Abstract
L'obiettivo di questo protocollo chirurgico è quello di esporre il nervo facciale, che innerva la muscolatura facciale, alla sua uscita dal forame stylomastoid e tagliate o schiacciarlo per indurre lesioni dei nervi periferici. I vantaggi di questo intervento sono la sua semplicità, alta riproducibilità, e la mancanza di effetto sulle funzioni vitali o di mobilità dal conseguente paralisi facciale, con il risultato di un risultato chirurgico relativamente mite rispetto ad altri modelli di lesioni nervose. Un importante vantaggio di utilizzare un modello di lesione del nervo cranico è che i motoneuroni risiedono in una popolazione relativamente omogenea nel nucleo motoria facciale nel ponte, semplificando lo studio dei corpi cellulari motoneuroni. A causa della natura simmetrica di innervazione del nervo facciale e la mancanza di diafonia tra i nuclei motori facciali, l'operazione può essere eseguita con il lato unilateralmente unaxotomized serve come controllo interno accoppiato. Una varietà di analisi può essere effettuata dopo l'intervento di asinis la risposta fisiologica, i cui dettagli sono oltre la portata di questo articolo. Ad esempio, il recupero della funzione muscolare può servire come marcatore comportamentale per reinnervation, o motoneuroni può essere quantificato per misurare la sopravvivenza cellulare. Inoltre, i motoneuroni possono essere catturati con precisione mediante microdissezione laser per l'analisi molecolare. Poiché il assotomia nervo facciale è minimamente invasiva e ben tollerato, può essere utilizzato in un'ampia varietà di topi geneticamente modificati. Inoltre, questo modello di intervento può essere utilizzato per analizzare l'efficacia dei trattamenti di lesioni dei nervi periferici. Lesione del nervo facciale fornisce un mezzo per indagare non solo i motoneuroni, ma anche le risposte del microambiente centrale e periferica gliali, il sistema immunitario, e bersaglio muscolatura. Il modello di lesione del nervo facciale è un modello di lesione dei nervi periferici ampiamente accettato che serve come un potente strumento per studiare lesioni nervose e rigenerazione.
Introduction
Esistono molti modelli di lesione del nervo periferico, ma che si distingue per lo studio dei motoneuroni è il modello nervo assotomia facciale. Il nervo facciale, noto anche come VII nervo cranico, ha origine nel ponte e innerva i muscoli espressione facciale 1,2. In questo protocollo chirurgico, il nervo facciale è esposta alla sua uscita dal forame stylomastoid e tagliato o schiacciato. La gravità delle lesioni del nervo può essere classificato secondo le Sunderland 3 classificazioni, che differenzia il pregiudizio in base l'integrità del assoni, endoneurium, perineurio, e epinevrio, che sono strati di tessuto connettivo che in sequenza avvolgono i fasci degli assoni. Nella lesione da schiacciamento (assonotmesi), gli assoni sono interrotti, ma il perineurio e epinevrio sono conservati. Recupero funzionale completa da schiacciamento del nervo facciale si verifica in circa 11 giorni perché la guaina del nervo intatto funge da canale all'interno del quale gli assoni ricrescere 4,5. SulD'altra parte, nel pregiudizio taglio (neurotmesi), gli assoni e tutti i 3 strati di tessuto connettivo sono reciso, e l'intero nervo distale deve ricrescere per ripristinare muscolatura innervazione. Riconnessione chirurgica del epinevrio è spesso eseguita in pazienti umani con lesioni del nervo transection, tuttavia i risultati di recupero sono raramente ottimali. Sono necessarie ulteriori studi per capire il motivo per cui il coraggio non riesce a ricrescere al suo obiettivo e quali terapie possono essere impiegati per migliorare e accelerare il processo di rigenerazione.
