Summary
Arbeid med smittsomme Ebola virus er begrenset til biosikkerhet nivå fire laboratorier. Tetracistronic minigenome holdig replikasjon og transkripsjon kompetente virus lignende partikler (trVLPs) representerer en livssyklus modellering system som tillater oss å trygt modellere flere smittsomme sykluser i henhold biosikkerhet nivå to forhold, stole utelukkende på Ebola-viruset komponenter.
Abstract
Ebola virus forårsaker alvorlig hemoragisk feber hos mennesker og ikke-menneskelige primater, med case-dødsfall priser så høyt som 90%. Det finnes ingen godkjente vaksiner eller spesifikke behandlinger for sykdom forårsaket av disse virusene, og arbeide med smittsomme Ebola virus er begrenset til biosikkerhet nivå fire laboratorier, betydelig begrense forskning på disse virusene. Livssyklus modellering systemer modell viruset livssyklus henhold biosikkerhet nivå to forhold; imidlertid inntil nylig slike systemer har vært begrenset til enten individuelle aspekter av viruset livssyklus, eller en enkelt infeksiøs syklus. Tetracistronic minigenomes, som består av Ebola virus-koding ikke regioner, en reporter gen, og tre Ebola-viruset gener involvert i morphogenesis, spirende, og oppføring (VP40, GP 1,2, og VP24), kan brukes til å produsere replikasjon og transkripsjon -competent viruslignende partikler (trVLPs) som inneholder disse minigenomes. Disse trVLPs kontinuerlig kan infisere celler uttrykker Ebolavirus proteiner ansvarlig for genom replikering og transkripsjon, slik at vi kan trygt modellere flere smittsomme sykluser i henhold biosikkerhet nivå to forhold. Viktigere er de virale komponenter av dette systemer utelukkende avledet fra Ebola viruset, og ikke fra andre virus (som for eksempel er tilfellet i systemer som bruker pseudotyped virus), og VP40, GP 1,2 og VP24 ikke er overuttrykt i dette systemet , noe som gjør det ideelt egnet for å studere morfogenese, spirende og inngang, selv om andre aspekter av viruset livssyklusen for eksempel genom-replikasjon og transkripsjon kan også bli modellert med dette systemet. Derfor representerer tetracistronic trVLP analysen den mest omfattende livssyklus modellering systemet tilgjengelig for Ebola virus, og har et enormt potensial for bruk i å undersøke biologi Ebola virus i fremtiden. Her vi gi detaljert informasjon om bruk av dette systemet, så vel som den forventede resultater.
Introduction
Ebola virus er den utløsende agent for en alvorlig hemoragisk feber hos mennesker og ikke-menneskelige primater med tilfelle dødsfall priser på opptil 90% i menneskelige utbrudd en. Mens det har vært en betydelig utvikling de siste årene på å utvikle vaksiner samt spesifikke behandlinger (anmeldt i 2,3), disse er ikke godkjent for bruk på mennesker. Ebola viruspartikler har en karakteristisk tråd-lignende utseende med en lengde på omtrent 1 mikrometer og en diameter på 96-98 nm 4. A nukleo danner kjernen av de virale partikler og består av 1) den ikke-segmenterte enkelt-trådet negativ-sense RNA-genom, som koder for de syv ebolavirus gener (figur 1), 2) nukleoprotein NP, som encapsidates genomet, 3 ) den virale polymerase kompleks bestående av polymerase l og dets kofaktor VP35, og 4) den transkripsjonelle aktivator VP30. I tillegg har det nylig vært vist at proteinet VP24 er også forbundet med nukleokapsids 4. Den nukleokapsid er omgitt av matrisen plass der matrisen protein VP40, som er ansvarlig for morfogenese og spirende av virioner, er plassert. Viruspartikler er videre innhyllet, og innebygd i den konvolutten er den eneste overflateprotein GP 1,2, som er ansvarlig for virion vedlegg og oppføring.
