسطة 80-90٪ متموجة 293 الخلايا المستزرعة في 75 سم 2 قوارير في أعلى مستوى الجلوكوز تعديل المتوسطة النسر Dulbecco ل(DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، و1X القلم / بكتيريا (DMEM10 ). غسل الخلايا مرتين مع 10 المالحة الفوسفات مخزنة مل (PBS)، والحرص على عدم طرد الخلايا، وإضافة 2 مل التربسين-EDTA إلى الخلايا.
- احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة حتى تظهر خلايا التقريب كبير عندما لاحظ تحت المجهر (حوالي 30 ثانية). إزاحة الخلايا من خلال استغلال قارورة، وإضافة 8 مل DMEM10. و resuspend بدقة الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا ونزولا حتى لوحظ تعليق خلية واحدة عند النظر إليها تحت المجهر.
- عد الخلايا باستخدام عداد خلية الآلي. تمييع الخلايا إلى 2 × 10 5 خلية لكل مليلتر في DMEM10. ماصة 2 مل من تعليق خلية لكل بئر في 6 جيدا لوحات (4 × 105 خلايا لكل بئر).
- احتضان لوحات في ترطيب حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
2. ترنسفكأيشن من الخلايا المنتجة للإنتاج الأولي من trVLPs
- 24 ساعة بعد تقسيم الخلايا (انظر الشكل 5 لمحة عامة عن توقيت التجربة)، ماصة بلازميد الحمض النووي 15 (للمبالغ انظر الجدول 1) إلى العقيمة 2 مل cryovial باستخدام نصائح تصفيتها. إضافة 100 ميكرولتر OptiMEM لكل بئر على الحمض النووي. دوامة الخليط لفترة وجيزة وبلطف تدور باستمرار الأنابيب باستخدام microfuge. إذا عدة آبار وسيتم transfected مع البلازميدات متطابقة، يمكن إجراء mastermix لعدة آبار.
- لفترة وجيزة دوامة القارورة مع العابر LT1 قبل الاستخدام. إضافة 7.5 ميكرولتر العابر LT1 لكل بئر على الحمض النووي المخفف. دوامة بلطف الخليط، مع الحرص على عدم جمع السائل في غطاء cryovial، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- المزيج بلطف ترنسفكأيشنمجمع pipetting صعودا وهبوطا. إضافة 100 ميكرولتر من المجمعات ترنسفكأيشن قطرة قطرة إلى كل بئر. موسيقى الروك لوحة إلى الأمام / الخلف ومن جانب إلى آخر لتوزيع المجمعات ترنسفكأيشن. لا دوامة لوحة وهذا سوف يسبب متفاوتة انتشار المجمعات ترنسفكأيشن.
- العودة الخلايا إلى الحاضنة.
- بعد 24 ساعة، وإزالة طاف من الخلايا. إضافة 4 مل DMEM مع 5٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، 1X القلم / بكتيريا (DMEM5) إلى الخلايا. ويمكن القيام بهذه الخطوة لمدة تصل إلى 3 آبار في وقت دون جفاف الآبار، على افتراض الآبار تحتوي على عينات مماثلة (وإلا، نظرا لطبيعة تضخيم الذات من trVLPs في هذا النظام، انتقال التلوث يمكن أن تصبح قضية و وينبغي أن يتم هذا خطوة جيدة في وقت واحد).
- العودة الخلايا إلى الحاضنة.
3. إعداد الخلايا المستهدفة
- 293 تقسيم الخلايا كما هو موضح في القسم 1، بذر 4 × 10 5 الخلايا في 2 مل لكل بئر DMEM10 للوحة 6 جيدا.
- 24 ساعة بعد تقسيم الخلايا المستهدفة و 24 ساعة قبل العدوى، والخلايا المستهدفة بالنقل كما هو موضح في القسم 2 باستخدام الحمض النووي المبالغ في الجدول رقم 1، و 4.5 ميكرولتر العابر LT1 لكل بئر.
