Summary
Arbetet med smitt Ebola-virus är begränsad på biosäkerhet nivå fyra laboratorier. Tetracistronic minigenome innehållande replikation och transkription kompetenta viruslika partiklar (trVLPs) utgör ett livscykelmodelleringssystem som tillåter oss att på ett säkert sätt modellera flera infektionscykler under skyddsnivå 2 villkor, att förlita sig enbart på Ebola viruskomponenter.
Abstract
Ebola-virus orsaka allvarliga hemorragiska febrar hos människor och andra primater, med dödligheten så hög som 90%. Det finns inga godkända vacciner eller specifika behandlingar för sjukdomen som orsakas av dessa virus, och arbeta med smitt Ebola-virus är begränsad på biosäkerhet nivå fyra laboratorier, kraftigt begränsar forskningen om dessa virus. Lifecycle modellsystem modell viruset livscykel enligt skyddsnivå 2 villkor; Men fram till nyligen sådana system har begränsats till antingen enskilda aspekter av viruset livscykel, eller en enda smittcykel. Tetracistronic minigenomes, som består av Ebola-virus icke-kodande regioner, en reporter gen och tre ebolavirus gener involverade i morfogenes, spirande, och inträde (VP40, GP 1,2, och VP24), kan användas för att producera replikation och transkription -competent virusliknande partiklar (trVLPs) innehåller dessa minigenomes. Dessa trVLPs kan kontinuerligt infektera celler som uttrycker Ebolavirusproteiner som ansvarar för genomet replikering och transkription, vilket tillåter oss att på ett säkert sätt modellera flera infektionscykler under skyddsnivå 2 villkor. Viktigt är de virala komponenterna i dessa system enbart härrör från Ebola-virus och inte från andra virus (som är till exempel fallet i system som använder pseudotypade virus) och VP40, GP 1,2 och VP24 inte är överuttryckt i detta system , vilket gör den idealiskt lämpad för att studera morfogenes, knoppning och inträde, även om andra aspekter av virusets livscykel, såsom genomreplikation och transkription kan också modelleras med detta system. Därför representerar tetracistronic trVLP analysen den mest omfattande livscykelmodelleringssystem för Ebola-virus, och har en enorm potential för användning vid undersökning biologi Ebola-virus i framtiden. Här ger vi detaljerad information om användningen av detta system, liksom på förväntade resultat.
Introduction
Ebola-virus är den orsakande agent för en allvarlig hemorragisk feber hos människor och icke-mänskliga primater med dödligheten med upp till 90% i mänskliga utbrott 1. Även om det har skett betydande framsteg under de senaste åren för att utveckla vacciner samt särskilda behandlingar (över 2,3), är dessa inte godkända för humant bruk. Ebola-viruspartiklar har en karakteristisk trådliknande utseende med en längd av ca 1 ^ m och en diameter av 96 till 98 nm 4. En nukleokapsidproteiner utgör kärnan i de viruspartiklar och består av 1) den icke-segmenterad enkelsträngat negativ-sense RNA-genom, som kodar de 7 ebolavirus generna (Figur 1), 2) nukleoproteinet NP, vilket encapsidates genomet, 3 ) det virala polymeraskomplexet bestående av polymeraset L och dess kofaktor VP35, och 4) den transkriptionella aktivatorn VP30. Dessutom har det nyligen visats att proteinet VP24 är också associerat med nukleokapsids 4. Den nukleokapsid omgiven av matrisen utrymme i vilket matrisprotein VP40, som är ansvarig för morfogenes och knoppning av virioner, är belägen. Viruspartiklarna vidare insvept, och inbäddad i kuvertet är den enda ytan protein GP 1,2, som ansvarar för virion infästning och inträde.
Arbetet med smitt Ebola-virus måste utföras inom högst inneslutning laboratorium under biosäkerhetsnivå (BSL) 4 förhållanden, vilket begränsar arbetet till ett fåtal anläggningar i hela världen. För att studera biologi dessa virus eller för att utveckla nya läkemedel i BSL2 förhållanden, forskare förlitar antingen på rekombinant uttryck av Ebola virusproteiner, eller på livscykelmodelleringssystem, som båda kan arbetat med i frånvaro av smittebolavirus. Rekombinant expression av Ebola-virusproteiner är antingen uppnås från expressionsplasmider eller virala vektorer. Ett specialfall av denna strategi är denalstring av virioner eller virusliknande partiklar baserade på andra virus än Ebola virus (retrovirus vanligast eller vesikulärt stomatitvirus) i närvaro av rekombinant uttryckta GP 1,2, vilket leder till generering av pseudotypade partiklar, som kan användas för att studera ingångsprocessen filoviruses och skärm för inträdeshämmare 5. Alternativt kan genereras rekombinanta virus (t.ex. vesikulär stomatit virus) som kodar ebolaviruset GP 1,2 i stället för sin egen glykoprotein och används för att studera virus posten under skyddsnivå 2 villkor 6.