Arbeid med smittsomme Ebola virus må utføres i en maksimal containment laboratorium under biosikkerhetsnivå (BSL) fire forhold, som begrenser dette arbeidet til noen få anlegg over hele verden. For å studere biologien til disse virusene eller for å utvikle nye terapeutiske midler i henhold til BSL2 betingelser, er avhengige forskere enten på overekspresjon av rekombinant Ebola virusproteiner, eller på livssyklusmodellsystemer, som begge kan bearbeides med i fravær av smittsomme Ebola virus. Rekombinant uttrykk av Ebola-viruset proteiner er enten oppnås fra ekspresjonsplasmider eller virale vektorer. Et spesialtilfelle av denne strategien ergenerering av virioner eller viruslignende partikler basert på andre virus enn Ebola virus (oftest retrovira eller vesikulært stomatitis virus) i nærvær av rekombinant uttrykte gp 1,2, som fører til genereringen av pseudotyped partikler, noe som kan brukes til å studere prosessen med filoviruses og skjermen oppføring for inntrengningsinhibitorer fem. Alternativt kan rekombinante virus (f.eks, vesikulær stomatitt virus) som koder Ebola-viruset GP 1,2 i stedet for sin egen glykoprotein genereres og brukes til å studere virus oppføring under biosikkerhetsnivå 2 forhold seks.
Lifecycle modellering systemer er former for revers genetikk systemer med bruk av avstumpede Ebola-viruset genom analoger (minigenomes), som opprinnelig produsert fra cDNA og deretter kopiert og transkribert av Ebola-viruset proteiner gitt i trans. Den første minigenome system for Ebola-viruset ble utviklet mer enn 15 år siden 7, Og har siden blitt brukt til å studere Ebola-viruset genom replikering og transkripsjon (anmeldt i 8,9). I dette systemet en monocistronic minigenome som består av en enkelt reporter-genet flankert av de terminale ikke-kodende regioner av Ebola virusgenomet (kalt leder og tilhenger) (figur 1) blir uttrykt i pattedyrceller (vanligvis ved hjelp av T7 RNA-transkripsjon-polymerase) sammen med de virusproteiner L, VP35, VP30 og NP. Den minigenome er encapsidated av NP, og deretter replikert og transkribert av de andre nukleo-proteiner ved å bruke cis-virkende signaler lokalisert i leder og tilhenger, som fører til rapportøraktivitet, som gjenspeiler disse to sider av viruset livssyklus (figur 2).
For å modellere flere trinn av viral livssyklus, transkripsjon og replikering-kompetent viruslignende partikler (trVLP) systemer har blitt utviklet, som er basert på klassiske minigenome systemer, men har den endditional uttrykk for de andre virusproteiner VP24, VP40 og GP 1,2 fra ekspresjonsplasmider 10,11. Tilstedeværelsen av VP40 fører til dannelse av trVLPs, som bærer GP 1,2 på deres overflate, og bærer en minigenome holdig nukleokapsid på innsiden. Disse trVLPs kan brukes til å infisere målceller, som enten har blitt pretransfected med ekspresjonsplasmider for L, VP35, VP30 og NP, for å legge til rette for replikasjon og transkripsjon av minigenomes bringes inn i målcellene i trVLPs 11, eller er naive målceller (f.eks uten plasmid-drevet uttrykk for Ebola-viruset proteiner) 10. Dette resulterer i rapportøraktivitet i målceller, noe som gjenspeiler replikering av minigenomes i produsentceller, morfogenese og spirende trVLPs, deres inntreden i målceller, og 1) i tilfelle av pretransfected målceller også genom replikasjon og transkripsjon sekundær ( dvs. transkripsjon av viral proteiner produced i målcellene) i målcellene, eller 2) i tilfelle av naive målceller også primære transkripsjon (dvs. transkripsjonen av virusproteiner brakt inn i målceller i trVLPs) (figur 3). Viktigere, har disse systemene bare blitt brukt til å modellere en enkelt infeksiøs syklus, og stole på overekspresjon av alle virale proteiner, som i tilfelle av VP24 VP40 og er spesielt problematisk, siden disse proteinene har vist seg å være sterke negative regulatorer av genomreplikasjon og transkripsjon når overuttrykkes fra plasmider 12,13. Videre trVLP preparater fremstilt på disse systemer inneholder en høy andel av ikke-infeksiøse partikler, noe som medfører utfordringer for biokjemisk analyse av smittsomme trVLPs 14.