4. العدوى من الخلايا المستهدفة وحصاد الخلايا المنتج
- نقل supernatants من الخلايا المنتجة إلى 15 مل أنابيب. إزالة وتجاهل أي طاف المتبقية باستخدام خرطوم فراغ. إضافة 250 ميكرولتر بالشبكة تحلل العازلة للخلايا.
- طاف الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 800 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمسح عينات من الحطام الخلوي.
- إزالة طاف من بئر واحدة من الخلايا المستهدفة. إضافة بعناية 3 مل من مسح طاف خلية منتجة لاستهداف الخلايا باستخدام أبطأ سرعة ماصة. pipetting لتجنب مباشرة على الخلايا من أجل تجنب تعطيل أحادي الطبقة الخلية. هذه الخطوة لابد من القيام به بشكل جيد في وقت واحد.
- عندما كانت جميع العينات العابرةferred، والعودة الخلايا المستهدفة إلى حاضنة للسماح الترسيب من trVLPs وإصابة الخلايا المستهدفة.
- بعد 15 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة في المخزن المؤقت تحلل بالشبكة، resuspend الخلايا منتج في المخزن المؤقت تحلل باستخدام micropipette المقرر أن 150 ميكرولتر، ونقل العينة إلى 2 مل cryovial. عند هذه النقطة، لست] يمكن تجميد في -80 درجة مئوية، أو مباشرة قياس كما هو موضح في القسم 6.
- 24 ساعة بعد الإصابة، وإزالة طاف من الخلايا المستهدفة. إضافة 4 مل لكل بئر DMEM5 إلى الخلايا. ويمكن القيام بهذه الخطوة لمدة تصل إلى ثلاثة آبار في كل مرة، إذا الآبار تحتوي على عينات مماثلة (وإلا، نظرا لطبيعة تضخيم الذات من trVLPs في هذا النظام، ويمكن انتقال التلوث أصبح قضية، ويجب أن تكون هذه الخطوة أحسنت واحدة في كل مرة).
5. حصاد الخلايا المستهدفة لدورة العدوى واحد
- إلا إذا كان ينبغي تقييم دورة المعدية واحدة، في 72 ساعة بعد الإصابة إزالة رانه طاف من الخلايا المستهدفة باستخدام خرطوم فراغ.
- حصاد الخلايا في 250 ميكرولتر بالشبكة تحلل العازلة كما هو موضح في القسم 4 للخلايا المنتجة.
6. حصاد الخلايا المستهدفة والركض المستمر لtrVLPs
- إذا trVLPs أن تكون passaged بشكل مستمر، وإعداد مجموعة جديدة من الخلايا المستهدفة على النحو المبين في المادة 3 بحيث تكون جاهزة للعدوى 72 ساعة بعد إصابة أول مجموعة من الخلايا المستهدفة (انظر الشكل 5).
- تصيب مجموعة جديدة من الخلايا المستهدفة على النحو المبين في المادة 4 (باستخدام أول مجموعة من الخلايا المستهدفة في مكان الخلايا المنتجة).
- كرر هذه الخطوات كل 72 ساعة.
تحليل 7. النشاط مراسل
- إذا جمدت لست] خلية، منها ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. التأكد من أن العينات وصلت درجة حرارة الغرفة قبل القياس.
- ذوبان الجليد المبلغ المطلوب (40 ميكرولتر لكل عينة) من Renilla بالشبكة عازلة الفحص (ط المجمدة مثالين مأخوذة) في درجة حرارة الغرفة. ضمان أن المخزن المؤقت وصلت درجة حرارة الغرفة قبل القياس.
- إضافة 1/100 حجم التاسع من Renilla بالشبكة الركيزة إلى المخزن المؤقت فحص Renilla بالشبكة للحصول على Renilla بالشبكة الكاشف، ومزيج من قبل vortexing. ماصة 40 ميكرولتر من كاشف Renilla بالشبكة البيضاء في لوحة 96 جيدا.
