Medicine

面神经干切断小鼠：模型，研究运动神经元损伤反应

Published: February 23, 2015 doi: 10.3791/52382

Deborah N. Olmstead^1,2, Nichole A. Mesnard-Hoaglin³, Richard J. Batka^1,2, Melissa M. Haulcomb^1,2, Whitney M. Miller^1,2, Kathryn J. Jones^1,2

¹Anatomy and Cell Biology, Indiana University School of Medicine, ²Research and Development Services, Richard L. Roudebush VA Medical Center, ³Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois, Chicago

Abstract

这种手术协议的目标是从茎乳孔露出面神经，它支配的面部肌肉，在其出口处，要么切割或粉碎它来诱导外周神经损伤。这种手术的优点是它的简单性，高再现性，以及缺乏对从后续面神经麻痹生命功能或流动性的效果，因此导致相对温和的手术结果相比其他神经损伤的模型。使用颅神经损伤模型的一个主要优点是，运动神经元驻留在一个相对同质种群的面部运动核在脑桥，简化了运动神经元细胞体的研究。因为面部神经支配的对称性质和缺乏面部运动核之间的串扰的，操作可以单方面与unaxotomized侧作为配对的内部控制进行的。各种分析术后可以进行以驴S中的生理反应，其中的细节超出了本文的范围。例如，肌肉功能的恢复可以作为行为标记神经支配，或运动神经元可以被量化以测量细胞的存活。此外，运动神经元能够精确地使用激光显微切割进行分子分析捕获。因为面部神经切断是微创和良好的耐受性，它可以用于在多种转基因小鼠。另外，该手术模型可用于分析的外周神经损伤的治疗的有效性。面神经损伤提供了一种装置，用于调查不仅运动神经元，但中枢和外周神经胶质的微环境，免疫系统，和目标肌肉组织也响应。面神经损伤模型是被广泛接受的外周神经损伤模型充当一个强有力的工具用于研究神经损伤和再生。

Introduction

许多周围神经损伤模型存在，但一个突出的运动神经元的研究是面神经干切断模型。面神经，也被称为脑神经七，起源于脑桥和支配的面部表情^1,2的肌肉。在此手术协议，面神经在其出口处从茎乳孔露出，或者切断或粉碎。神经损伤的严重性可以分类以下桑德兰³的分类，其中区分基于所述轴突，神经内膜，神经束膜和外膜的完整性的损伤，这是结缔组织层，其依次绕轴突束包裹。在挤压伤（axonotmesis），轴突被切断，但神经束膜和外膜被保留。从面神经压榨完整的功能恢复发生在11天左右，因为完整的神经鞘作为管道内其轴突继续生长^4,5。在另一方面，在该切伤（神经断裂），轴突和所有3结缔组织层被切断，并且整个远端神经必须重新生长，恢复肌肉的神经支配。往往是在人类患者神经切断伤进行神经外膜手术重新连接，但是复苏的结果是很少最佳。进一步的研究是需要理解为什么神经未能重新生长到它的目标和什么疗法可用于改善和加速再生处理。

有许多优势，使用面神经干切断模型研究神经损伤。一，面神经干切断过程快速，简便，具有很强的可重复性;和面部肌肉的合成瘫痪不会影响重要功能，是深受动物的耐受性。因为这是一个脑神经损伤模型，研究了运动神经元细胞体被简化，因为运动神经元驻留在一个相对同质种群在第Ë面部运动核在脑桥。人口不基于面部运动核中的亚核图案不同，因为有七个亚核每个特定于支配肌肉的特定组，因此响应于干切断亚核的差异可能会影响结果^-2,6,7-。

面神经损伤模型的一个主要好处是，unaxotomized方可以作为一个配对的内部控制，因为神经支配是非常对称的，还有就是面部运动核⁸之间没有串扰。使用这种手术方法的另一个优点是，缺乏直接创伤至CNS或血脑屏障⁹中断。并发症，如出血过多和感染是罕见的这一程序。

各种分析可以被执行以评估对神经损伤的生理反应。眼眨眼反射和晶须活性的恢复可以作为一个行为测量功能恢复^10,11。触须活动的录像是目前最有效的方法检测面神经支配^12,13的恢复。安乐死后，可以在运动神经元胞体的面部运动核内进行脑干组织学分析。面部运动核被细分成七个亚核，每个特定的某些面部肌肉，从而为应对不同检查损伤^2,6。面部运动神经元进行计数来定量细胞存活，或免疫组织化学可用于鉴定生物标志物和特定细胞群^14。面部运动核可以利用激光捕获到神经损伤^15,16的细胞反应的分子分析准确显微切割。面神经干切断的影响，可以在运动皮层^17,18进行分析。此外，神经可以解剖研究沃勒变性或¹⁹轴突再生²⁰和肌肉能够被去除以研究神经肌肉接头^21。面神经切断，也可以用来研究所附中枢和外周神经胶质细胞^22，目标肌肉^21，以及免疫系统反应^23。虽然取得了显着的研究面神经切断模型^24，是必需的外周神经损伤的进一步研究，因为神经损伤是为患者一个显著问题和目前的治疗不能产生最佳的效果。该模型是一种强大的工具，用于检查到神经损伤的生理反应和分析神经再生疗法的有效性。