Ci sono molti vantaggi a studiare lesioni nervose utilizzando il modello di nervo assotomia facciale. In primo luogo, la procedura di nervo assotomia facciale è veloce, facile e altamente riproducibile; e la paralisi risultante dei muscoli facciali non influisce funzioni vitali ed è ben tollerata dall'animale. Perché questo è un modello di lesione del nervo cranico, studiando i corpi cellulari dei motoneuroni è semplificata, poiché i motoneuroni risiedono in una popolazione relativamente omogenea in the nucleo motoria facciale nel ponte. La popolazione differisce in base al modello subnucleare all'interno del nucleo motoria facciale, in quanto vi sono sette subnuclei ogni specifico innervano uno specifico gruppo di muscoli, quindi le differenze subnucleari in risposta a assotomia può influire risultati 2,6,7.
Uno dei principali vantaggi del modello di lesione del nervo facciale è che il lato unaxotomized può servire come controllo interno accoppiato perché l'innervazione nervo è altamente simmetrica e non c'è alcuna interferenza tra i nuclei motori facciali 8. Un altro vantaggio di questo metodo chirurgico è la mancanza di un trauma diretto al sistema nervoso centrale o rottura della barriera emato-encefalica 9. Complicazioni, come eccessivo sanguinamento e le infezioni sono rare con questa procedura.
Una varietà di analisi può essere effettuata per valutare la risposta fisiologica al danno del nervo. Il recupero del riflesso corneale dell'occhio e attività whisker può essere utilizzato come comportamentalemisura di 10,11 funzionale recupero. Registrazione video di attività vibrisse è attualmente il metodo più efficace per individuare il recupero di innervazione del nervo facciale 12,13. Dopo eutanasia, analisi istologica del tronco cerebrale può essere eseguita sui corpi cellulari motoneuroni nel nucleo motore facciale. Il nucleo del motore del viso è suddiviso in sette subnuclei, ognuno specifico per certi muscoli facciali, che consente per l'esame differenziale delle risposte al danno 2,6. Motoneuroni facciali possono essere contati per quantificare la sopravvivenza delle cellule, o immunoistochimica possono essere utilizzati per identificare biomarcatori e specifiche popolazioni cellulari 14. Il nucleo del motore del viso può essere in paraffina precisione con cattura laser per l'analisi molecolare della risposta cellulare al danno del nervo 15,16. Impatti della assotomia nervo facciale possono essere analizzati nella corteccia motoria 17,18. Inoltre, il nervo può essere sezionato per studiare degenerazione walleriana 19 oassone rigenerazione 20, ed i muscoli possono essere rimosse per studiare giunzioni neuromuscolari 21. Il assotomia nervo facciale può anche essere usato per studiare gli allegati centrali e periferici cellule gliali 22, indirizzare muscolatura 21, e il sistema immunitario di risposta 23. Anche se molto è stato fatto nello studio del modello di assotomia nervo facciale 24, un ulteriore studio di lesioni dei nervi periferici è necessario perché danno del nervo è un problema significativo per i pazienti e trattamenti attuali non riescono a produrre risultati ottimali. Questo modello è un potente strumento per l'esame della risposta fisiologica di lesioni nervose e analizzare l'efficacia delle terapie di rigenerazione nervosa.
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Protocol
Tutte le procedure eseguite sono approvati dalla Scuola di Medicina Istituzionale Animal Care and Use Committee Indiana University e seguono Istituto Nazionale di linee guida di salute.
1. Tecnica chirurgica
- Mantenere una tecnica asettica durante questa procedura utilizzando guanti sterili, strumenti, e un campo chirurgico sterile, secondo le linee guida NIH 25. Sterilizzare gli strumenti prima di iniziare l'intervento chirurgico da loro autoclave (vedi Tabella di reagenti specifici / Attrezzature per l'elenco completo). Utilizzare uno sterilizzatore perle di vetro per sterilizzare strumenti durante l'operazione.
2. Anestesia e preparazione
- Anestetizzare il mouse in una scatola anestesia con una miscela di 0,9 L / min ossigeno e 2,5% isoflurano utilizzando un sistema vaporizzatore isoflurano veterinaria. Assicurarsi che il mouse non risponde ai cambiamenti di posizione del corpo prima di rimuoverlo dalla scatola.