For å overvinne disse problemene, har vi nylig utviklet en tetracistronic minigenome system som, i tillegg til en reporter-genet, også inneholder gener som koder for VP40, GP 1,2 ogVP24 (figur 1). I likhet med den klassiske monocistronic minigenome system, fører dette system til fremstilling av trVLPs som kan infisere målceller (figur 4) 15. Imidlertid, i motsetning til den klassiske minigenome system, VP40, GP 1,2, og VP24 produseres etter at virusgenomet transkripsjon stedet for å være overuttrykt fra plasmider. Som et resultat av de kinetikk og uttrykk nivåer av disse proteinene mye nærmere etterligne de som finnes under den virale livssyklus, og dermed forholdet mellom smittsomme til ikke-infeksiøse trVLPs økes omtrent 500-fold i dette systemet 15.. Videre, ved hjelp av dette systemet var det mulig å kontinuerlig passasje tetracistronic minigenome holdige trVLPs, modellering flere smittsomme sykluser. Som sådan, tetracistronic trVLPs er for øyeblikket den mest omfattende livssyklus modellering system tilgjengelig for å studere Ebola-viruset biologi henhold BSL2 forhold. Her gir vi detaljert informasjon om bruken of dette systemet, så vel som den forventede resultater.
Protocol
1. Splitting av Produsent Cells for initiell produksjon på trVLPs
- Fjern medium 80-90% konfluent 293-celler dyrket i 75 cm 2 kolber i høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, og 1x pen / strep (DMEM10 ). Vask cellene to ganger med 10 ml fosfat-bufret saltvann (PBS), å være forsiktig for ikke å løsne cellene, og tilsett 2 ml trypsin-EDTA til cellene.
- Inkuber cellene ved romtemperatur inntil cellene viser signifikant avrunding når observert under et mikroskop (ca. 30 sekunder). Løsne cellene ved å trykke kolbe, og legge til 8 ml DMEM10. Grundig resuspender cellene ved forsiktig pipettering opp og ned til en enkelt cellesuspensjon blir observert når sett under mikroskopet.
- Tell cellene ved hjelp av en automatisert celle-teller. Fortynn cellene til 2 x 10 5 celler per ml i DMEM10. Pipetter 2 ml cellesuspensjon per brønn i 6-brønners plater (4 x 105 celler per brønn).
- Inkuber platene i en fuktet vevskultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
2. Transfeksjon av Produsent Cells for initiell produksjon på trVLPs
- 24 timer etter splitte celler (se Figur 5 for en oversikt over eksperimentet timing), pipette plasmid DNA 15 (for beløpene se tabell 1) i en steril 2 ml cryovial bruker filtrert tips. Tilsett 100 ul OptiMEM per brønn til DNA. Vortex blandingen kort og forsiktig spinne ned rør ved hjelp av en mikro. Dersom flere brønner skal transfektert med plasmider identiske, kan en Mastermix for flere brønner gjøres.
- Kort vortex hetteglasset med Transit LT1 før bruk. Legg 7.5 mL Transit LT1 per brønn til den fortynnede DNA. Forsiktig vortex-blanding, tar seg ikke å samle væsken i lokket på cryovial, og inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Bland forsiktig transfeksjonkompleks ved å pipettere opp og ned. Tilsett 100 ul av transfeksjon komplekser tilsatt til hver brønn. Rock the plate forover / bakover og fra side til side for å fordele transfeksjonsteknologier komplekser. Ikke virvle plate da dette vil føre til ujevn spredning av transfeksjon komplekser.
- Retur cellene til inkubatoren.