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Protocol

执行所有的程序都是由印第安纳大学医学院实验动物管理和使用委员会的批准，并按照卫生指引研究院。

1.手术技巧

这个过程通过使用无菌手套，仪器，并根据美国国立卫生研究院指南²⁵的无菌外科领域中保持无菌技术。消毒高压灭菌他们开始在手术前的工具（ 见表特定试剂/设备的完整列表）。使用玻璃珠灭菌的操作过程中，以消毒的工具。

2.麻醉和准备

麻醉小鼠在麻醉箱以0.9升/分钟的氧气和2.5％的异氟醚用兽医异氟烷蒸发器系统的混合物。确保鼠标并没有改变身体姿势从包装盒中取出前作出回应。
应用眼药膏谅解备忘录SE的眼睛以保护他们免受干燥。
从箱气流切换到鼻锥。将鼠标正视在其左侧上的加热垫覆盖有手术垫和吸收长凳纸与它的鼻子和嘴的锥体内。连续监测小鼠的呼吸节奏和速度，并调整异氟烷水平根据需要（2.5之间 - 3％异氟醚）以维持麻醉的适当水平，并且使用脚趾捏反射来确认总镇静。

3.手术方法

对齐并与外科领域关注的实体镜。调整鼻锥和磁带下来，以便它位于沿视野的边缘。
用鼠标卧在其左侧，用胶带将右耳到鼻锥体的边缘，在那里露出的切口将作出在耳后的区域。确保耳后静脉水平会穿过耳朵。需要注意的是T的正确位置他的动物和耳朵的录像都是为了快速找到面神经的关键。
润湿毛发上，并用70％乙醇在耳朵后面，刮胡子使用剃刀或手术刀刀片的外科手术部位。预湿的皮草，使剃须在这个解剖位置比较容易。
清洁与碘溶液，如聚维酮碘的外科擦洗（7.5％聚维酮碘），随后用70％乙醇的皮肤。重复该清洗2次以上，以彻底消毒的区域。
确定在何处作出切口，从耳尾端跟踪耳后静脉的区域后方的耳突起。使用弹簧剪刀，制作4毫米的切口2 - 3毫米后的突起。
通过解剖用钝性分离皮下脂肪和筋膜。避免直接切削用剪刀因为血管或肌肉组织很容易损坏。
如果发生出血，将压力施加到手术部位用无菌棉签为至少30秒。如果发生显著流体损失，以达到的用25或27G的针的无菌0.9％盐溶液0.5毫升腹膜内注入小鼠。
使用几个键标，副神经，耳道，和前二腹肌（下面描述），以定位面神经。剖析围绕这些地标，直到面神经的分支可视化。当它被发现的神经将显示为显著固体白色组织和一层筋膜附着到下面的结构。
1. 发现副神经，从头骨的尾部部分，其行进到支配斜方肌，一旦皮下脂肪和筋膜已解剖。面神经是深副神经。
2. 发现软骨耳道看起来珍珠白，并且可以看出延髓面神经。
3. 发现前二腹肌的肌腹的位于顶部和caudal面神经。
如果面神经的主要分支的可视化，跟踪他们背来找到自己的出身，从茎乳孔。用细尖杜蒙钳＃四十五分之五保持手术部位的开放，推进下面的神经路径的春天剪刀的提示，然后将镊子背侧，以保持新的先进地区开放。
可视面神经与颧骨，颊的躯干，并且在这一点上下颌缘分支。
注：颞支会发现接近孔。边际下颌神经分支到其上，下部分更靠近钳口，从而那些神经分支将不会在这个水平可见的。
1. 如果执行神经切断，轻轻稳定神经的精尖钳和切割神经与弹簧剪刀。避免将过多的牵引神经与血管钳，以防止avulsing从脑干神经。推树桩相互远离，或切割并移除远端神经的一部分，以确保没有重新连接可以发生。
2. 如果执行一个挤压伤，利用蒙特＃四十五分之五镊子压缩神经为30秒，使用恒定压力以切断所有轴突，则在垂直于第一粉碎部位的第二角度重复此压碎。避免将压力可变数量的30秒美眉期间，否则伤害将是动物之间的不一致。