- إضافة 40 ميكرولتر من العينة إلى الكاشف Renilla-بالشبكة. انتظر 10 دقيقة، ثم قياس العينات في luminometer باستخدام التكامل وقت من 1 ثانية.
Representative Results
ترنسفكأيشن من 293 خلايا منتجة مع البلازميدات التعبير ترميز فيروس الإيبولا البروتينات قفيصة منواة NP، VP35، VP30، ولام، وminigenome tetracistronic ونتائج البلمرة T7 التبعي في minigenome التكرار والنسخ والنشاط المراسل أن هو كشفها بسهولة في 72 ساعة (الشكل 6 ). الأهم من ذلك أن النشاط احظ مراسل (10 5.6 الوحدات التلألؤ النسبية (RLU)) يتجاوز ذلك من السيطرة السلبية التي حذفت التعبير بلازميد ترميز L من ترنسفكأيشن (10 RLU 3) بأكثر من 2 السجلات. هو الأكثر احتمالا لانخفاض مستوى النشاط لوحظ حتى في غياب L بسبب المروج خفي في البلازميد minigenome. الخلايا المستهدفة المصابين trVLPs من طاف للخلايا منتجة في الواقع إلى حد ما تظهر زيادة مستويات النشاط مراسل بالمقارنة مع خلايا منتجة، وقيم تصل إلى ما بين 10 و 10 6 7 RLUs، اعتمادا على مرور. في المقابل، ثالدجاجة وpassaged طاف خلايا منتجة -l السيطرة على الخلايا المستهدفة (التعبير عن البروتين قفيصة منواة، بما في ذلك L)، والنشاط الصحفي لا يتجاوز ضجيج خلفية luminometer (حوالي 10 RLU 2).
وtrVLP فحص tetracistronic يمكن استخدامها لدراسة دورة حياة الفيروسات فيروس إيبولا. على سبيل المثال، والعدوى من 293 الخلايا مع trVLPs يعتمد على وجود عوامل مثل مرفق تيم-1 16، والتي لابد من توفيرها في العابرة في هذه الخلايا. وبالتالي، في trVLP فحص tetracistronic لوحظ انخفاض في النشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة من حوالي 100 أضعاف في غياب تيم-1 (الشكل 7A). كما يمكن تقييم دور بروتينات محددة (الفيروسية أو الخلوية) في دورة حياة الفيروس باستخدام تكنولوجيا رني مع هذا النهج. كمثال، رني بوساطة أسفل تنظيم L النتائج إلى انخفاض في النشاط مراسل حوالي 100 أضعاف، الأمر الذي يعكس الدور المركزي للL فيالتكرار والنسخ (الشكل 7B) 7. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن التلاعب مباشرة minigenome لتقييم تأثير الطفرات على دورة حياة الفيروس. وكمثال على ذلك، عندما يتم إلغاء VP24-التعبير من minigenome عن طريق إدخال 3 كودونات توقف فورا المصب من كودون بداية، والنشاط في خلايا مراسل منتج لا تتغير بشكل كبير. ومع ذلك، يتم تقليل النشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة بنحو 20 أضعاف بعد مرور واحد، و 400 أضعاف بعد ممرين، مما يشير إلى دور VP24 في إنتاج trVLPs المعدية (الشكل 7C) 15.
يتم إظهار الرقم 1. هيكل جينوم فيروس إيبولا وكذلك minigenomes monocistronic وtetracistronic. المناطق للبروتين فيروس إيبولا الترميز والحمراء (NP،VP35، VP30، وL) والأصفر (وVP40 VP24) أو الأزرق (GP 1،2) صناديق. وتظهر مناطق غير الترميز (NCRS) باللون الأخضر، مع الزعيم ومقطورة المناطق المشار إليها. يشير منخفض والتي كانت تستخدم الفيروسية NCR للانضمام إلى مناطق الترميز. يظهر المنطقة الترميز لمراسل (REP) باللون الأرجواني.