- Applicare una pomata oftalmica al mouGli occhi di SE per proteggerli dalla disidratazione.
- Passare il flusso di gas dalla casella a cono. Posizionare il mouse esattamente sul lato sinistro su un tappetino riscaldato coperto da un tappetino chirurgica e carta assorbente con panca il naso e la bocca all'interno del cono. Monitorare costantemente il ritmo del respiro del mouse e la velocità e regolare i livelli isoflurano come necessario (tra 2,5-3% isoflurano) per mantenere un adeguato livello di anestesia, e utilizzare la punta pizzico reflex per confermare sedazione totale.
3. Approccio chirurgico
- Allineare e mettere a fuoco lo stereoscopio con il campo operatorio. Regolare il cono e il nastro verso il basso in modo che sia posizionato lungo il bordo del campo visivo.
- Con il mouse sdraiato sul suo lato sinistro, il nastro il bordo dell'orecchio destro al cono, esponendo l'area dietro l'orecchio in cui verrà effettuata l'incisione. Assicurarsi che la vena auricolare posteriore percorre orizzontalmente l'orecchio. Si noti che il corretto posizionamento di tegli animali e taping dell'orecchio sono fondamentali al fine di trovare rapidamente il nervo facciale.
- Bagnare il pelo sopra e dietro l'orecchio con il 70% di etanolo e radere il sito chirurgico con una lama di rasoio o bisturi. Pre-bagnare il pelo rende la rasatura più facile in questa posizione anatomica.
- Pulire la pelle con una soluzione di iodio, come Betadine lavaggio chirurgico (7,5% povidone-iodio), seguito da 70% di etanolo. Ripetere questa pulizia due volte di più per disinfettare accuratamente la zona.
- Per determinare dove fare l'incisione, tracciare la vena auricolare posteriore dall'orecchio caudalmente alla zona posteriore alla protuberanza orecchio. Utilizzando forbici primavera, fare un 4 millimetri un'incisione 2 - 3 mm posteriormente alla protuberanza.
- Sezionare attraverso il grasso sottocutaneo e la fascia con smussa. Evitare il taglio diretto con le forbici, perché i vasi sanguigni o tessuto muscolare possono essere facilmente danneggiati.
- In caso di emorragia, applicare pressione al sito chirurgico con un tampone di cotone sterileper almeno 30 secondi. Se si verifica una significativa perdita di fluido, iniettare il mouse per via intraperitoneale con fino a 0,5 ml di soluzione salina sterile allo 0,9% utilizzando un ago G 25 o 27.
- Utilizzare diversi punti di riferimento chiave, il nervo accessorio spinale, canale uditivo, e anteriore del muscolo digastrico (descritto di seguito), per individuare il nervo facciale. Sezionare intorno a questi punti di riferimento fino a quando sono visualizzati i rami del nervo facciale. Il nervo apparirà come una significativa struttura di solido bianco quando viene rivelato e uno strato di fascia aderisce agli strutture sottostanti.
- Trova il nervo accessorio spinale, che viaggia dalla porzione caudale del cranio per innervare il muscolo trapezio, una volta che il grasso sottocutaneo e la fascia sono stati sezionati. Il nervo facciale è profondo al nervo accessorio spinale.
- Trovare il canale uditivo cartilagineo che sembra bianco perlato e può essere visto rostrale al nervo facciale.
- Trova il ventre muscolare del muscolo digastrico anteriore, che si trova in cima e caudal al nervo facciale.
- Quando i principali rami del nervo facciale sono visualizzati, li risalire dorsale di trovare la loro origine dal forame stylomastoid. Utilizzando punta fine Dumont pinze # 5/45 di tenere il sito chirurgico aperto, far avanzare le punte primavera forbice seguito il percorso del nervo, quindi spostare la pinza dorsale per mantenere la nuova area Advanced Open.
- Visualizza il tronco del nervo facciale con zigomatico, buccale, e rami mandibolari marginali a questo punto.
