Summary
עבודה עם וירוסי אבולה זיהומיות מוגבלת לרמת בטיחות הביולוגית 4 מעבדות. שכפול ושעתוק וירוס-מוסמך כמו חלקיקים המכיל minigenome Tetracistronic (trVLPs) מייצג מערכת דוגמנות מחזור חיים המאפשרת לנו לבנות מודל בבטחה מחזורי זיהומיות מרובים תחת רמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים, להסתמך באופן בלעדי על רכיבי נגיף האבולה.
Abstract
וירוסי אבולה לגרום חום המורגי חמור בבני אדם ופרימטים שאינם בני אדם, עם הרוג שיעורי מקרה גבוהים ככל 90%. אין חיסונים שאושרו או טיפולים ספציפיים למחלה הנגרמת על ידי הווירוסים האלה, ולעבוד עם וירוסי אבולה זיהומיות מוגבלת לרמת בטיחות הביולוגית 4 מעבדות, המגבילים את המחקר בוירוסים אלה באופן משמעותי. מערכות מחזור חיים של דוגמנות מודל מחזור החיים של הנגיף ברמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים; עם זאת, עד לאחרונה מערכות כאלה היו מוגבלים לשני היבטים פרטניים של מחזור החיים של הנגיף, או מחזור זיהומיות יחיד. minigenomes Tetracistronic, אשר מורכב של אזורי וירוס האבולה ללא קידוד, גן כתב, ושלושה גני וירוס האבולה מעורבים בהמורפוגנזה, ניצנים, וכניסה (VP40, GP 1,2, וVP24), ניתן להשתמש בם כדי לייצר שכפול ושעתוק חלקיקי -competent כמו וירוס (trVLPs) המכילים minigenomes אלה. trVLPs אלה ברציפות יכולה להדביק תאים המבטאים את אבולהחלבוני נגיף אחראים לשכפול הגנום ושעתוק, ומאפשר לנו מודל בבטחה מחזורי זיהומיות מרובים תחת רמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים. חשוב לציין, המרכיבים הנגיפיים של זה מערכות נגזרים אך ורק מוירוס האבולה, ולא מוירוסים אחרים (כמו, למשל, במקרה של מערכות באמצעות וירוסי Pseudotyped), וVP40, GP 1,2 וVP24 אינם ביטוי יתר במערכת זו , מה שהופך אותו אידיאלי ללימוד המורפוגנזה, ניצנים וכניסה, אם כי בהיבטים אחרים של מחזור החיים של הנגיף כגון שכפול הגנום ושעתוק יכולים גם להיות מודל עם מערכת זו. לכן, assay trVLP tetracistronic מייצג את מערכת המודלים מחזור חיים המקיפה ביותר זמינה עבור וירוסי אבולה, ויש לו פוטנציאל עצום לשימוש בחקירת הביולוגיה של וירוסי אבולה בעתיד. כאן, אנו מספקים מידע מפורט על השימוש במערכת זו, כמו גם על תוצאות צפויות.
Introduction
וירוסי האבולה הם הסוכן סיבתי של קדחת מדממת חמורה בבני אדם ופרימטים שאינם בני אדם עם שיעורי תמותה של עד 90% בהתפרצויות אנושיות 1. אמנם יש כבר התקדמות משמעותית בשנים האחרונות בפיתוח חיסונים, כמו גם טיפולים ספציפיים (בדיקה ב 2,3), אלה אינם מאושרים לשימוש בבני אדם. יש לי חלקיקי נגיף האבולה מראה אופייני דמוי חוט באורך של כ 1 מיקרומטר וקוטר של 96 עד 98 4 ננומטר. צורות nucleocapsid הליבה של החלקיקים הנגיפיים והוא מורכבת מ1) הגנום שאינו מפולח חד גדילים שלילי תחושת RNA, המקודד את הגנים 7 ebolavirus (, 2) nucleoprotein NP, שencapsidates הגנום איור 1), 3 ) המורכב הנגיפי פולימראז בהיקף של L פולימראז וVP35 cofactor, ו4) VP30 activator תעתיק. בנוסף, זה לאחרונה הראה כי VP24 החלבון קשור גם nucleocapsidשל 4. Nucleocapsid מוקף בחלל המטריצה שבה חלבון מטריקס VP40, האחראית על המורפוגנזה וניצנים של virions, ממוקם. חלקיקי נגיף עטופים נוספים, ומשובץ במעטפה שהוא החלבון היחיד משטח GP 1,2, האחראית על קובץ מצורף virion וכניסה.