و transfected الشكل 2. Monocistronic minigenome الفحص. الخلايا مع البلازميدات التعبير عن فيروس إيبولا البروتينات قفيصة منواة (NP، VP35، VP30، L)، وهو minigenome monocistronic (ملغ) والبلمرة T7. وكتب على minigenome في البداية من قبل البلمرة T7 (أ) إلى RNA minigenome unencapsidated في نفس الاتجاه كما الجينوم الفيروسي (vRNA)، والتي يتم بعد ذلك encapsidated بواسطة NP (ب). encapsidated هذا يتم نسخ vRNA عبر RNA minigenome مكملة (كرنا) intermediate (ج)، ثم كتب إلى من mRNAs مراسل (د) التي تم ترجمتها إلى البروتين مراسل (ه).
الرقم 3. trVLP مقايسة مع minigenome monocistronic. و transfected الخلايا مع البلازميدات التعبير عن مكونات minigenome فحص (الإيبولا البروتينات قفيصة منواة فيروس NP، VP35، VP30، L، وهو minigenome monocistronic والبلمرة T7) وكذلك VP40، GP 1 و 2 و VP24. هذا يؤدي إلى تشكيل trVLPs التي تتضمن nucleocapsids التي تحتوي على minigenome (و). هذه trVLPs يمكن أن تصيب الخلايا المستهدفة (ز)، والتي pretransfected إما مع البلازميدات التعبير عن NP، VP35، VP30، ولام (أعلى)، مما أدى إلى تكرار والنسخ الثانوي (د) مما يؤدي إلى التعبير مراسل (ه)، أو ساذجة الخلايا المستهدفة (القاع)، مما أدى إلى النسخ الأولية من دقيقةigenomes (ح)، مما أدى أيضا إلى التعبير مراسل (ه).
و transfected الشكل 4. trVLP مقايسة مع minigenome tetracistronic. الخلايا مع البلازميدات التعبير عن فيروس إيبولا البروتينات قفيصة منواة (NP، VP35، VP30، L)، وهو minigenome tetracistronic (ملغ) والبلمرة T7. النسخ الأولي (أ)، encapsidation (ب)، وتكرار الجينوم (ج) والنسخ (د) وكذلك الترجمة (ه) كما يحدث في minigenome فحص monocistronic. ومع ذلك، بالإضافة إلى مراسل مرنا، من mRNAs للVP40، وكتب GP 1،2 و VP24 أيضا من minigenome tetracistronic، مما أدى إلى تشكيل trVLPs (و). هذه trVLPs تصيب الخلايا المستهدفة التي تم pretransfected مع البلازميدات التعبير عن البروتينات قفيصة منواة NP، VP35، VP30 وL، فضلا عن فيروس إيبولا الخلويعامل مرفق تيم-1، مما أدى إلى تكرار الجينوم والنسخ، وإنتاج trVLPs التي يمكن استخدامها لتصيب الخلايا المستهدفة جديدة.
الشكل 5. توقيت مقايسة trVLP tetracistronic لمدة 3 مقاطع متتالية. الأيام لبذر خلايا (ق)، بنقل العدوى إلى خلايا (ر)، وإصابة الخلايا (ط)، وتغير المتوسط (ج) وحصاد الخلايا وtrVLPs (ح) هي وأشار لمدة ثلاث فقرات متتالية (المشار إليها السهام).
وقد تم تنفيذ الشكل 6. مستويات النموذجية النشاط مراسل لوحظ في trVLP فحص tetracistronic وtrVLP فحص tetracistronic أكثر من 5 فقرات بعد protocرأ المبينة في هذه المخطوطة. كعنصر تحكم السلبية تم حذف التعبير بلازميد ترميز L (لام) من ترنسفكأيشن من الخلايا المنتجة P0. الخلايا المستهدفة في الممرات P1 إلى P5 و transfected مع البلازميدات التعبير لجميع البروتينات قفيصة منواة، بما في ذلك L. يشار إلى ضوضاء خلفية luminometer كخط متقطع. وتظهر الوسائل والانحرافات المعيارية من 4 مكررات البيولوجية من 3 تجارب مستقلة.