- Etter 24 timer, fjern supernatanten fra celler. Tilsett 4 ml DMEM med 5% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 x pen / strep (DMEM5) til cellene. Dette trinnet kan utføres i opp til tre brønner i en tid uten tørking av brønnene, forutsatt at brønnene inneholder identiske prøver (ellers, på grunn av den selv-forsterkende arten av de trVLPs i dette systemet, kan kryss-kontaminering bli et problem, og Dette trinnet bør gjøres en brønn om gangen).
- Retur cellene til inkubatoren.
3. Utarbeidelse av målceller
- Split 293 celler som beskrevet i § 1, såing 4 x 10 5 celler i 2 ml DMEM10 per brønn av en6-brønns plate.
- 24 timer etter splitting av målcellene og 24 timer før infeksjon, transfektere målceller som beskrevet i seksjon 2 ved hjelp av DNA-mengder i tabell 1, og 4,5 pl Transit LT1 per brønn.
4. Infeksjon målcellene og høste av Produsent Cells
- Overfør Supernatantene fra produsent cellene til 15 ml rør. Fjern og kast eventuelle gjenværende supernatanten ved hjelp av en vakuumslangen. Tilsett 250 ul lyseringsbuffer Glo til cellene.
- Sentrifuger supernatant i 5 min ved 800 xg og romtemperatur å fjerne prøver av mobilnettet rusk.
- Fjern supernatanten fra en brønn av målcellene. Tilsett forsiktig 3 ml fjernet produsent celle supernatant til målceller ved hjelp av pipette langsomste hastighet. Unngå pipettering direkte på cellene for å unngå å forstyrre cellemonolaget. Dette trinnet må gjøres en brønn om gangen.
- Når alle prøvene har vært transtrukket, returnere målcellene til inkubatoren for å tillate sedimentering av trVLPs og infeksjon av målceller.
- Etter 15 min inkubasjon ved romtemperatur i Glo lysis buffer, resuspender produsentceller i lysis buffer ved hjelp av en mikropipette satt til 150 pl, og overføre prøven til et 2 ml cryovial. På dette punktet, kan lysates fryses ved -80 ° C, eller direkte målt som beskrevet i punkt 6.
- 24 timer etter infeksjon, fjern supernatanten fra målcellene. Tilsett 4 ml DMEM5 per brønn til cellene. Dette trinnet kan utføres i opp til tre brønner i en tid, hvis brønnene inneholder identiske prøver (ellers, på grunn av den selv-forsterkende arten av de trVLPs i dette systemet, kan kryss-kontaminering bli et problem, og dette trinnet bør gjort en brønn om gangen).
5. Harvest of målceller for én syklus Infeksjon
- Hvis bare en enkelt infeksiøs syklus skal vurderes, ved 72 timer etter infeksjon fjern tHan supernatanten fra målcellene ved hjelp av en vakuumslange.
- Høste celler i 250 mL Glo lysis buffer som beskrevet i avsnitt 4 for produsent celler.
6. Harvest of målceller og Kontinuerlig passaging av trVLPs
- Hvis trVLPs skal kontinuerlig passaged, forberede et nytt sett av målceller som beskrevet i seksjon 3, slik at de er klare for infeksjon 72 timer etter infeksjon av det første sett av målceller (se figur 5).
- Infect det nye settet av målceller som beskrevet i del 4 (ved å bruke det første settet med målceller i stedet for de produsentceller).
- Gjenta disse trinnene hver 72 timer.
7. Analyse av rapportøraktivitet
- Hvis cellelysater ble frosset, tine dem ved romtemperatur. Sørg for at prøvene har nådd romtemperatur før måling.
- Tine den nødvendige mengden (40 mikroliter per prøve) av Renilla Glo analysebuffer (ideelt frosset in alikvoter) ved romtemperatur. Sikre at buffer har nådd romtemperatur før måling.
- Legg 1/100 th volumet av Renilla Glo underlaget til Renilla Glo analysebuffer for å få Renilla Glo reagens, og bland ved virvling. Pipetter 40 pl av den Renilla Glo-reagens i et hvitt 96-brønns plate.