עבודה עם וירוסי אבולה זיהומיות חייבת להתבצע במעבדה בלימה מקסימלי ברמת בטיחות ביולוגית (מנהלת הליגה) 4 תנאים, המגבילה את העבודה הזאת לכמה מתקנים ברחבי העולם. על מנת ללמוד את הביולוגיה של וירוסים אלה או לפתח תרופות חדשניות בתנאי BSL2, חוקרים מסתמכים גם על ביטוי יתר של חלבוני רקומביננטי וירוס האבולה, או במערכות דוגמנות מחזור חיים, אשר שניהם יכולים להיות עבדו עם בהעדר וירוס האבולה זיהומיות. ביטוי רקומביננטי של חלבוני נגיף האבולה מושגת גם מפלסמידים ביטוי או וקטורים ויראליים. מקרה מיוחד של אסטרטגיה זו הואדור של virions או חלקיקים כמו וירוס המבוסס על וירוסים אחרים מאשר וירוסי אבולה (הנפוץ ביותר רטרווירוסים או stomatitis לפוחי וירוס) בנוכחות recombinantly הביע GP 1,2, שהוביל לדור של חלקיקי Pseudotyped, אשר יכול לשמש כדי לחקור תהליך כניסה של filoviruses ומסך למעכבי כניסה 5. לחלופין, וירוסי רקומביננטי (למשל, וירוס stomatitis שלפוחי) המקודדים את נגיף האבולה GP 1,2 במקום גליקופרוטאין שלהם יכולים להיות שנוצרו ומשמשים ללמוד כניסת וירוסים תחת רמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים 6.
מערכות דוגמנות מחזור החיים הן צורות של מערכות גנטיקה הפוכה המציגות את השימוש באנלוגים יקוצצו הגנום נגיף האבולה (minigenomes), אשר בתחילה מיוצרים מcDNA ולאחר מכן משוכפלת ומשועתקת על ידי חלבוני נגיף האבולה סיפקו בטראנס. מערכת minigenome הראשונה לוירוס האבולה פותחה לפני יותר מ -15 שנים 7, ומאז נעשה שימוש כדי ללמוד שכפול הגנום נגיף האבולה ושעתוק (הנסקרת ב 8,9). במערכת זו minigenome monocistronic בהיקף של גן כתב אחד מוקף אזורי קידוד שאינו המסוף של גנום נגיף האבולה (שנקרא מנהיג וקרוון) (איור 1) בא לידי ביטוי בתאי יונקים (בדרך כלל על ידי שעתוק באמצעות RNA פולימראז T7) יחד עם החלבונים הנגיפיים L, VP35, VP30 וNP. Minigenome הוא encapsidated ידי NP, ולאחר מכן משוכפל ומשועתק על ידי חלבוני nucleocapsid האחרים באמצעות אותות cis-משחק מקומי במנהיג והקרוון, שמוביל לפעילות כתב שמשקף שני היבטים של מחזור החיים של הנגיף (איור 2) אלה.
על מנת לבנות מודל צעדים נוספים של מחזור החיים, השעתוק הנגיפי ושכפול-מוסמך חלקיק כמו וירוס-מערכות (trVLP) פותחו, המבוססים על מערכות minigenome קלאסיות, אבל כולליםביטוי dditional של החלבונים הנגיפיים האחרים VP24, VP40 וGP 1,2 מפלסמידים ביטוי 10,11. הנוכחות של VP40 מובילה להיווצרות של trVLPs, אשר נושאת GP 1,2 על פני השטח שלהם, ולבצע nucleocapsid המכיל minigenome בחלק הפנימי. trVLPs אלה יכולים לשמש כדי להדביק תאי מטרה, שגם היה pretransfected עם פלסמידים ביטוי לL, VP35, VP30 וNP, כדי להקל על שכפול ושעתוק של minigenomes הביא לתאי היעד בתוך 11 trVLPs, או שהם תאי מטרה נאיביים (כלומר ללא הבעה מונע פלסמיד של חלבוני נגיף האבולה) 10. כתוצאה מכך פעילות כתב בתאי מטרה, המשקפת את השכפול של minigenomes בתאי מפיק, המורפוגנזה והניצנים של trVLPs, כניסתם לתאי מטרה, ו1) במקרה של תאי מטרת pretransfected גם הגנום שכפול ושעתוק המשני ( כלומר שעתוק על ידי לדרבן חלבונים נגיפייםuced בתאי מטרה) בתאי מטרה, או 2) במקרה של תאי יעד נאיביים גם שעתוק ראשוני (כלומר שעתוק על ידי חלבונים נגיפיים הביאו לתאי יעד בתוך trVLPs) (איור 3). חשוב לציין, מערכות אלה היו בשימוש רק למודל מחזור זיהומיות יחיד, ומסתמך על ביטוי יתר של כל חלבונים הנגיפיים, אשר במקרה של VP24 וVP40 הוא בעייתי במיוחד, שכן חלבונים אלה הוכחו להיות רגולטורים שליליים חזקים של שכפול הגנום ושעתוק כאשר ביטוי יתר מפלסמידים 12,13. יתר על כן, הכנות trVLP מיוצרות במערכות אלה מכילים אחוז גבוה של חלקיקים שאינם מדבקים, שהתחזו אתגרים לאנליזה ביוכימית של trVLPs זיהומיות 14.