Livscykelmodellsystem är former av omvänd genetik system som presenterar användning av trunkerade ebolavirus genom analoger (minigenomes), som från början är framställda av cDNA och därefter replikerade och transkriberade av Ebola virusproteiner som i trans. Den första minigenome system för ebolaviruset utvecklades mer än 15 år sedan 7, Och har sedan dess använts för att studera ebolavirusgenom replikation och transkription (över 8,9). I detta system är en monocistroniska minigenome bestående av en enda reportergenen flankerad av de terminala icke-kodande regioner av ebolavirus-genomet (kallad ledare och släp) (Figur 1) uttrycks i däggdjursceller (vanligen genom transkription med användning av T7-RNA-polymeras) tillsammans med de virala proteinerna L, VP35, VP30 och NP. Den minigenome är inkapslade av NP och sedan replikeras och skrivs ut av de andra nukleokapsidproteiner hjälp cis-verkande signaler lokaliserade i ledare och släp, vilket leder till reporter aktivitet som speglar dessa två aspekter av virusets livscykel (Figur 2).
För att modellera ytterligare steg i den virala livscykeln, transkription och replikationskompetent virusliknande partikel (trVLP) system har utvecklats, vilka är baserade på klassiska minigenome system, men har i ettY tterligare expression av andra virusproteiner VP24, VP40 och GP 1,2 från expressionsplasmider 10,11. Närvaron av VP40 leder till bildandet av trVLPs, som bär GP 1,2 på sin yta, och bära en minigenome innehållande nukleokapsid på insidan. Dessa trVLPs kan användas för att infektera målceller, vilka antingen har pretransfected med expressionsplasmider för L, VP35, VP30 och NP, för att underlätta replikation och transkription av minigenomes bringas i målcellerna inom trVLPs 11, eller är naiva målceller (dvs. utan plasmid drivna uttryck av Ebola virusproteiner) 10. Detta resulterar i reporteraktivitet i målceller, som speglar replikering av minigenomes i producerande celler, morfogenes och knoppning av trVLPs, de träder i målceller, och 1) i fråga om pretransfected målceller också genomet replikering och sekundär transkription ( dvs transkription av virala proteiner produced i målceller) i målceller, eller 2) i fråga om naiva målceller även primär transkription (dvs transkription av virala proteiner förs in målceller inom trVLPs) (Figur 3). Viktigt är, har dessa system endast använts för att modellera en enda infektiös cykel, och förlita sig på överuttryck av alla virala proteiner, som i fallet med VP24 och VP40 är särskilt problematiskt, eftersom dessa proteiner har visat sig vara starka negativa regulatorer av genomreplikation och transkription när uttrycks från plasmider 12,13. Vidare trVLP beredningar som tillverkas i dessa system innehåller en hög andel icke-infektiösa partiklar, poserar utmaningar för biokemisk analys av smitt trVLPs 14.
För att övervinna dessa problem har vi nyligen utvecklat en tetracistronic minigenome system som, förutom att en reportergen, innehåller också de gener som kodar för VP40, GP 1,2 ochVP24 (Figur 1). I likhet med den klassiska monocistroniska minigenome systemet leder detta system till produktionen av trVLPs som kan infektera målceller (Figur 4) 15. Emellertid i motsats till den klassiska minigenome systemet, VP40, GP 1,2, och VP24 produceras efter viralt genom transkription snarare än att vara överuttryckt från plasmider. Som ett resultat, kinetiken och expressionsnivåerna av dessa proteiner likna mycket närmare de som påträffas under den virala livscykeln, och följaktligen förhållandet av smittsamma för icke-infektiösa trVLPs ökas omkring 500-faldigt i detta system 15. Vidare använder detta system var det möjligt att kontinuerligt passage tetracistronic minigenome innehållande trVLPs, modellering flera infektionscykler. Som sådan tetracistronic trVLPs är för närvarande den mest omfattande livscykelmodelleringssystem som finns att studera ebolavirus biologi enligt BSL2 förhållanden. Här ger vi detaljerad information om användningen of detta system, såväl som den förväntade resultaten.
