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Medicine

Facial Nerve Axotomie bei Mäusen: Ein Modell zur Motoneuron Reaktion auf eine Verletzung Studieren

doi: 10.3791/52382 Published: February 23, 2015

Abstract

Ziel des chirurgischen Protokolls ist es, die Gesichtsnerven, die die Gesichtsmuskulatur innerviert, bei seinem Austritt aus der Foramen stylomastoideum aussetzen und geschnitten bzw. zermahlen, um periphere Nervenverletzung zu induzieren. Vorteile dieser Operation sind seine Einfachheit, hohe Reproduzierbarkeit und der fehlenden Wirkung auf die Lebensfunktionen oder Mobilität aus den nachfolgenden Gesichtslähmung, was zu einem relativ milden Operationsergebnis im Vergleich zu anderen Nervenverletzung Modellen. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung eines Hirnnervenverletzung Modells ist, dass die Motoneuronen befinden sich in einem relativ homogenen Population im Gesichts motorischen Kern in der Brücke, die Vereinfachung der Untersuchung der Motoneuronenzellkörpern. Aufgrund der symmetrischen Art der Gesichtsnerv innerviert und das Fehlen von Übersprechen zwischen den Gesichts motorischen Kernen kann der Betrieb einseitig mit der unaxotomized Seite als gekoppeltes interne Kontrolle dient geführt werden. Eine Vielzahl von Analysen können postoperativ zu beurteilen, durchgeführt werdens die physiologische Reaktion, deren Einzelheiten über den Rahmen dieses Artikels. Zum Beispiel kann die Wiederherstellung der Muskelfunktion als Verhaltens Marker für reinnervation dienen oder die Motoneurone quantifiziert, um das Überleben der Zellen gemessen werden. Zusätzlich können die Motoneuronen genau mittels Laser Mikrodissektion für die molekulare Analyse eingefangen werden. Da der Gesichtsnerven Axotomie ist minimal-invasiv und gut verträglich, kann es zu einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen verwendet werden. Auch kann diese Operation Modell verwendet, um die Wirksamkeit des peripheren Nervenverletzung Behandlungen zu analysieren. Gesichtsnervenverletzung liefert ein Mittel für die Untersuchung nicht nur Motoneuronen, sondern auch die Reaktionen des zentralen und peripheren glial Mikroumgebung, das Immunsystem, und Ziel Muskulatur. Der Gesichtsnervenverletzung Modell ist ein weithin akzeptiertes periphere Nervenverletzung Modell, das als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung Nervenverletzung und Regeneration dient.

Introduction

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Viele periphere Nervenverletzung Modelle existieren, aber eine, die sich für das Studium der Motoneuronen steht, ist der Gesichtsnerv Axotomie Modell. Der Gesichtsnerv, der auch als Hirnnerven VII bekannt, ihren Ursprung in der Pons und innerviert die mimische Muskulatur 1,2. In diesem chirurgischen Protokoll wird die Gesichtsnerven bei seinem Austritt aus der Foramen stylomastoideum ausgesetzt und geschnitten bzw. zerkleinert. Der Schweregrad der Nervenverletzung kann im Anschluss an die Sunderland 3 Klassifikationen, die die Verletzungen auf der Grundlage der Unversehrtheit der Axone, Endoneurium, Perineurium und Epineurium unterscheidet, das Bindegewebe Schichten, die nacheinander um die Axon Bündel zu wickeln sind, klassifiziert werden. Im Quetschverletzung (Axonotmesis) werden die Axone durchtrennt, aber das Perineurium und Epineurium erhalten bleiben. Komplette funktionelle Wiederherstellung von Gesichtsnervenquetschung tritt in etwa 11 Tage, weil die intakten Nervenscheide dient als Kanal, in dem die Axone wieder nachwachsen 4,5. Auf dieAndererseits ist in der Schnittverletzung (Neurotmesis), die Axone und alle 3 Bindegewebsschichten durchtrennt, und der gesamte distale Nerven muss nachwachsen zu Muskulatur Innervation wiederherzustellen. Chirurgische Wiederverbindung der Epineurium wird häufig in menschlichen Patienten mit Nervendurchtrennung Verletzungen durchgeführt, aber die Erholung Ergebnisse sind selten optimal. Weitere Studien sind erforderlich, um zu verstehen, warum der Nerv nicht zu seinem Ziel wieder wachsen und welche Therapien eingesetzt zur Verbesserung und Beschleunigung der Regenerationsprozess werden.

Es gibt viele Vorteile, um das Studium Nervenverletzung mit dem Gesichtsnerv Axotomie Modell. Erstens ist die Gesichtsnerven Axotomie Verfahren schnell, einfach und sehr gut reproduzierbar; und die daraus resultierende Lähmung der Gesichtsmuskeln hat keine Auswirkungen auf Vitalfunktionen und ist gut mit dem Tier toleriert. Da dies eine Hirnnervenverletzungsmodell, das Studium der Motoneuronenzellkörpern wird vereinfacht, da die Motoneuronen befinden sich in einer relativ homogenen Bevölkerung in the Gesichts motorischen Kern in der Pons. Die Bevölkerung ist auf der Grundlage der subnuklearen Muster innerhalb des Gesichts motorischen Kern abweichen, da gibt es sieben Unterkernen jeweils spezifisch für eine bestimmte Gruppe von Muskeln innervieren, so subnuklearen Unterschiede in Reaktion auf Axotomie kann Auswirkungen Ergebnisse 2,6,7.