כדי להתגבר על בעיות אלה, יש לנו לאחרונה פיתחו מערכת minigenome tetracistronic ש, בנוסף לגן כתב, מכילה גם את הגנים מקודדים לVP40, GP 1,2 וVP24 (איור 1). בדומה למערכת minigenome monocistronic הקלסית, מערכת זו מובילה לייצור של trVLPs שיכול להדביק תאי מטרה (איור 4) 15. עם זאת, בניגוד למערכת minigenome הקלסית, VP40, GP 1,2, וVP24 מיוצרים לאחר שעתוק הגנום הויראלי במקום להיות ביטוי יתר מפלסמידים. כתוצאה מכך, קינטיקה ורמות הביטוי של חלבונים אלה לחקות הרבה יותר הדוקים אלה שנמצאו במהלך מחזור החיים הנגיפיים, וכתוצאה מכך היחס של זיהומיות לtrVLPs שאינו מדבק הוא גדל על 500 פי במערכת זו 15. יתר על כן, באמצעות מערכת זו ניתן הייתה ברציפות מעבר trVLPs המכיל minigenome tetracistronic, דוגמנות מחזורי זיהומיות מרובות. ככזה, trVLPs tetracistronic כרגע מערכת דוגמנות מחזור החיים המקיפה ביותר זמינה ללמוד ביולוגיה נגיף האבולה בתנאי BSL2. כאן, אנו מספקים מידע מפורט על o השימושf מערכת זו, כמו גם על תוצאות צפויות.
Protocol
.1 פיצול של תאי הפקה להפקה ראשונית של trVLPs
- הסר בינוני וממחוברות 80-90% 293 תאים בתרבית ב75 סנטימטר 2 צלוחיות במדיום גבוה של גלוקוז השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) עם סרום 10% שור עוברי (FBS), L-גלוטמין 2 מ"מ, ו1x העט / סטרפטוקוקוס (DMEM10 ). שטוף תאי פעמיים עם 10 שנאגר מלוח פוספט מ"ל (PBS), נזהר שלא לעקור את התאים, ולהוסיף 2 מ"ל טריפסין-EDTA לתאים.
- דגירה התאים בטמפרטורת חדר עד תאים להראות עיגול משמעותי כאשר נצפו תחת מיקרוסקופ (כ 30 שניות). לסלק תאים על ידי הקשה בקבוק, ולהוסיף 8 מ"ל DMEM10. ביסודיות resuspend התאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עד שהשעית תא בודדת הוא ציין כאשר צפו מתחת למיקרוסקופ.
- ספירת התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי. לדלל תאים ל2 x 10 5 תאים לכל מ"ל בDMEM10. פיפטה 2 מ"ל של השעיה תא לכל גם ל6 גם צלחות (4 x 105 תאים לכל טוב).
- דגירה הצלחות בתרבית רקמת חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
.2 Transfection של תאים מפיק עבור ייצור ראשוני של trVLPs
- 24 שעות לאחר פיצול התאים (ראה איור 5 לסקירה של עיתוי הניסוי), פלסמיד דנ"א פיפטה 15 (בסכומים ראה טבלה 1) ל2 מ"ל סטרילי cryovial באמצעות טיפים מסוננים. הוסף 100 OptiMEM μl בכל טוב לDNA. מערבולת התערובת בקצרה ובעדינות לסובב את הצינורות באמצעות microfuge. אם כמה בארות יש transfected עם פלסמידים זהים, mastermix במשך כמה בארות יכול להתבצע.
- בקצרה מערבולת הבקבוקון עם טרנזיט LT1 לפני השימוש. הוספת 7.5 μl Transit LT1 לכל גם לDNA המדולל. בעדינות מערבולת התערובת, נזהרת שלא לאסוף נוזל במכסה של cryovial, ודגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- בעדינות מערבב את transfectionמורכב על ידי pipetting למעלה ולמטה. הוספה של מתחמי transfection 100 μl dropwise היטב כל אחד. רוק הצלחת קדימה / אחורה ומצד אל צד כדי לפזר את מתחמי transfection. אל מערבולת הצלחת כמו זה תגרום אחיד הפצה של מתחמי transfection.
- להחזיר את התאים לחממה.