Protocol
1. Uppdelning av producentceller för Initial Produktion av trVLPs
- Avlägsna mediet 80-90% konfluenta 293 celler odlades i 75 cm 2 kolvar i hög-glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin och 1x pen / strep (DMEM10 ). Tvätta cellerna två gånger med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), försiktigt så att inte rubba cellerna, och tillsätt 2 ml trypsin-EDTA till cellerna.
- Inkubera cellerna vid rumstemperatur till dess celler uppvisar signifikant rundning när de observeras under ett mikroskop (ca 30 sek). Lösgöra celler genom att trycka kolven och tillsätt 8 ml DMEM10. Grundligt resuspendera cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner tills en enkelcellsuspension observeras när den betraktas under mikroskop.
- Räkna cellerna med användning av en automatiserad cellräknare. Späd celler till 2 x 10 5 celler per ml i DMEM10. Pipettera 2 ml cellsuspension per brunn i 6-brunnsplattor (4 x 105 celler per brunn).
- Inkubera plattorna i en fuktig vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
2 Transfektion av produktionsceller för Initial Produktion av trVLPs
- 24 timmar efter att dela upp celler (se figur 5 för en översikt av experimentet timing), pipett plasmid-DNA 15 (för belopp se tabell 1) i en steril 2 ml cryovial hjälp filtrerade tips. Tillsätt 100 pl OptiMEM per brunn till DNA. Vortexa blandningen kortvarigt och försiktigt spinn ner rören med hjälp av en mikro. Om flera brunnar som skall transfekteras med identiska plasmider, kan göras en mastermix för flera brunnar.
- Skaka snabbt flaskan med Transit LT1 före användning. Lägg 7,5 l Transit LT1 per brunn till den utspädda DNA. Vortexa försiktigt blandningen, till att inte samla vätska i locket på cryovial, och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Blanda försiktigt transfektionenkomplex genom att pipettera upp och ned. Lägg 100 pl av transfektionen komplex droppvis till varje brunn. Rock plattan framåt / bakåt och från sida till sida för att fördela transfektion komplex. Inte snurra plattan eftersom detta kommer att orsaka ojämn spridning av transfektion komplex.
- Återgå cellerna till inkubatorn.
- Efter 24 timmar, avlägsna supernatanten från celler. Lägg 4 ml DMEM med 5% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 x pen / strep (DMEM5) till cellerna. Detta steg kan utföras i upp till tre brunnar på en gång utan torkning av brunnarna, under antagande brunnarna innehåller identiska prover (annars, på grund av den självförstärkande beskaffenhet trVLPs i detta system, kan korskontamination bli ett problem och detta steg bör göras en brunn i taget).
- Återgå cellerna till inkubatorn.
3. Beredning av målceller
- Split 293 celler enligt avsnitt 1, sådd 4 x 10 5 celler i 2 ml DMEM10 per brunn i en6-brunnars platta.
- 24 timmar efter uppdelningen av målceller och 24 timmar före infektion, transfektera målceller som beskrivs i avsnitt 2 med hjälp av DNA-belopp i tabell 1 och 4,5 l Transit LT1 per brunn.
4 Infektion av målceller och Harvest av produktionsceller
- Överför supernatanterna från producentceller till 15 ml rör. Avlägsna och kassera eventuella kvarvarande supernatanten med hjälp av en vakuumslang. Lägg 250 pl Glo lysbuffert till cellerna.
- Centrifugera supernatanten i 5 min vid 800 xg och rumstemperatur för att rensa de prover av cellrester.
- Avlägsna supernatanten från en brunn av målcellerna. Tillsätt försiktigt 3 ml rensas producentcell supematant till målceller med användning av den långsammaste pipett hastighet. Undvik att pipettera direkt på cellerna för att undvika att störa encellsskiktet. Detta steg måste utföras en väl åt gången.
- När alla prover har varit transförts, återgår målcellerna till inkubatorn för att medge sedimentering av trVLPs och infektion av målceller.
- Efter 15 minuters inkubering vid rumstemperatur i Glo lysbuffert, resuspendera producentceller i lysbuffert med användning av en mikropipett inställd på 150 pl, och överföra provet i en 2 ml cryovial. Vid denna punkt, kan lysat frysas vid -80 ° C, eller direkt mätt enligt beskrivningen i avsnitt 6.