- Legg 40 mL av prøven til Renilla-Glo reagens. Vent i 10 min, deretter måle prøvene i et luminometer ved hjelp av en integrasjonstiden på 1 sek.
Representative Results
Transfeksjon av 293 produsent celler med ekspresjonsplasmider koding Ebola-viruset nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30, og L, en tetracistronic minigenome og tilbehør T7 polymerase resultater i minigenome replikering og transkripsjon og reporter aktivitet som er lett påviselig på 72 timer (figur 6 ). Viktigere, overskrider den observert rapportøraktivitet, (10 5,6 relative luminescens heter (RLU)) som en negativ kontroll hvor ekspresjonsplasmid som koder L ble utelatt fra transfeksjon (10 3 RLU) med mer enn to logger. Den lav aktivitet observert selv i fravær av L er mest sannsynlig på grunn av en kryptisk promoter i minigenome plasmid. Målceller infisert med trVLPs fra supernatanten av produsentceller faktisk viser noe økte nivåer av rapportøraktivitet sammenlignet med produsentceller, og når verdier mellom 10 6 og 10 7 RLU, avhengig av passasjen. I kontrast, whøne supernatanten av kontroll -L produsentceller passaged mot målceller som uttrykker det hele tatt (nukleokapsid protein, inkludert L), har reporter-aktivitet ikke overstiger bakgrunnsstøyen for luminometer (ca. 10 2 RLU).
Den tetracistronic trVLP analysen kan brukes til å studere livssyklusen Ebola virus. For eksempel, er infeksjon av 293 celler med trVLPs avhengig av tilstedeværelse av festefaktorer som Tim-en 16, som må være anordnet i trans i disse cellene. Følgelig, i en tetracistronic trVLP assay et fall i rapportøraktivitet i målceller av omtrent 100-ganger blir observert i fravær av Tim-1 (figur 7A). Rollen spesifikke (viral eller mobil) proteiner i viruset livssyklus kan også vurderes ved hjelp av RNAi teknologi sammen med denne tilnærmingen. Som et eksempel, RNAi-mediert nedregulering av L resulterer i et fall i rapportøraktivitet på omtrent 100 ganger, noe som gjenspeiler den sentrale rollen L ireplikasjon og transkripsjon (figur 7B) 7. Videre er det mulig å direkte manipulere minigenome for å vurdere virkningen av mutasjonene på viruset livssyklus. Som et eksempel, når VP24-ekspresjon fra minigenome blir opphevet ved å innføre tre stoppkodon umiddelbart nedstrøms for startkodonet, rapportøraktivitet i produsentceller ikke er dramatisk endret; imidlertid er rapportøraktivitet i målceller redusert med omtrent 20-ganger etter en passasje, og 400-ganger etter to passeringer, noe som indikerer en rolle for VP24 i produksjon av infeksiøse trVLPs (Figur 7C) 15.
Figur 1. Oppbygging av Ebola-viruset genomet samt monocistronic og tetracistronic minigenomes. Coding regioner for Ebola-viruset protein er vist som røde (NP,VP35, VP30, og L), gul (VP40 og VP24) eller blå (GP 1,2) bokser. Ikke-kodende regioner (NCR) er vist i grønt, med leder og trailer regioner indikert. Den senket indikerer hvilken viral NCR ble brukt for å slutte seg til kodende områder. Den kodende region for reporter (rep) er vist i purpur.
Figur 2. Monocistronic minigenome assay. Celler transfektert med ekspresjonsplasmider for Ebola nukleocapsidproteiner (NP, VP35, VP30, L), en monocistronic minigenome (mg) og T7-polymerase. Den minigenome blir først transkribert med T7-polymerase (a) inn i en unencapsidated minigenome RNA i samme retning som det virale genomet (vRNA), som deretter encapsidated av NP (b). Dette encapsidated vRNA replikeres via en komplementær minigenome RNA (cRNA) mellomprodediate (c), og deretter transkribert til mRNA reporter (d) som er oversatt til rapportørprotein (e).