- לאחר 24 שעות, להסיר את supernatant מהתאים. להוסיף DMEM 4 מ"ל עם 5% FBS, L-גלוטמין 2 מ"מ, 1x העט / סטרפטוקוקוס (DMEM5) לתאים. צעד זה יכול להיעשות לתקופה של עד 3 בארות בכל פעם ללא ייבוש של הבארות, בהנחת הבארות להכיל דגימות זהות (אחרות, בשל אופי הגברה העצמית של trVLPs במערכת זו, זיהום צולב יכול להיות בעיה ו צעד זה צריך להיעשות גם אחד בכל פעם).
- להחזיר את התאים לחממה.
.3 הכנת תאי יעד
- פיצול 293 תאים כאמור בסעיף 1, זריעת 4 x 10 5 תאים ב2 מ"ל DMEM10 לכל טוב שלצלחת 6 היטב.
- 24 שעות לאחר הפיצול של תאי המטרה ו24 שעות לפני הזיהום, תאי מטרת transfect כפי שתואר בסעיף 2 באמצעות DNA מסתכמים בטבלה 1, ו4.5 μl Transit LT1 לכל טוב.
.4 זיהום של תאי יעד וקציר של תאי הפקה
- העבר את supernatants מתאי המפיק 15 צינורות מ"ל. להסיר ולסלק כל supernatant שנותר בצינור ואקום. הוסף 250 μl חיץ תמוגה Glo לתאים.
- supernatant צנטריפוגה במשך 5 דקות בטמפרטורת XG וחדר 800 כדי לנקות את דוגמאות של פסולת הסלולר.
- הסר את supernatant מכן אחד מתאי המטרה. בזהירות להוסיף 3 מ"ל של supernatant תא המפיק פינה למקד תאים באמצעות מהירות פיפטה האיטית ביותר. הימנע pipetting ישירות על התאים על מנת למנוע שיבוש monolayer התא. צעד זה צריך להיעשות גם אחד בכל פעם.
- כאשר כל הדגימות היו טרנסמועדף עליכם, להחזיר את תאי המטרה לחממה כדי לאפשר שקיעה של trVLPs וזיהום של תאי מטרה.
- לאחר 15 דקות של דגירה בטמפרטורת חדר במאגר תמוגה Glo, resuspend תאי המפיק במאגר תמוגה באמצעות micropipette מוגדר 150 μl, ולהעביר את הדגימה לתוך 2 מ"ל cryovial. בשלב זה, אפשר להקפיא lysates ב -80 מעלות צלזיוס, או ישירות נמדד כמפורט בסעיף 6.
- 24 שעות לאחר הדבקה, להסיר את supernatant מתאי המטרה. הוסף 4 מ"ל לDMEM5 גם לתאים. צעד זה יכול להיעשות לתקופה של עד שלוש בארות בכל פעם, אם הבארות להכיל דגימות זהות (אחרת, בשל אופי הגברה העצמית של trVLPs במערכת זו, זיהום צולב יכול להיות בעיה, וצעד זה צריך להיות עשה גם אחד בכל פעם).
.5 קציר של תאי יעד לזיהום מחזור אחד
- אם רק מחזור זיהומיות יחיד יש להעריך, ב72 שעות לאחר t להסיר זיהוםהוא supernatant מתאי המטרה באמצעות צינור ואקום.
- קציר התאים ב250 μl חיץ תמוגה Glo כאמור בסעיף 4 לתאי יצרן.
.6 תאים וPassaging הרציף של trVLPs הקציר של היעד
- אם trVLPs יש passaged ברציפות, להכין סט חדש של תאי המטרה כאמור בסעיף 3, כך שהם מוכנים לזיהום 72 שעות לאחר ההדבקה של הסט הראשון של תאי מטרה (ראה איור 5).
- להדביק הקבוצה החדשה של תאי המטרה כאמור בסעיף 4 (באמצעות הסט הראשון של תאי מטרה במקום של תאי היצרן).
- חזור על שלבים אלה בכל שעה 72.
.7 ניתוח של פעילות Reporter
- אם lysates התא הוקפא, להפשיר אותם בטמפרטורת חדר. ודא שדגימות הגיעו טמפרטורת חדר לפני המדידה.
- להפשיר את הסכום הנדרש (40 μl לדגימה) של חיץ assay Renilla Glo (i קפואה באופן אידיאליaliquots n) בטמפרטורת חדר. ודא שהחיץ הגיע טמפרטורת חדר לפני המדידה.
- הוספת 1/100 נפח ה של מצע Renilla Glo למאגר assay Renilla Glo להשיג מגיב Renilla Glo, ומערבבים על ידי vortexing. פיפטה 40 μl של מגיב Renilla Glo לתוך צלחת 96 היטב לבנה.