- 24 h efter infektion, avlägsna supernatanten från målcellerna. Lägg 4 ml DMEM5 per brunn till cellerna. Detta steg kan göras i upp till tre brunnar i taget, om brunnarna innehåller identiska prover (annars, på grund av den självförstärkande karaktären hos de trVLPs i detta system, kan korskontaminering blir ett problem, och det här steget bör vara gjort en brunn i taget).
5. Skörd av målceller för en enda cykel Infektion
- Om bara en enda smittcykel bör bedömas, vid 72 timmar efter infektion ta bort tHan supernatanten från målceller med en vakuumslang.
- Skörda cellerna i 250 l Glo lysbuffert som beskrivs i avsnitt 4 för produktionsceller.
6. Skörd av målceller och kontinuerlig Passage av trVLPs
- Om trVLPs ska kontinuerligt passe, utarbeta en ny uppsättning målceller som beskrivs i avsnitt 3, så att de är redo för infektion 72 timmar efter infektion av den första uppsättningen av målceller (se figur 5).
- Infektera nya uppsättningen av målceller som beskrivs i avsnitt 4 (med hjälp av den första uppsättningen av målceller i stället för producentcellerna).
- Upprepa dessa steg varje 72 timmar.
7 Analys av Reporter aktivitet
- Om cellysat frystes, tina dem vid rumstemperatur. Se till att proverna har nått rumstemperatur före mätning.
- Tina den önskade mängden (40 pl per prov) i Renilla Glo analysbuffert (helst fryst in delmängder) vid rumstemperatur. Se till att bufferten har rumstemperatur före mätning.
- Lägg 1/100: e volymen av Renilla Glo substratet till Renilla Glo analysbuffert för att erhålla Renilla Glo-reagens och omskakas. Pipettera 40 | il av Renilla-Glo-reagens till en vit 96-brunnars platta.
- Tillsätt 40 l av provet till Renilla-Glo-reagens. Vänta 10 minuter och sedan mäta proverna i en luminometer använder en integrationstid på 1 sek.
Representative Results
Transfektion av 293 producent celler med expressionsplasmider som kodar för Ebola virus nukleokapsidproteiner NP, VP35, VP30, och L, en tetracistronic minigenome och tillbehör T7-polymeras resulterar i minigenome replikation och transkription och reporter aktivitet som är lätt detekterbar vid 72 h (Figur 6 ). Viktigt är den observerade reporteraktivitet (10 5,6 relativa luminiscens heter (RLU)) överskrider det av en negativ kontroll i vilken expressionsplasmid som kodar för L utelämnades från transfektionen (10 3 RLU) med mer än två stockar. Den låga nivå av aktivitet som observeras även i frånvaro av L är mest sannolikt på grund av en kryptisk promotor i minigenome plasmiden. Målceller infekterade med trVLPs från supernatanten av producentceller faktiskt uppvisar något ökade nivåer av reporteraktivitet i jämförelse med producentceller och värdena når mellan 10 6 och 10 7 RLU, beroende på passagen. I kontrast, vhöna supernatanten av -L kontrollproducentceller passe på målceller (som uttrycker alla nukleokapsidproteinet, inklusive L), innebär reporter verksamheten inte överstiga bakgrundsbrus luminometern (ca 10 2 RLU).
Den tetracistronic trVLP analys kan användas för att studera livscykel Ebola virus. Till exempel är infektion av 293 celler med trVLPs beroende av närvaron av fästfaktorer såsom Tim-en 16, som måste tillhandahållas i träns i dessa celler. Följaktligen, i en tetracistronic trVLP assay en droppe i reporteraktivitet i målceller av ca 100-faldig observeras i frånvaro av Tim-1 (figur 7A). Kan också bedömas roll specifika (virala eller cellulära) proteiner i viruset livscykel med hjälp av RNAi-teknik tillsammans med denna strategi. Som ett exempel, RNAi-medierad nedreglering av L resulterar i en minskning av reporter aktivitet av ca 100 gånger, vilket återspeglar den centrala roll som L ireplikation och transkription (Figur 7B) 7. Vidare är det möjligt att direkt manipulera minigenome att bedöma effekten av mutationer på virusets livscykel. Som ett exempel, när VP24-uttryck från minigenome avskaffas genom att införa tre stoppkodoner omedelbart nedströms från startkoden, reporter aktivitet i produktionsceller är inte dramatiskt förändrats; emellertid reporteraktivitet i målceller minskas med ca 20-faldigt efter en passage, och 400-faldigt efter två passager, vilket indikerar en roll av VP24 i produktionen av infektiösa trVLPs (Figur 7C) 15.