NOTA: Il ramo temporale si troverà più vicino al forame. I rami marginali nervo mandibolare nelle sue parti superiore e inferiore più vicino alla mascella, pertanto quei rami nervose non saranno visibili a questo livello.- Se si esegue una resezione del nervo, di stabilizzare il nervo delicatamente con le pinze punta fine e tagliare il nervo con le forbici a molla. Evitare di applicare troppa trazione al nervo con le pinze per evitare avulsing nervo dal tronco encefalico. Spingerei monconi distanti, o tagliare e rimuovere una porzione del nervo distale per garantire che nessun riconnessione può verificarsi.
- Se si esegue una lesione da schiacciamento, utilizzare Dumont # 5/45 pinze per comprimere il nervo per 30 secondi con una pressione costante a recidere tutti gli assoni, quindi ripetere questa cotta in un secondo angolo perpendicolare al primo sito cotta. Evitare l'applicazione di quantità variabili di pressione durante la 30 sec cotta, altrimenti il danno non sarà coerente tra gli animali.
4. Chiusura e recupero
- Riposizionare il grasso e muscoli sopra le strutture sottostanti.
- Approssima i bordi dell'incisione e chiudere la ferita utilizzando un clip ferita 7,5 millimetri. Suture o colla sono accettabili per la chiusura della ferita. Analgesici postoperatoria possono essere forniti in questo momento.
- Rimuovere il nastro dal orecchio del mouse. Spegnere il flusso isoflurano e lasciare il mouse per respirare ossigeno puro per 30 secondi a 1 minuto. Plasso il mouse in una gabbia vuota senza biancheria da letto per recuperare da anestesia.
- Quando il mouse è recuperato, esaminare il suo comportamento per i segni di conferma della paralisi facciale. I baffi saranno paralizzati e angolati verso la guancia, il naso viene deviato, e l'occhio non lampeggia in risposta ad un soffio d'aria.
- Animali Casa congiuntamente dopo l'intervento chirurgico se sono di sesso femminile. Evitare ospitano topi maschi congiuntamente perché sono più aggressivi e tendono a rimuovere forzatamente clip ferita del loro cagemate, che porta a infezioni. Fornire analgesici postchirurgiche in questo momento, se necessario.
- Monitorare i topi una volta al giorno per diversi giorni dopo l'operazione per assicurarsi che nessuna infezione o altre complicanze si verifica dopo l'intervento. Rimuovere clip ferita 7 - 10 giorni dopo l'intervento chirurgico, se non sono caduti fuori da sè.
- Applicare lubrificante pomata occhio l'occhio interessato al giorno per prevenire le complicanze corneali, sia fino a quando il riflesso corneale occhio è recoperti o fino eutanasia.
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Representative Results
Dopo aver eseguito l'assotomia nervo facciale, perdita motoneuroni si verifica come risultato della lesione. Sopravvivenza dei motoneuroni dopo l'infortunio dipende da molte variabili, come il sesso, l'età degli animali al momento della chirurgia, e il timepoint in cui i conteggi motoneurone sono fatto, e la Moran e Graeber revisione 24 e Jinno e Yamada recensione 22 sia riepilogare i dati di sopravvivenza dei motoneuroni. In genere, circa l'86% dei motoneuroni sopravvivere a 28 giorni dopo l'assotomia 14,15,26. Cinetica di perdita motoneurone sono descritti in Serpe et al. 2000. La figura 1 illustra la variazione nella sopravvivenza dei motoneuroni in più topi geneticamente modificati. Non si osservano differenze significative nella conta del motoneurone facciale del lato di controllo, che indica che le alterazioni genetiche non influiscono conta basale. Rispetto alla sopravvivenza motoneurone in topi wild type (84% ± 2,0; la figura 1A, D), significativa perdita di cellule si osserva in un modello murinodella sclerosi laterale amiotrofica (SOD1 G93A; 68% ± 1; la figura 1B, E) così come il immunodeficienti-ricombinazione attivando gene-2 topo knockout (RAG-2 - / -; 57% ± 2,5; la figura 1C, F) 27 .