- הוסף 40 μl של מדגם למגיב Renilla-Glo. חכה 10 דקות, ולאחר מכן למדוד את הדגימות בluminometer באמצעות זמן אינטגרציה של 1 שניות.
Representative Results
Transfection של 293 תאי מפיק עם פלסמידים ביטוי קידוד חלבוני nucleocapsid וירוס האבולה NP, VP35, VP30, וL, minigenome tetracistronic ותוצאות פולימראז T7 האבזר בminigenome שכפול ושעתוק ופעילות עיתונאית שניתן לזהות בקלות ב72 שעה (איור 6 ). חשוב לציין, פעילות הכתב שנצפתה (10 5.6 יחידות יחסי הארה (RLU)) עולה על זו של ביקורת שלילית שבו L קידוד פלסמיד הביטוי הושמט מtransfection (10 3 RLU) על ידי יותר מ 2 יומנים. רמת פעילות הנמוכה נצפתה גם בהעדרו של L היא ככל הנראה בשל אמרגן נסתר בפלסמיד minigenome. תאי יעד נגועים בtrVLPs מsupernatant של תאי מפיק בפועל להראות מעט רמות גבוהות של פעילות עיתונאית בהשוואה לתאי מפיק, וערכים להגיע בין 7 10 6 ו10 RLUs, בהתאם למעבר. בניגוד לכך, wתרנגולת supernatant של תאי מפיק שליטת ס הוא passaged על תאי יעד (המבטא את כל חלבון nucleocapsid, כולל L), פעילות עיתונאית אינה עולה על רעש הרקע של luminometer (כ -10 2 RLU).
Assay trVLP tetracistronic יכול לשמש כדי לחקור את מחזור החיים של נגיפי אבולה. לדוגמא, זיהום של 293 תאים עם trVLPs תלוי בנוכחותם של גורמי קובץ מצורף כגון טים-1 16, שבה יש ליסופק בטראנס בתאים אלה. כתוצאה מכך, בassay trVLP tetracistronic ירידה בפעילות כתב בתאי יעד של כ פי 100 הוא ציינה בהעדר טים-1 (איור 7 א). תפקידם של חלבונים ספציפיים (נגיפיים או סלולריים) בכל מחזור החיים של הנגיף גם ניתן להעריך באמצעות טכנולוגית RNAi יחד עם גישה זו. כדוגמא, RNAi בתיווך למטה ויסות של תוצאות L בירידה בפעילות עיתונאית של כ פי 100, המשקף את תפקידה המרכזי של L בשכפול ושעתוק (איור 7) 7. יתר על כן, ניתן לתפעל את minigenome להעריך את ההשפעה של מוטציות על מחזור החיים של הנגיף ישירות. כדוגמא, כאשר VP24-ביטוי מminigenome הוא בוטל על ידי החדרת 3 קודונים תחנה מייד במורד הזרם של קודון ההתחלה, הפעילות עיתונאית בתאי מפיק לא השתנתה באופן דרמטי; עם זאת, פעילות עיתונאית בתאי מטרה היא מופחתת על ידי על פי 20 לאחר מעבר אחד, ו400 פי לאחר שני קטעים, המצביעה על תפקידו של VP24 בייצור של trVLPs זיהומיות (איור 7 ג) 15.
מבנה איור 1 של הגנום וירוס האבולה, כמו גם minigenomes monocistronic וtetracistronic. Coding אזורים לחלבון נגיף האבולה מוצג כאדום (NP,VP35, VP30, וL), צהוב (VP40 וVP24) או כחול (תיבות GP 1,2). אזורים ללא קידוד (NCRs) מוצגים בירוק, עם אזורי המנהיג והקרוון שצוינו. תחתי מציין איזה NCR הנגיפי שימש להצטרפותו לאזורי הקידוד. אזור הקידוד לכתב (נציג) מוצג בסגול.
תאי איור 2 assay minigenome Monocistronic. הם transfected עם פלסמידים ביטוי לחלבוני nucleocapsid נגיף האבולה (NP, VP35, VP30, L), minigenome monocistronic (מ"ג) ופולימראז T7. Minigenome תחילה עיבד ידי פולימראז T7 (א) לRNA minigenome unencapsidated באותו הכיוון כמו הגנום הנגיפי (vRNA), אשר encapsidated לאחר מכן על ידי NP (ב). Interm זה encapsidated vRNA משוכפל באמצעות RNA minigenome המשלים (קרנה)ediate (ג), ולאחר מכן עיבד לתוך mRNAs הכתב (ד) שמתורגמים לחלבון כתב (ה).