Figur 1 Struktur för ebolavirusgenomet samt monocistroniska och tetracistronic minigenomes. Kodning regioner för ebolavirusprotein visas som rött (NP,VP35, VP30, och L), gul (VP40 och VP24) eller blå (GP 1,2) lådor. Icke-kodande regioner (NCRS) visas i grönt, med ledaren och trailer regioner. Den nedsänkta visar vilken viral NCR användes för att sammanfoga de kodande regionerna. Den kodande regionen för reportern (rep) visas i purpur.
Figur 2 monocistroniska minigenome analys. Celler transfekterades med expressionsplasmider för Ebola virus nukleokapsidproteiner (NP, VP35, VP30, L), en monocistroniska minigenome (mg) och T7-polymeras. Den minigenome initialt transkriberas av T7-polymeras (a) in i en unencapsidated minigenome RNA i samma orientering som det virala genomet (vRNA), som därefter inkapslas av NP (b). Detta inkapslade vRNA replikeras via en kompletterande minigenome RNA (cRNA) intermediate (c), och därefter transkriberas till reporter mRNA (d) som översätts till rapportprotein (e).
Figur 3 trVLP analys med en monocistroniska minigenome. Celler transfekterades med expressionsplasmider för minigenome analyskomponenterna (ebolaviruset nukleokapsidproteiner NP, VP35, VP30, L, en monocistroniska minigenome och T7 polymeras) samt VP40, GP 1 , 2 och VP24. Detta leder till bildandet av trVLPs som innehåller minigenome innehållande nukleokapsider (f). Dessa trVLPs kan sedan infektera målceller (g), vilka antingen är pretransfected med expressionsplasmider för NP, VP35, VP30, och L (överst), vilket resulterar i replikation och sekundär transkription (d) leder till reporteruttryck (e), eller naiv målceller (nederst), vilket resulterar i primär transkription av minigenomes (h), som också leder till reporter uttrycket (e).
Figur 4 trVLP analys med en tetracistronic minigenome. Celler transfekterades med expressionsplasmider för Ebola virus nukleokapsidproteiner (NP, VP35, VP30, L), en tetracistronic minigenome (mg) och T7-polymeras. Initial transkription (a), inkapsling (b), genomet replikering (c) och transkription (d) samt översättning (e) uppträder som i en monocistroniska minigenome analys. Emellertid, förutom reporter mRNA, mRNA för VP40, GP 1,2 och VP24 är också transkriberas från tetracistronic minigenome, vilket resulterar i bildandet av trVLPs (f). Dessa trVLPs infektera målceller som har pretransfected med expressionsplasmider för de nukleokapsidproteiner NP, VP35, VP30 och L, såväl som den cellulära ebolavirusfastsättning faktor Tim-1, vilket resulterar i genomreplikation och transkription, och produktion av trVLPs som kan användas för att infektera färska målceller.
Figur 5 Tidpunkt för en tetracistronic trVLP analys för 3 passager i följd. Dagarna för sådd celler (s), transfektera celler (t), infektera celler (i), medelförändring (c) och skörd av celler och trVLPs (h) är anges för tre på varandra följande passager (indikerade med pilar).
Figur 6 Typiska nivåer av reporteraktivitet observerats i en tetracistronic trVLP analys. En tetracistronic trVLP analys utfördes under fem passager efter protokollol beskrivs i detta manuskript. Som en negativ kontroll expressionsplasmiden som kodar för L utelämnades (-L) från transfektion av p0 producentceller. Målceller i passager P1 till P5 transfekterades med expressionsplasmider för alla nukleokapsidproteiner, inklusive L. bakgrundsbrus av luminometern är indicerat som en streckad linje. Medel och standardavvikelser för fyra biologiska replikat från 3 oberoende experiment visas.