Figur 3. trVLP analysen med en monocistronic minigenome. Cellene er tilført med ekspresjonsplasmider for minigenome analysekomponentene (Ebola-viruset nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30, L, en monocistronic minigenome og T7 polymerase) samt VP40, GP 1 , 2 og VP24. Dette fører til dannelse av trVLPs som innlemmer minigenome holdige nucleocapsids (F). Disse trVLPs kan så infisere målceller (g), som enten pretransfected med ekspresjonsplasmider for NP, VP35, VP30, og L (topp), som resulterer i replikasjon og transkripsjon sekundær (d) som fører til reporter uttrykket (e), eller naive målceller (nederst), som resulterer i primære transkripsjon av minstigenomes (h), fører også til reporter uttrykket (e).
Figur 4. trVLP analysen med en tetracistronic minigenome. Celler transfektert med ekspresjonsplasmider for Ebola nukleocapsidproteiner (NP, VP35, VP30, L), en tetracistronic minigenome (mg) og T7-polymerase. Initial transkripsjon (a), encapsidation (b), genomreplikasjon (c) og transkripsjon (d) samt oversettelse (e) skjer som i en monocistronic minigenome assay. Imidlertid, i tillegg til reporter mRNA, mRNA for VP40, GP 1,2 og VP24 er også transkribert fra det tetracistronic minigenome, noe som resulterer i dannelsen av trVLPs (f). Disse trVLPs infisere målceller som har blitt pretransfected med ekspresjonsplasmider for nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30, og L, så vel som den cellulære Ebolafeste faktor Tim-1, noe som resulterer i genomreplikasjon og transkripsjon, og produksjon av trVLPs som kan brukes til å infisere frisk målceller.
Figur 5. Timing av en tetracistronic trVLP assay 3 påfølgende passeringer. Dagene for såing av cellene (s), transfeksjon av celler (t), å infisere celler (i), middels endring (c), og høsting av celler og trVLPs (h) er indikert for tre påfølgende passasjer (vist med piler).
Figur 6. Typiske nivåer av reporter aktivitet observert i en tetracistronic trVLP analysen. Et tetracistronic trVLP analysen ble utført over fem passasjer etter protocol skissert i dette manuskriptet. Som en negativ kontroll ekspresjonsplasmidet koding L ble utelatt (-L) fra transfeksjon av p0 produsentceller. Målceller i passasjer P1 til P5 ble tilført med ekspresjonsplasmider for alle nukleocapsidproteiner, inkludert L. bakgrunnsstøyen i luminometeret er indisert som en stiplet linje. Midler og standardavvik av fire biologiske replikater fra 3 uavhengige eksperimenter er vist.
Figur 7. Vurdering av effekten av ulike virus og cellulære faktorer på viral livssyklus ved hjelp tetracistronic trVLPs. (A) Tim-1 som et vedlegg faktor. Målceller som ble pretransfected med ekspresjonsplasmider som koder for de nukleo-proteiner, og med eller uten et plasmid som koder for Tim-1 (beskrevet i 15) ble infisert med tetracistronic trVLPs. 72 timer etter infeksjon rapportøraktivitet i p1 målceller ble bestemt. Midler og standardavvik av fire biologiske replikater fra fire uavhengige eksperimenter er vist. (B) Effekt av RNAi knockdown av L på genom replikering og transkripsjon. Målceller som ble pretransfected med ekspresjonsplasmider for nukleo komponenter, Tim-1 og mirnas rettet mot L (anti-L) eller en uavhengig protein (anti-GFP) (beskrevet i 15) var infisert med tetracistronic trVLPs. 72 timer etter infeksjon rapportøraktivitet i p1 målceller ble bestemt. Midler og standardavvik av fem biologiske replikater fra to uavhengige eksperimenter er vist. (C) Effekt av mutasjoner i minigenome på trVLP smittsomhet. Et tetracistronic trVLP analysen ble utført ved hjelp av enten en villtype minigenome (4cis-WT) eller en minigenome i hvorav 3 stoppkodoner hadde blitt innført umiddelbart etter startkodonet av VP24, avskaffe uttrykke of dette proteinet, men å introdusere bare minimale endringer i minigenome i forhold til lengde, nukleinsyre sammensetning, sekundære konstruksjoner etc. Reporter aktivitet i p0, p1 og p2 ble målt 72 timer etter transfeksjon / infeksjon. Midler og standardavvik av tre biologiske replikater fra 3 uavhengige eksperimenter er vist.