assay trVLP איור 3 עם minigenome monocistronic. התאים transfected עם פלסמידים ביטוי לרכיבי assay minigenome (חלבוני אבולה nucleocapsid וירוס NP, VP35, VP30, L, minigenome monocistronic ופולימראז T7), כמו גם VP40, GP 1 , 2 וVP24. זה מוביל להיווצרות של trVLPs המשלבים nucleocapsids המכיל minigenome (ו). trVLPs אלה אז יכול להדביק תאי מטרה (ז), הpretransfected או עם פלסמידים ביטוי לNP, VP35, VP30, וL (למעלה), וכתוצאה מכך שכפול ושעתוק המשני (ד) שמובילה לביטוי עיתונאי (ה), או נאיבי תאי מטרה (למטה), וכתוצאה מכך השעתוק העיקרי של דקותigenomes (h), גם מוביל לביטוי עיתונאי (ה).
תאי איור assay trVLP .4 עם minigenome tetracistronic. הם transfected עם פלסמידים ביטוי לחלבוני nucleocapsid נגיף האבולה (NP, VP35, VP30, L), minigenome tetracistronic (מ"ג) ופולימראז T7. שעתוק ראשוני (א), encapsidation (ב), שכפול הגנום (ג) ושעתוק (ד), כמו גם תרגום (ה) להתרחש כבassay minigenome monocistronic. עם זאת, בנוסף לmRNA כתב, mRNAs לVP40, GP 1,2 וVP24 גם עיבד מminigenome tetracistronic, וכתוצאה מכך ההיווצרות של trVLPs (ו). trVLPs אלה להדביק תאי מטרה, כי כבר pretransfected עם פלסמידים ביטוי לחלבוני nucleocapsid NP, VP35, VP30 וL, כמו גם את נגיף האבולה הסלולריגורם מצורף טים-1, וכתוצאה מכך שכפול הגנום ושעתוק, וייצור של trVLPs שיכול לשמש כדי להדביק תאי מטרה טריים.
תזמון איור 5 של assay trVLP tetracistronic ל3 קטעים רצופים. ימים לזריעת תאים (ים), transfecting תאים (t), מדביק את תאים (i), שינוי בינוני (ג) וקציר של (h) תאים וtrVLPs הם הצביע עבור שלושה קטעים רצופים (מסומן בחצים).
איור 6 רמות אופייניות של פעילות עיתונאית שנצפתה בassay trVLP tetracistronic. Assay trVLP tetracistronic בוצעו ב -5 קטעים הבאים protocהתווה ol בכתב היד הזה. כביקורת שלילית L קידוד פלסמיד הביטוי הושמט (ס) מtransfection של תאי מפיק P0. תאי מטרה במעברי P1 לp5 היה transfected עם פלסמידים ביטוי לכל חלבוני nucleocapsid, כולל ל 'רעשי הרקע של luminometer מצויינים כקו מקווקו. ממוצעים וסטיות תקן של 4 משכפל ביולוגי מ3 ניסויים בלתי תלויים הראו.
איור 7 הערכת ההשפעה של גורמים נגיפיים ותאיים שונים במחזור החיים הנגיפיים באמצעות trVLPs tetracistronic. () טים-1 כגורם מצורף. תאי יעד שpretransfected עם פלסמידים ביטוי קידוד לחלבוני nucleocapsid ועם או בלי קידוד פלסמיד לטים-1 (שתואר ב15) היו נגועים בט 'trVLPs racistronic. פעילות כתב שלאחר זיהום 72 שעות בתאי מטרת p1 נקבעה. ממוצעים וסטיות תקן של 4 משכפל ביולוגי מ4 ניסויים בלתי תלויים הראו. (ב) השפעה של מציאה RNAi של L על שכפול הגנום ושעתוק. תאי היעד שpretransfected עם פלסמידים ביטוי לרכיבי nucleocapsid, טים-1 וmiRNAs המכוונים נגד L (אנטי-L) או חלבון שאינו קשור (אנטי-GFP) (תאר ב15) היו נגוע בtrVLPs tetracistronic. פעילות כתב שלאחר זיהום 72 שעות בתאי מטרת p1 נקבעה. ממוצעים וסטיות תקן של 5 חזרות ביולוגיות מ2 ניסויים בלתי תלויים הראו. (C) השפעה של מוטציות בminigenome על infectivity trVLP. Assay trVLP tetracistronic בוצע באמצעות שני minigenome wild-type (4cis-WT) או minigenome ב ש3 קודונים תחנה הוכנסו מייד לאחר קודון תחילת VP24, ביטול o להביעf החלבון הזה, אבל מציג רק שינויים מינימאליים לminigenome לגבי אורך, הרכב חומצות גרעין, מבנים משניים וכו 'פעילות Reporter בP0, P1 ו P2 נמדד 72 שעות לאחר transfection / זיהום. ממוצעים וסטיות תקן של 3 חזרות ביולוגיות מ3 ניסויים בלתי תלויים הראו.
| תאי מפיק (P0) | תאי יעד (P1 ומעלה) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1,000 | 1,000 | |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-Tim1 | - | 250 |
הטבלה 1 DNA מסתכם לtransfection. הסכום של כל פלסמיד הנדרש לtransfection של תאי מפיק והיעד מוצג בng לכל טוב של צלחת 6 היטב. כל פלסמידים מתוארים בואט et 15 אל.