Ein großer Vorteil der Gesichtsnervenverletzung Modell ist, dass die unaxotomized Seite kann als gekoppeltes interne Kontrolle dienen, weil der Nerv innerviert ist hochsymmetrisch und es gibt kein Übersprechen zwischen den Gesichts motorischen Kernen 8. Ein weiterer Vorteil der Verwendung dieses chirurgischen Verfahrens ist das Fehlen einer direkten Trauma des ZNS oder Störung der Blut-Hirn-Schranke 9. Komplikationen wie starke Blutungen und Infektionen sind selten, mit diesem Verfahren.

Eine Vielzahl von Analysen können durchgeführt werden, um die physiologische Reaktion auf eine Nervenverletzung zu bewerten. Die Erholung des Auges Lidschlussreflexes und Whisker-Aktivität kann als Verhaltens verwendet werdenMaß für die funktionelle Erholung 10,11. Video-Aufzeichnung der Tasthaare Tätigkeit ist derzeit der leistungsstärkste Verfahren zum Nachweis von Wiederherstellung von Gesichtsnerven Innervation 12,13. Nach Euthanasie kann histologische Untersuchung des Hirnstamms zu den Motoneuronen Zellkörper im Gesichts motorischen Kern durchgeführt werden. Der Gesichts motorischen Kern ist in sieben Unterkernen, jeder für bestimmte Gesichtsmuskeln unterteilt, so dass für Differenz Prüfung der Antworten auf Verletzungen 2,6. Gesichtsmotoneuronen können gezählt werden, um das Überleben der Zelle zu quantifizieren oder die Immunhistochemie verwendet werden, um Biomarker und spezifische Zellpopulationen 14 zu identifizieren. Der Gesichts motorischen Kern exakt mit Laser-Capture für die molekulare Analyse der zellulären Antwort auf Nervenverletzung 15,16 mikrodissektiert werden. Auswirkungen des Gesichtsnervs Axotomie kann im motorischen Kortex 17,18 analysiert werden. Auch kann der Nerv seziert Waller-Degeneration zu untersuchen 19 oderAxonregeneration 20, und die Muskeln können entfernt werden, um neuromuskulären Endplatten 21 zu studieren. Der Gesichtsnerv Axotomie kann auch verwendet werden, um die zugehörigen zentralen und peripheren Gliazellen 22 studieren, Zielmuskulatur 21, und die Reaktion des Immunsystems 23 werden. Obwohl viel bei der Untersuchung des Gesichtsnervs Axotomie-Modell 24 durchgeführt worden ist, wird eine weitere Studie von peripheren Nervenverletzungen erforderlich, weil Nervenschädigung ist ein bedeutendes Problem für die Patienten und die gegenwärtigen Behandlungen nicht zu optimalen Ergebnissen führen. Dieses Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der physiologischen Reaktion auf eine Nervenverletzung und um die Wirksamkeit von Nervenregeneration Therapien.

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Protocol

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Alle Geschäfte durchgeführt werden von der Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und befolgt, National Institute of Health Richtlinien.

1. Operationstechnik

  1. Pflegen aseptische Technik bei diesem Verfahren, indem sie sterile Handschuhe, Instrumente, und ein steriles Operationsfeld nach NIH-Richtlinien 25. Sterilisieren Instrumente vor Beginn der Operation durch Autoklavieren ihnen (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Ausrüstung für die komplette Liste). Verwenden Sie eine Glasperlen Sterilisator Werkzeuge während der Operation zu sterilisieren.

2. Anästhesie und Vorbereitung

  1. Anesthetize die Maus in einem Anästhesie-Box mit einer Mischung aus 0,9 l / min Sauerstoff und 2,5% Isofluran mit einem veterinär Isofluran Verdampfersystem. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht zu Veränderungen in der Körperposition, bevor es dem Auspacken zu reagieren.
  2. Bewerben Augensalbe auf die mouse in die Augen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen.
  3. Schalten Sie den Gasstrom aus der Box an den Nasenkegel. Platzieren Sie die Maus direkt auf seiner linken Seite auf einer erhitzten Unterlage mit einem Operationsfeld und absorbierende Papierbank mit der Nase und den Mund innerhalb des Kegels bedeckt. Die Maus Atemrhythmus und bewerten fortlaufend zu überwachen und anzupassen Isofluran Ebenen nach Bedarf (zwischen 2,5 bis 3% Isofluran), ein angemessenes Niveau der Narkose zu halten und verwenden die Zehe Prise Reflex auf insgesamt Sedierung bestätigen.