الرقم 7. تقييم تأثير مختلف العوامل الفيروسية والخلوية على دورة الحياة الفيروسية باستخدام trVLPs tetracistronic. (A) تيم-1 كعامل المرفق. الخلايا المستهدفة التي تم pretransfected مع البلازميدات التعبير ترميز للبروتينات قفيصة منواة ومع أو بدون ترميز البلازميد لتيم-1 (الموصوفة في 15) كانت مصابة تيتtrVLPs racistronic. تم تحديد 72 ساعة العدوى آخر نشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة P1. وتظهر الوسائل والانحرافات المعيارية من 4 مكررات البيولوجية من 4 تجارب مستقلة. (B) تأثير رني ضربة قاضية من L على تكرار الجينوم والنسخ. الخلايا المستهدفة التي تم pretransfected مع البلازميدات التعبير عن مكونات قفيصة منواة، تيم-1 و miRNAs الموجهة ضد L (مكافحة L) أو البروتين لا علاقة لها (مكافحة GFP) (الموصوفة في 15) كانت مصابة trVLPs tetracistronic. تم تحديد 72 ساعة العدوى آخر نشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة P1. وتظهر الوسائل والانحرافات المعيارية من 5 مكررات البيولوجية من تجارب مستقلة 2. (C) تأثير الطفرات في minigenome على trVLP العدوى. أجري فحص trVLP tetracistronic باستخدام إما من النوع البري minigenome (4cis-WT) أو في minigenome التي أدخلت 3 كودونات توقف فورا بعد كودون بداية VP24، معربا عن إلغاء سو هذا البروتين فقط ولكن إدخال تغيرات طفيفة إلى minigenome في ما يخص طول وتكوين الحمض النووي، والهياكل الثانوية الخ النشاط مراسل في P0، P1 و P2 تم قياس 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن / العدوى. وتظهر الوسائل والانحرافات المعيارية من 3 مكررات البيولوجية من 3 تجارب مستقلة.
| خلايا المنتج (P0) | الخلايا المستهدفة (P1 و أعلى) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1،000 | 1،000 | |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-Tim1 | - | 250 |
الجدول 1. DNA يرقى لترنسفكأيشن. يظهر مبلغ كل بلازميد اللازمة لترنسفكأيشن من خلايا منتج والهدف في نانوغرام لكل بئر من لوحة 6 جيدا. يتم وصف كل البلازميدات في واط وآخرون 15.
Discussion
الفحص trVLP tetracistronic وصفها في هذه المخطوطة يسمح نمذجة دورة حياة فيروس إيبولا على مدى عدة دورات المعدية. الأهم من ذلك أن trVLPs المنتجة في هذا النظام لا تحتوي على المعلومات الوراثية للبروتينات قفيصة منواة NP، VP35، VP30، ولام، والتي تشكل معا ما يقرب من 60٪ من جينوم فيروس إيبولا والضرورية لتكاثر الفيروس. بدلا من ذلك، هذه البروتينات يجب أن تكون المقدمة في الخلايا المستهدفة في العابرة من البلازميدات التعبير، وأي عدوى الخلايا لا تعبر عن كل 4 من تلك البروتينات هو فاشل. الأهم من ذلك، لا يوجد دليل من إعادة التركيب الجيني للfiloviruses، وليس هناك أي مناطق متماثلة المشتركة بين minigenome tetracistronic والبلازميدات التعبير عن البروتينات قفيصة منواة. وبالتالي، ليس هناك أي دليل لا عمليا ولا أي أساس النظرية التي يمكن أن توفر إمكانية لتوليد كامل طول الجينوم فيروس الايبولا التي يمكن بعد ذلك أن ينتج فيإنتاج فيروسات الإيبولا المعدية، مما يجعل هذا النظام آمن للاستخدام في ظروف BSL2.
هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في trVLP فحص tetracistronic أن تتأثر الظروف التجريبية، أي إنتاج trVLPs، وإصابة الخلايا المستهدفة مع هذه trVLPs. إنتاج trVLPs يعتمد على مستويات عالية من تكرار minigenome والنسخ، وهذا بدوره يعتمد على ترنسفكأيشن كفاءة عالية. فعالية ترنسفكأيشن يمكن تقييمها بسهولة من قبل بما في ذلك السيطرة -l، حيث يتم تبادل البلازميد عن التعبير L لترميز EGFP التعبير البلازميد. معدلات ترنسفكأيشن في ظل هذه الظروف يجب أن يتجاوز 50٪ عن طريق التفتيش مع المجهر مضان 24 ساعة ترنسفكأيشن آخر. علاوة على ذلك، يجب أن تكون خلايا خالية من الميكوبلازما، لأن في تجربتنا التلوث الميكوبلازما يضعف بشكل كبير minigenome تكرار والنسخ (بيانات غير منشورة). وترجع الزيادة إلى ارتفاع 293 م transfectabilityLLS هي خط خلية من خيار لفحوصات trVLP. ومع ذلك، وهذه الخلايا هي عرضة سيئة نسبيا (وإن لم يكن الانكسار تماما) للإصابة بفيروس إيبولا 16. التعبير عن عامل مرفق مثل تيم (1) يعزز إصابة 293 الخلايا مع trVLPs حوالي 100 أضعاف، وأمر حاسم لنجاح هذا النظام على العديد من المقاطع.
بينما trVLPs tetracistronic لا تتكاثر ذاتيا من تلقاء نفسها، فهي تتكاثر ذاتيا في الخلايا التي تعبر عن البروتينات قفيصة منواة. على هذا النحو، والاحتياطات يجب أن تتم لتجنب التلوث المتبادلة بين الآبار التي تحتوي على trVLPs مختلفة (على سبيل المثال، مع طفرات مختلفة في minigenome). من الناحية الفنية أكثر، وذلك بسبب الفارق الكبير بين الإشارات الإيجابية والسلبية في هذا الاختبار (حوالي 4 سجلات)، عبر الحديث بين عينات عند قياس النشاط وسيفيراز يمكن أن تكون المسألة؛ ومع ذلك، يمكن تجنبها بسهولة من خلال ترك جيدا فارغ واحد بين كل عينة في96 لوحة جيدا المستخدمة لقياس النشاط luciferase المراسل.
هناك العديد من التطبيقات الممكنة لtrVLPs tetracistronic. من الواضح، فهي مناسبة تماما لدراسة دخول الجسيمات filovirus، منذ trVLPs معدية لديهم بنية تشبه موضوع نموذجي من filoviruses المعدية 14، وتحتوي على نفس المكونات الفيروسية والجسيمات filovirus. الأهم من ذلك، أنها لا تحتوي على مكونات الفيروسات الأخرى، كما هو الحال عند استخدام virions pseudotyped أو جزيئات الفيروسات مثل، مثل جزيئات الارتجاعي تحمل GP 1،2، أو المؤتلف الفيروسات، مثل فيروس التهاب الفم الحويصلي المؤتلف التعبير عن 1،2 GP . شرط العوامل المرفق عند استخدام 293 الخلايا كما الخلايا المستهدفة في هذا النظام يمكن استغلالها للكشف عن والتحقيق في دور هذه العوامل المرفق، بينما الأدوار من العوامل الخلوية الأخرى، مثل تلك المتضمنة في النسخ المتماثل الجينوم والنسخ وكذلك التشكل وبرعمدينغ، يمكن التحقيق باستخدام تكنولوجيا رني. ويمكن أيضا تأثير الطفرات في البروتينات الفيروسية على دورة حياة الفيروس أن تدرس، على الرغم من أن على المرء أن نأخذ في الاعتبار أنه في حين VP40، GP 1،2، ويتم التعبير عن VP24 بعد النسخ الفيروسي، ويتحقق التعبير عن البروتينات الفيروسية الأخرى من التعبير البلازميدات، حتى أن الآثار بسبب overexpression من هذه البروتينات يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. أيضا، يجب الحرص على أن الطفرات في minigenome لا يغير كثيرا من طول minigenome، لأن النشاط مراسل يتأثر مباشرة من قبل minigenome طول 15. أخيرا، منذ minigenomes tetracistronic هي نظائرها الجينوم الفيروسية التي تحمل الجينات الفيروسية، ويتم نسخ من مجمع البوليميراز الفيروسي، فإنه ينبغي أيضا أن يكون من الممكن دراسة تطور هذه الجينات في استجابة إلى حدوث طفرات في ظل ظروف BSL2. وهكذا، في حين لا تزال تحتاج إلى مزيد من الدراسات في هذا الاتجاه، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن، على سبيل المثال، ليعرض دون المستوى الأمثلالطفرات في الجينات داخل minigenome ثم trVLPs مرور حتى ظهور الطفرات مجانية.