Discussion
Assay trVLP tetracistronic המתואר בכתב היד הזה מאפשר מידול של מחזור החיים של נגיף האבולה על פני מספר מחזורי זיהומיות. חשוב לציין, trVLPs הופק במערכת זו אינה מכיל מידע הגנטי לחלבונים nucleocapsid NP, VP35, VP30, וL, שיחד מרכיבים כמעט 60% מהגנום נגיף האבולה וחיוניים לשכפול נגיף. במקום זאת, חלבונים אלה צריכים להיות מסופקים בתאי המטרה בטראנס מפלסמידים ביטוי, וכל זיהום של תאים לא מבטאים את כל 4 של חלבונים אלה הוא כושל. חשוב לציין, שאין כל ראיות של רקומבינציה הגנטית לfiloviruses, ואין אזורים הומולוגיים המשותפים בין minigenome tetracistronic ופלסמידים הביטוי לחלבוני nucleocapsid. לכן, אין לא שום ראיות מעשיות ולא כל בסיס תיאורטי שיכול לספק לאפשרות של הגנום נגיף האבולה באורך מלא שהניבו שלאחר מכן עלול לגרוםהייצור של נגיפי אבולה זיהומיות, מה שהופך את מערכת זו בטוחה לשימוש בתנאי BSL2.
ישנם שני שלבים קריטיים בassay trVLP tetracistronic שמושפעים מהתנאים ניסוי, כלומר הייצור של trVLPs, והזיהום של תאי יעד עם trVLPs אלה. ייצור של trVLPs תלוי ברמות גבוהות של שכפול minigenome ושעתוק, אשר בתורו תלוי ביעילות transfection גבוהה. יעילות transfection ניתן להעריך בקלות על ידי הכללת שליטת ס, שבו פלסמיד ביטוי לL מוחלף פלסמיד ביטוי קידוד eGFP. שיעורי transfection בתנאים אלה יעלה 50% על ידי בדיקה עם ההודעה transfection 24 שעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יתר על כן, תאים צריכים להיות חופשי של mycoplasma, שכן בזיהום mycoplasma הניסיון שלנו באופן דרמטי פוגע שכפול ושעתוק (נתונים שלא פורסמו) minigenome. בשל ce הגבוה transfectability 293LLS הוא הקו הסלולרי של בחירה עבור מבחני trVLP; עם זאת, תאים אלה הם יחסית גרועים רגישים (אם כי לא שבירה לחלוטין) לזיהום בנגיף האבולה 16. ביטוי של גורם מצורף כגון טים-1 משפר את הזיהום של 293 תאים עם trVLPs על פי 100, והוא חיוני להצלחתה של מערכת זו על פני מספר קטעים.
בעוד trVLPs tetracistronic אינו משכפל את עצמו בכוחות עצמם, הם משכפלים את עוצמה בתאים המבטאים את חלבוני nucleocapsid. ככזה, אמצעי זהירות צריכה להיעשות כדי להימנע מצלב זיהומים בין בארות המכילות trVLPs שונה (לדוגמא, עם מוטציות שונות בminigenome). מבחינה טכנית יותר, בשל ההבדל הגדול בין אותות חיוביים ושליליים בassay זה (כ 4 יומנים), הצטלבות בין דגימות בעת מדידת פעילות לוציפראז יכול להיות בעיה; עם זאת, ניתן להימנע מזה בקלות על ידי השארה גם אחד ריק בין כל דגימה בצלחת 96 היטב המשמשת למדידת פעילות לוציפראז.