Figur 7 Bedömning av olika virala och cellulära faktorer på den virala livscykeln med hjälp tetracistronic trVLPs. (A) Tim-1 som en bilaga faktor. Målceller som pretransfected med expressionsplasmider som kodar för nukleokapsidproteiner och med eller utan en plasmid som kodar för Tim-1 (beskriven i 15) infekterades med tet-racistronic trVLPs. 72 timmar efter infektion reporter aktivitet i p1 målceller bestämdes. Medelvärden och standardavvikelser för fyra biologiska replikat från fyra oberoende experiment visas. (B) Effekt av RNAi knockdown av L på genomreplikation och transkription. Målceller som pretransfected med expressionsplasmider för nukleokapsidproteiner komponenter, Tim-1 och miRNA mot L (anti-L) eller en obesläktad protein (anti-GFP) (beskriven i 15) var infekterade med tetracistronic trVLPs. 72 timmar efter infektion reporter aktivitet i p1 målceller bestämdes. Medel och standardavvikelser för 5 biologiska replikat från två oberoende experiment visas. (C) Effekt av mutationer i minigenome på trVLP infektivitet. En tetracistronic trVLP analys utfördes med användning av antingen en vildtyp minigenome (4cis-WT) eller en minigenome i vilka tre stoppkodoner hade införts direkt efter startkodonet för VP24, avskaffa uttrycka of detta protein, men att införa endast minimala förändringar av minigenome i fråga om att längd, nukleinsyrakomposition, sekundära strukturer etc. Reporter aktivitet i p0, p1 och p2 mättes 72 timmar efter transfektion / infektion. Medel och standardavvikelser för tre biologiska replikat från 3 oberoende experiment visas.
| Producentceller (P0) | Målceller (p1 och högre) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1000 | 1000 | |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-TIM1 | - | 250 |
Tabell 1 DNA uppgår för transfektion. Mängden av varje plasmid som krävs för transfektion av producent och målceller visas i ng per brunn i en 6-brunnsplatta. Alla plasmider beskrivs i Watt et al 15.
Discussion
Den tetracistronic trVLP analys som beskrivs i detta manuskript möjliggör modellering av ebolaviruset livscykel under flera infektionscykler. Viktigt är de trVLPs produceras i detta system inte innehåller den genetiska informationen för nukleokapsidproteiner NP, VP35, VP30, och L, som tillsammans utgör nästan 60% av ebolaviruset genomet och är nödvändiga för virusreplikation. Snarare dessa proteiner måste tillhandahållas i målceller i träns från expressionsplasmider, och någon infektion av celler som inte uttrycker alla 4 av dessa proteiner är förfelad. Viktigt, det finns inga tecken på genetisk rekombination för filoviruses, och det finns inga motsvarande regionerna delas mellan tetracistronic minigenome och uttrycksplasmiderna för nukleokapsidproteiner. Därför finns det inte heller någon praktisk bevisning eller någon teoretisk grund som kan ge en möjlighet att generera full längd Ebola virusgenom som kunde därefter eventuellt ledaproduktion av infektiösa Ebola-virus, vilket gör systemet säkert för användning under BSL2 förhållanden.
Det finns två viktiga steg i tetracistronic trVLP analysen som påverkas av experimentella förhållanden, det vill säga produktion av trVLPs samt infektion av målceller med dessa trVLPs. Produktion av trVLPs är beroende av höga nivåer av minigenome replikation och transkription, vilket i sin tur är beroende av en hög transfektion effektivitet. Transfektion effekt kan lätt bedömas genom att inkludera en -L kontroll, där uttrycket plasmid för L byts mot en expressionsplasmid som kodar eGFP. Transfektion priser under dessa förhållanden bör överstiga 50% genom inspektion med ett fluorescensmikroskop 24 timmar efter transfektion. Vidare celler måste vara fria från mykoplasma, eftersom i vår erfarenhet mykoplasma kontamination dramatiskt försämrar minigenome replikering och transkription (opublicerade data). På grund av deras höga transfectability 293 cells är cellinjen valt för trVLP analyser; Men dessa celler är relativt dåligt mottagliga (om än inte fullständigt brytnings) infektion med ebolaviruset 16. Uttryck av en bilaga faktor såsom Tim-1 förstärker infektion av 293 celler med trVLPs ca 100-faldig, och är avgörande för att lyckas med detta system under flera passager.
Medan tetracistronic trVLPs inte självreplikerande på egen hand, de är självreplikerande i celler som uttrycker de nukleokapsidproteiner. Som sådana försiktighetsåtgärder måste göras för att undvika korskontamination mellan brunnar innehållande olika trVLPs (t.ex. med olika mutationer i minigenome). Ur en mer teknisk synvinkel, på grund av den stora skillnaden mellan positiva och negativa signaler i denna analys (ca 4 stockar), överhörning mellan prover vid mätning luciferasaktivitet kan vara ett problem; Men kan detta lätt undvikas genom att lämna en tom väl mellan varje prov i96-brunnsplatta användes för att mäta luciferasaktivitet.