واحد الحد من الفحص trVLP tetracistronic الذي يجب أن يوضع في الاعتبار هو حقيقة أنه في حين أن معظم نماذج دورة حياة الفيروس، ليست على غرار النسخ الأساسي في الخلايا المستهدفة من قبل هذا النظام، حيث الخلايا المستهدفة لها للتعبير عن البروتينات قفيصة منواة في العابرة من أجل أن trVLPs لتكرار. إذا النسخ الأولية لابد من تقييمها، فمن الممكن استخدام الخلايا المستهدفة ساذجة 10؛ ومع ذلك، في هذه الحالة لا تكرار الجينوم يحدث في الخلايا المستهدفة، ويتم إنتاج أي trVLPs معدية أخرى، إجهاض العدوى. هذا هو المشكلة الرئيسية التي لا يمكن التغلب عليها دون جعل trVLPs تماما تتكاثر ذاتيا، عن طريق تضمين جينات البروتينات قفيصة منواة في minigenome، التي من شأنها أن الواقع تحويلها إلى الفيروسات المعدية إيبولا المؤتلف. في الواقع، Ebolمعربا عن فيروسات تم إنشاء وسيفيراز أو صحفيين آخرين، ويمكن استخدامها لتقييم ودراسة تكرار الجينوم والنسخ 17،18. ومع ذلك، يقتصر استخدامها إلى مختبرات BSL4. أيضا، لا بد من أن يوضع في الاعتبار في حين VP40، GP 1،2، وVP24 يتم التعبير من الجينوم الفيروسي التناظرية، وضعهم في minigenome (2 الثانية، الثالثة 3 و 4 تشرين حدة النسخي) ليست مطابقة ل موقفهم في الجينوم الفيروسي (3 الثالثة، ال 4، و 6 عشر وحدة النسخي)، والتي يمكن أن تؤثر على مستويات التعبير المطلقة، وكذلك مستويات التعبير النسبية بالنسبة لبعضها البعض.
عموما، يمثل trVLP فحص tetracistronic نظام النمذجة دورة حياة أشمل للفيروسات الإيبولا المتاحة حتى الآن، ويسمح للنمذجة تكرار الجينوم والنسخ، والجسيمات التشكل والناشئين، وكذلك التعلق وENمحاولة في الخلايا المستهدفة على مدى دورات متعددة المعدية. على هذا النحو، لديها إمكانات هائلة للاستخدام في التحقيق في البيولوجيا من الفيروسات فيروس إيبولا في ظل ظروف BSL2.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
الكتاب ممتنون جدا لبوب فيشر (LV، DIR، NIAID، المعاهد الوطنية للصحة)، الذي قام بدور الراوي، وكذلك أوستن أثمان (RTB، DIR، NIAID، NIH) وميغان مورغان (DOHS، ORS، OD، NIH) ل مساعدتهم في صنع الفيلم يرافق هذه المخطوطة. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر أليسون Groseth (LV، DIR، NIAID، NIH) لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