| Produsent Cells (p0) | Målceller (P1 og høyere) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1000 | 1000 | |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-TIM1 | - | 250 |
Tabell 1. DNA utgjør for transfeksjon. Mengden av hvert plasmid som kreves for transfeksjon av produsent og målceller er vist i ng per brønn i en 6-brønns plate. Alle plasmider er beskrevet i Watt et al 15.
Discussion
Den tetracistronic trVLP analysen beskrevet i dette manuskriptet tillater modellering av Ebola-viruset livssyklus over flere smittsomme sykluser. Viktigere, gjør trVLPs produsert i dette systemet ikke inneholder genetisk informasjon for nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30, og L, som til sammen utgjør nesten 60% av Ebola-viruset genomet og er avgjørende for virusreplikasjon. Snarere er disse proteinene må være anordnet i målceller i trans fra ekspresjonsplasmider, og en hvilken som helst infeksjon av celler som uttrykker ikke alle fire av disse proteiner er mislykket. Viktigere er det ingen bevis for genetisk rekombinasjon for filoviruses, og det er ingen homologe regioner delt mellom tetracistronic minigenome og ekspresjonsplasmider for nukleocapsidproteiner. Derfor finnes det heller ikke noen praktisk bevis heller ikke noen teoretisk grunn for at kunne sørge for muligheten for å skape full lengde Ebola virusgenomer som dermed potensielt føreproduksjon av infeksiøse Ebola virus, noe som gjør dette systemet sikker for bruk under BSL2 betingelser.
Det er to viktige skritt i tetracistronic trVLP analysen som er påvirket av eksperimentelle forhold, dvs. produksjon av trVLPs, og infeksjon av målceller med disse trVLPs. Produksjon av trVLPs er avhengig av høye nivåer av minigenome replikasjon og transkripsjon, som i sin tur er avhengig av en høy transfeksjon effekt. Transfeksjon effekt kan lett bedømmes ved å inkludere en -L kontroll, hvor ekspresjonsplasmid for L er byttet ut med et ekspresjonsplasmid som koder for EGFP. Transfeksjon priser under disse forholdene bør overskride 50% av inspeksjon med en fluorescens mikroskop 24 timer etter transfeksjon. Videre celler må være fri for mycoplasma, siden i vår erfaring mycoplasma forurensning dramatisk svekker minigenome replikering og transkripsjon (upublisert data). På grunn av sin høye transfectability 293 ceLLS er cellelinjen av valg for trVLP analyser; Men disse cellene er relativt dårlig utsatt (om enn ikke helt refraktiv) til infeksjon med Ebola-viruset 16. Uttrykk for et vedlegg faktor som Tim-1 forbedrer infeksjon av 293 celler med trVLPs ca 100-fold, og er avgjørende for å lykkes med dette systemet over flere passasjer.
Mens tetracistronic trVLPs er ikke selvreplikerende på egen hånd, er de selvreplikerende i celler som uttrykker de nukleocapsidproteiner. Som sådan, forholdsregler må gjøres for å unngå kryss forurensninger mellom brønner som inneholder forskjellige trVLPs (f.eks med ulike mutasjoner i minigenome). Fra en mer teknisk synspunkt, på grunn av den store forskjellen mellom positive og negative signaler i denne analysen (ca 4 logger), krysstale mellom prøvene ved å måle luciferase-aktivitet kan være et problem; Imidlertid kan dette lett unngås ved å la en tom godt mellom hver prøve i96-brønns plate som brukes for å måle luciferase-aktivitet.