יש שפע של יישומים אפשריים לtrVLPs tetracistronic. ברור, הם גם מתאימים ללימוד הכניסה של חלקיקי filovirus, שכן יש לי trVLPs זיהומיות המבנה דמוי חוט האופייני filoviruses זיהומיות 14, ומכיל את אותם רכיבים נגיפיים כמו חלקיקי filovirus. חשוב לציין, שהם לא מכילים רכיבים של וירוסים אחרים, כמו במקרה בעת שימוש virions Pseudotyped או חלקיקים כמו וירוס, כמו חלקיקי רטרווירוס נושא GP 1,2, או וירוסי רקומביננטי, כגון וירוס stomatitis שלפוחי רקומביננטי להביע GP 1,2 . הדרישה לגורמי קובץ מצורף בעת שימוש 293 תאים כמו תאי יעד במערכת זו ניתן לנצל כדי מסך וללחקור את תפקידם של גורמי עיקול, ואילו התפקידים של גורמים סלולריים אחרים, כגון אלה העוסקים בשכפול הגנום ושעתוק, כמו גם המורפוגנזה וניצןדינג, ניתן לחקור באמצעות טכנולוגיית RNAi. ההשפעה של מוטציות בחלבונים נגיפיים על מחזור החיים של הנגיף גם ניתן ללמוד, אם כי אחד יש לזכור כי בעוד VP40, GP 1,2, וVP24 באים לידי ביטוי לאחר שעתוק נגיפי, ביטוי של החלבונים הנגיפיים האחרים מושגת מביטוי פלסמידים, כך שהשפעות עקב ביטוי היתר של חלבונים אלה צריכים להילקח בחשבון. כמו כן, יש להקפיד כי מוטציות בminigenome אינן משנות באופן משמעותי את אורכו של minigenome, מאז פעילות כתב מושפעת ישירות minigenome אורך 15. לבסוף, מאז minigenomes tetracistronic הם אנלוגים הגנום הויראלי שנושאים גנים נגיפיים, ומשוכפלים על ידי מורכב פולימראז הנגיפי, זה צריך להיות אפשרי גם בחקר האבולוציה של גנים אלה בתגובה למוטציות בתנאי BSL2. וכך, בעוד מחקרים נוספים עדיין נדרשים בכיוון זה, זה צריך להיות אפשרי, למשל, להציג את הכי מוצלחמוטציות בגנים בתוך trVLPs מעבר minigenome ומאז ועד מוטציות חינם לצוץ.
מגבלה אחת של assay trVLP tetracistronic שיש לזכור היא העובדה כי בזמן שהוא המודלים ביותר במחזור החיים של הנגיף, שעתוק עיקרי בתאי מטרה הוא לא דגם ידי מערכת זו, שכן תאי יעד צריכים לבטא חלבוני nucleocapsid בטראנס על מנת שtrVLPs לשכפל. אם תעתיק ראשוני יש להעריך, ניתן להשתמש בתאי יעד נאיביים 10; עם זאת, במקרה זה אין שכפול הגנום מתרחש בתאי מטרה, ולא trVLPs זיהומיות נוספת מיוצר, להפיל את הזיהום. זו בעיה העיקרית שלא ניתן להתגבר עליהן בלי טיוח trVLPs לחלוטין משכפל את עצמו, על ידי הכללת גנים לחלבוני nucleocapsid לminigenome, אשר יהפוך אותם דה פקטו לוירוסי אבולה רקומביננטי זיהומיות. למעשה, Ebolוירוסים להביע לוציפראז או כתבים אחרים שנוצרו ויכול להיות מנוצל כדי להעריך וללמוד שכפול הגנום ושעתוק 17,18; עם זאת, השימוש בם מוגבל למעבדות BSL4. כמו כן, יש בו כדי לזכור כי בעוד VP40, GP 1,2, וVP24 באים לידי ביטוי מאנלוגי הגנום נגיפי, עמדתם בminigenome (2 nd, 3 rd, ו4 th יחידת תעתיק) אינו זהה ל את עמדתם בגנום הנגיפי (3 rd, 4 th, ויחידת תעתיק 6 th), אשר יכול להשפיע על רמותיהם מוחלטות הביטוי, כמו גם רמות הביטוי היחסית שלהם עם כבוד אחד לשני.
בסך הכל, assay trVLP tetracistronic מייצג את מערכת המודלים מחזור חיים המקיפה ביותר לאיתור וירוסי אבולה זמין עד כה, ומאפשר מודלים של שכפול הגנום ושעתוק, המורפוגנזה חלקיקים וניצנים, וכן התקשרות וenלנסות לתאי מטרה על מחזורי זיהומיות מרובים. ככזה, יש לו פוטנציאל עצום לשימוש בחקירת הביולוגיה של וירוסי אבולה בתנאי BSL2.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים מאוד לבוב פישר (LV, DIR, NIAID, NIH), שפעל כקריין, כמו גם אוסטין Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) ומייגן מורגן (DOHS, ORS, OD, NIH) ל העזרה שלהם עם מה שהופך את הסרט מלווה את כתב היד הזה. יתר על כן, ברצוננו להודות לאליסון Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי תכנית מחקר ביצוע עצמי של NIH, NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