4.关闭和恢复

重新定位的脂肪和肌肉在底层结构。
近似切口的边缘，并使用7.5毫米伤口夹闭合伤口。缝线或胶水还可以接受的伤口闭合。手术后止痛药可以在此时提供。
取下鼠标的耳朵磁带。关掉异氟烷流动，并允许小鼠呼吸纯氧为30秒至1分钟。 PL王牌鼠标在一个空笼没有被褥从麻醉中恢复。
当鼠标被回收，检查其面瘫的验证标志的行为。胡须就会瘫痪和角度背对着脸颊，鼻子就会偏离，并且眼睛也不会因空气的粉扑闪烁。
房子动物联合手术后，如果他们是女性。避免住房雄性小鼠联合，因为他们更积极，而且往往强行删除其cagemate的伤口剪辑，从而导致感染。如有必要，提供手术后止痛剂，此时，。
监测小鼠，每天一次，连续几天的操作后，以确保没有感染或其他并发症发生术后。手术后10天，如果他们没有倒下了自己 - 删除伤口片段7。
适用于润滑眼膏，以患眼每天以防止角膜并发症，无论是直到眨眼反射是重覆盖或直到安乐死。

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Representative Results

之后进行的面部神经切断，运动神经元的损失发生的损伤的结果。损伤后运动神经元的生存取决于许多变量，如性别，年龄的动物在手术时间，并在其中运动神经元计数完成的时间点，与莫兰和Graeber回顾²⁴和神野与山田回顾²²既总结了运动神经元存活的数据。通常情况下，约86％的运动神经元的28天后干切断^14,15,26生存。运动神经元损失的动力学在Serpe 等人进行了描述。2000 图1示出在多个转基因小鼠中的变化在运动神经元的存活。无显著差异在控制侧的面部运动神经元计数观察到的，这表明该基因变异不会影响基线计数。相比于野生型小鼠的运动神经元存活（84％±2.0; 图1A，D）中，显著细胞损失在小鼠模型中观察到的肌萎缩性侧索硬化的（SOD1 ^G93A; 68％±1; 图1B中的E），以及免疫缺陷的重组活化基因-2敲除小鼠（RAG-2 - / - ; 57％±2.5; 图1C中的^F）27 。

图2演示了施加到面部运动核的激光捕获显微切割技术。整个面部运动核可以被捕获（ 图2A-C）中，或亚核可以分别收集（ 图2D-F）。为了更加精确，运动神经元可单独捕获，而其余神经纤维可被收集用于分析（ 图2G-1）。图3示出了从比较腹内侧的亚核样品和腹外侧亚核提取的RNA的材料的定量PCR结果。四种基因测试，β微管蛋白_二 ，相关蛋白-43（GAP-43）的增长，hemopoietic-和神经表达序列-1（HN1）和脑源性神经营养因子（BDNF）都与神经再生的响应相关联，并有干切断¹⁶ 之后两个亚核和它们的基因表达谱之间有趣的差异。

图1.代表冠状面运动核切片染色与硫堇和量化面神经损伤后28天，面部运动核是由（A，D）WT，（B，E）SOD1 ^G93A，和（C，F）RAG-显示2 ^{- / -}小鼠（对照侧，视神经切断后侧）。比例尺= 120微米。这个数字已经被修改^27。请点击此处查看次的放大版本。是的身影。

面部运动核图2.激光显微切割。（A）金黄地鼠面神经核，（B）与金黄地鼠面神经核的部分激光显微切割和激光显微切割组织（C）收集硫堇染色部分。在亚核的模板（D）是叠加在电脑屏幕上识别腹和腹外侧面部亚核激光显微切割（E，F）。面部运动神经元进行了激光显微切割基于其形态学用可见细胞核和核仁（*表示运动神经元，G，H），而FMN细胞体的片段，由箭头（G）中所指出的，被激光分别显微切割和处理，以消除FMN的mRNA在神经毡samples。后，收集所有的FMN和细胞体的片段，其余面神经核的组织是激光显微切割的神经纤维样品（I）中 。比例尺= 100微米。这个数字已经被修改^16。请点击此处查看该图的放大版本。

图3.亲再生和促存活基因表达的腹内侧（VM）和腹外侧（VL）以下的面神经干切断的面部运动亚核地区。mRNA表达的平均百分比±SEM在横断VM和VL面部亚核相对的不操作控制亚核（AD）。时间当然mRNA的表达，包括无损伤（0），3，7，14，和28 DPO的βII微管蛋白（A >），GAP-43（B）中，HN1（C）和BDNF（D）中。＃表示VL的相比VM显著的差异，当p <0.05。这个数字已经被修改^16。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereo microscope	Leica	M60
Labeling tape	Fisher Scientific	15-952
Vannas-Tübingen spring scissors - straight/sharp/8.5 cm/5 mm cutting edge	Fine Science Tools	15003-08	Sterilize before use
Dumont #5/45 forceps - standard tips/angled 45°/Dumoxel/11 cm	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
Michel suture clips - 7.5 mm x 1.75 mm	Fine Science Tools	12040-01	Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use
Hagenbarth cross action wound clip applier 5"	George Tiemann & Co	160-910	Used to apply wound clip, sterilize before use
Michel suture clip applicator & remover - For 7.5 mm clips	Fine Science Tools	12029-12	Used to remove wound clip
0.9% Sodium chloride injection, USP	Hospira	0409-4888-10
Betadine, 16 oz, with dispenser	Fisher Scientific	19-027132
70% Ethanol
Glass bead sterilizer