Det finnes en rekke mulige bruksområder for tetracistronic trVLPs. Tydeligvis er de godt egnet til å studere oppføring av filovirus partikler, siden infeksiøse trVLPs har typisk tråd-lignende struktur av infeksiøse filoviruses 14, og inneholder de samme virale komponenter som filovirus partikler. Viktigere, har de ikke inneholder komponenter av andre virus, slik tilfellet er ved bruk av pseudotyped virioner eller viruslignende partikler, for eksempel retrovirus partikler som bærer GP 1,2, eller rekombinante virus, så som rekombinant vesikulær stomatitt-virus som uttrykker gp 1,2 . Kravet til festefaktorer ved bruk av 293 celler som målceller i dette systemet kan utnyttes til skjermen i og undersøke rollen til slike festefaktorer, mens rollene til andre cellulære faktorer, slik som de som er involvert i genomreplikasjon og transkripsjon, samt morphogenesis og knoppding, kan undersøkes ved hjelp av RNAi teknologi. Effekten av mutasjoner i virusproteiner på viruset livssyklusen kan også bli studert, men man må huske på at mens VP40, GP 1,2, og VP24 er uttrykt etter viral transkripsjon, er uttrykk for de andre virusproteiner oppnådd fra uttrykket plasmider, slik at effekter på grunn av overekspresjon av disse proteinene må tas i betraktning. I tillegg bør man sørge for at mutasjoner i minigenome ikke vesentlig endre lengden på minigenome, siden reporter aktivitet er direkte berørt av minigenome lengde 15. Til slutt, siden tetracistronic minigenomes er virale genom analoger som bærer virale gener, og blir kopiert av den virale polymerase komplekset, bør det også være mulig å studere utviklingen av disse gener i respons til mutasjoner i henhold BSL2 betingelser. Således, mens videre studier er fremdeles nødvendig i denne retning, skal det være mulig, for eksempel for å innføre suboptimalmutasjoner i gener innenfor minigenome og deretter passasje trVLPs til gratis mutasjoner dukke opp.
En begrensning av den tetracistronic trVLP analysen som må holdes i bakhodet er det faktum at mens det modeller meste av virus livssyklus, primær transkripsjon i målceller er ikke modellert av dette systemet, siden målceller har til å uttrykke de nukleocapsidproteiner i trans for at trVLPs å gjenskape. Hvis primære transkripsjon må vurderes, er det mulig å bruke naive målceller 10; Imidlertid, i dette tilfellet ingen genom-replikasjon foregår i målceller, og ingen flere infeksiøse trVLPs produseres, avbrytes infeksjon. Dette er et prinsipp problem som ikke kan løses uten å gjengi de trVLPs helt selvreplikerende, ved å inkludere genene for de nukleocapsidproteiner inn i minigenome, som ville de facto slå dem i smittsomme rekombinante Ebola virus. Faktisk, EbolA-virus som uttrykker luciferase, eller andre reportere er blitt generert, og kan bli anvendt for å vurdere og studere genom replikasjon og transkripsjon 17,18; Imidlertid er deres anvendelse begrenset til BSL4 laboratorier. Dessuten har det å være oppmerksom på at mens VP40, GP 1,2, og VP24 er uttrykt fra en viral genom analog, deres posisjon i minigenome (2., 3., og 4. transcriptional enhet) er ikke identisk med deres posisjon i det virale genomet (3., 4. og 6. transcriptional unit), som kan påvirke deres absolutte ekspresjonsnivåer, så vel som deres relative ekspresjonsnivåer i forhold til hverandre.
Samlet sett representerer den tetracistronic trVLP analysen den mest omfattende livssyklus modellering system for Ebola virus tilgjengelige per i dag, og gjør at modellering av genom replikering og transkripsjon, partikkel morphogenesis og spirende, samt vedlegg og noprøve inn i målceller over flere infeksjonssykluser. Som sådan, har det stort potensial for bruk i å undersøke biologi Ebola virus henhold BSL2 forhold.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er svært takknemlig til Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), som fungerte som fortelleren, samt Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) og Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) for deres hjelp med å lage filmen følger dette manuskriptet. Videre ønsker vi å takke Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) for kritisk lesing av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program av NIH, NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