Figura 2 mostra la tecnica laser cattura microdissezione applicata al nucleo motore facciale. L'intero nucleo motore del viso può essere catturato (Figura 2A-C), o subnuclei può essere raccolto separatamente (Figura 2D-F). Per una maggiore precisione, motoneuroni possono essere catturati singolarmente, e il restante neuropilo possono essere raccolti per l'analisi (Figura 2G-I). Figura 3 illustra i risultati qPCR del materiale RNA estratto da campioni subnucleari confronto la ventromediale e ventrolaterale subnuclei. I quattro geni testati, β II tubulina, della crescita associati proteina-43 (Gap-43), hemopoietic- e-neurologica espresso sequenza-1 (HN1), e il cervello-derived neurotrophic factor (BDNF) sono tutti associati con la risposta rigenerazione dei nervi e ci sono interessanti differenze tra i due subnuclei ei loro profili di espressione genica dopo assotomia 16.
Figura 1. Rappresentante sezioni nucleo motore viso coronali colorate con tionina e quantificati 28 giorni dopo facciale resezione del nervo. Nuclei motori del viso sono indicati da (A, D) WT, (B, E) SOD1 G93A, e (C, F) RAG- 2 - / - mice (lato di comando, lato axotomized). Bar scale = 120 micron. Questa cifra è stata modificata da 27. Clicca qui per vedere una versione più grande di thè figura.
Figura 2. Laser microdissezione del nucleo motore del viso. (A) Sezione tionina macchiato di nucleo axotomized facciale, (B), con parziale microdissezione laser del nucleo facciale axotomized, e (c) Raccolta di laser microdissezione dei tessuti. Un modello (D) del subnuclei stato sovrapposto sullo schermo del computer per identificare il ventromediale e ventrolaterale subnuclei viso per laser microdissezione (E, F). Motoneuroni facciali erano basate su laser microdissezione loro morfologia con nucleo visibile e nucleolo (* indica motoneuroni, G, H), mentre frammenti corpo cellulare FMN, indicati dalle frecce (G), sono stati laser microdissezionate separatamente e smaltiti per eliminare FMN mRNA nel neuropilo samples. Dopo che tutti i frammenti FMN e corpo cellulare sono stati raccolti, il rimanente tessuto nucleo facciale era microdissezione laser come campione neuropil (I). Bar scale = 100 micron. Questa cifra è stata modificata a partire dal 16. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Pro-rigenerazione e l'espressione dell'mRNA pro-sopravvivenza nel ventromediale (VM) e ventrolaterale (VL) regioni subnucleari motore facciali seguenti facciale assotomia nervo. Cento medio di espressione dell'mRNA ± SEM nel transected VM e VL subnuclei viso rispetto al subnuclei di controllo non operato (AD). Time-corso di espressione dell'mRNA include alcun pregiudizio (0), 3, 7, 14, e 28 DPO per βII tubulina (A (B), HN1 (C), e BDNF (D). # Rappresenta differenze significative di VL rispetto al VM, a p <0,05. Questa cifra è stata modificata a partire dal 16.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Leica | M60 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | 15-952 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors - straight/sharp/8.5 cm/5 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15003-08 | Sterilize before use |
| Dumont #5/45 forceps - standard tips/angled 45°/Dumoxel/11 cm | Fine Science Tools | 11251-35 | Sterilize before use |
| Michel suture clips - 7.5 mm x 1.75 mm | Fine Science Tools | 12040-01 | Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use |
| Hagenbarth cross action wound clip applier 5" | George Tiemann & Co | 160-910 | Used to apply wound clip, sterilize before use |
| Michel suture clip applicator & remover - For 7.5 mm clips | Fine Science Tools | 12029-12 | Used to remove wound clip |
| 0.9% Sodium chloride injection, USP | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Betadine, 16 oz, with dispenser | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% Ethanol | |||
| Glass bead sterilizer |
References
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