Det finns en mängd tänkbara applikationer för tetracistronic trVLPs. Självklart, de är väl lämpade för att studera inträde av filovirus partiklar, eftersom infektions trVLPs har den typiska trådliknande struktur av infektiösa filoviruses 14, och innehåller samma virala komponenter som filovirus partiklar. Viktigt är, att de inte innehålla komponenter av andra virus, såsom är fallet vid användning av pseudotypade virioner eller virusliknande partiklar, såsom retroviruspartiklar som bär GP 1,2, eller rekombinanta virus, såsom rekombinant vesikulärt stomatitvirus som uttrycker GP 1,2 . Kravet på fäst faktorer vid användning av 293-celler såsom målceller i detta system kan utnyttjas för att screena för och undersöka rollen av sådana fastsättnings faktorer, medan rollerna av andra cellulära faktorer, såsom de som är inblandade i genomreplikation och transkription, liksom morphogenesis och knoppding, kan undersökas med hjälp av RNAi-teknik. Effekten av mutationer i virusproteiner på viruset livscykel kan också studeras, även om man måste hålla i minnet att medan VP40, GP 1,2, och VP24 uttrycks efter viral transkription, är uttryck för de andra virala proteiner uppnås från uttrycket plasmider, så att effekter på grund av överuttryck av dessa proteiner måste beaktas. Dessutom bör försiktighet iakttas för att mutationer i minigenome inte signifikant förändrar längden av minigenome eftersom reporteraktivitet påverkas direkt av minigenome längd 15. Slutligen, eftersom tetracistronic minigenomes är viralt genom analogier som överför virusgener, och replikeras av den virala polymeraset komplexa, bör det också vara möjligt att studera utvecklingen av dessa gener som svar på mutationer i BSL2 förhållanden. Medan ytterligare studier behövs fortfarande i denna riktning, bör det vara möjligt, till exempel att införa suboptimalmutationer i gener inom minigenome och sedan passage trVLPs tills gratis mutationer uppstår.
En begränsning av tetracistronic trVLP analys som måste hållas i minnet är det faktum att när det modeller mesta av viruset livscykel, primär transkription i målceller inte modelleras med detta system, eftersom målceller måste uttrycka de nukleokapsidproteiner i trans För att de trVLPs att replikera. Om primär transkription måste bedömas, är det möjligt att använda naiva målceller 10; Men i det här fallet ingen genomet replikering sker i målceller, och inga ytterligare smitt trVLPs produceras, avbryter infektionen. Detta är ett huvudproblem som inte kan lösas utan att göra de trVLPs helt självreplikerande, genom att bland annat generna för de nukleokapsidproteiner till minigenome, vilket i praktiken gör dem till infektiösa rekombinanta Ebola-virus. Faktum Ebolett virus som uttrycker har genere luciferas eller andra reportrar och kan användas för att utvärdera och studera genomet replikering och transkription 17,18; dock användningen begränsad till BSL4 laboratorier. Dessutom, måste det hållas i minnet att medan VP40, GP 1,2, och VP24 uttrycks från ett viralt genom analog, deras position i minigenome (2: a, 3: e, och 4: e transkriptionsenhet) inte är identisk med deras position i virusgenomet (3: e, 4: e och 6: e transkriptionsenhet), som skulle kunna påverka deras absoluta uttrycksnivåer samt deras relativa uttryck nivåer i förhållande till varandra.
Totalt motsvarar den tetracistronic trVLP analysen den mest omfattande livscykelmodellsystemet för Ebola virus som finns hittills, och tillåter modellering av genomet replikering och transkription, partikel morfogenes och knoppning, samt bifogad fil och enFörsök i målceller över flera infektionscykler. Som sådan har den en enorm potential för användning vid undersökning biologi Ebola-virus enligt BSL2 förhållanden.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna är mycket tacksamma för Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), som fungerade som berättare, och Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) och Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) för deras hjälp med att göra filmen som åtföljer detta manuskript. Vidare vill vi tacka Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) för kritisk läsning av manuskriptet. Denna forskning stöds av Interna forskningsprogram NIH, NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