3. Chirurgische Vorgehensweise

  1. Ausrichten und konzentrieren das Stereoskop mit dem OP-Feld. Passen Sie den Nasenkegel und kleben Sie es nach unten, so dass es am Rand des Gesichtsfeldes positioniert ist.
  2. Mit der Maus, der auf der linken Seite, kleben Sie den Rand des rechten Ohr auf die Bugnase, Freilegung der Bereich hinter dem Ohr, wo der Schnitt gemacht werden. Stellen Sie sicher, dass die hintere Ohrvene fährt horizontal über das Ohr. Man beachte, dass die korrekte Platzierung ter Tier- und Taping des Ohres sind von entscheidender Bedeutung, um die Gesichtsnerven schnell zu finden.
  3. Befeuchten Sie das Fell auf und hinter dem Ohr mit 70% Ethanol und rasieren die Operationsstelle mit einer Rasierklinge oder Skalpell. Vorbenetzung das Fell macht Rasieren leichter in dieser anatomischen Lage.
  4. Reinigen der Haut mit einer Jodlösung, wie Betadine chirurgischen Scheuer (7,5% Povidon-Iod), gefolgt von 70% Ethanol. Wiederholen Sie diese Reinigung noch zweimal, um den Bereich gründlich zu desinfizieren.
  5. Um festzustellen, wo der Schnitt zu machen, verfolgen Sie die hinteren Ohrvene aus dem Ohr nach kaudal auf den Bereich hinter dem Ohr Vorsprung. Mit Federschere, einen 4 mm Schnitt 2-3 mm hinter dem Vorsprung.
  6. Präparieren durch das subkutane Fett und Bindegewebe mit stumpf. Vermeiden Sie direkte Schneiden mit der Schere, weil die Blutgefäße oder Muskelgewebe leicht beschädigt werden könnte.
  7. Wenn die Blutung auf, Druck auf die Operationsstelle mit einem sterilen Wattestäbchenfür mindestens 30 sec. Wenn bedeutende Flüssigkeitsverlust auftritt, injizieren die Maus intraperitoneal mit bis zu 0,5 ml steriler 0,9% iger Kochsalzlösung unter Verwendung einer 25 oder 27 G-Nadel.
  8. Verwenden Sie mehrere wichtige Sehenswürdigkeiten, die N. accessorius, Gehörgang, und vorderen M. digastricus (siehe unten), um die Gesichtsnerven zu lokalisieren. Sezieren um diese Landmarken, bis die Zweige des Gesichtsnervs visualisiert werden. Der Nerv wird als bedeutender solid weiß Struktur angezeigt, wenn es aufgedeckt wird und eine Schicht aus Faszie haftet sie an die zugrunde liegenden Strukturen.
    1. Finden Sie die N. accessorius, die aus dem kaudalen Teil des Schädels reist, um die Trapezmuskel innervieren, sobald das subkutane Fett und Bindegewebe wurden seziert. Der Gesichtsnerv ist tief mit dem N. accessorius.
    2. Finden Sie die knorpeligen Gehörgang, die strahlend weißen aussieht und rostral des Gesichtsnerven zu sehen.
    3. Finden Sie die Muskelbauch des vorderen M. digastricus, der oben auf und c liegtaudal des Gesichtsnervs.
  9. Wenn die Hauptzweige des Gesichtsnervs visualisiert, Spuren sie dorsal ihrer Herkunft aus den Foramen stylomastoideum finden. Mit feiner Spitze Dumont Pinzetten # 5/45 um die Operationsstelle offen zu halten, zu fördern die Federscherenspitzen nach dem Pfad des Nervs, und bewegen Sie die Zange dorsal um den neu erweiterten Bereich offen zu halten.
  10. Visualisieren Sie die Stamm des Facialis mit dem Jochbein, bukkale, und Randkieferzweige an dieser Stelle.
    HINWEIS: Die zeitliche Niederlassung wird näher an das Foramen finden. Die Randkiefernervenäste in die oberen und unteren Teil näher an der Backe, damit diese Nervenäste nicht auf dieser Ebene sichtbar sein.
    1. Bei Durchführung einer Nervendurchtrennung, Stabilisierung des Nerven vorsichtig mit der feinen Spitze Pinzette und schneiden Sie die Nerven mit den Feder Schere. Vermeiden Sie die Anwendung zu viel Traktion auf die Nerven mit der Zange avulsing den Nerv aus dem Hirnstamm zu verhindern. Drückendie Stümpfe voneinander entfernt oder ausgeschnitten und ein Abschnitt des distalen Nerv zu entfernen, um sicherzustellen, dass keine Wiederverbindung auftreten kann.
    2. Bei Durchführung einer Quetschverletzungen, verwenden Dumont # 5/45 Pinzette, um den Nerv für 30 Sekunden mit konstantem Druck, alle Axone trennen, wiederholen Sie diesen Andrang in einem zweiten Winkel senkrecht zur ersten Quetschstelle zu komprimieren. Vermeiden Sie die Anwendung unterschiedliche Mengen an Druck während der 30 Sekunden zu vernichten, da sonst die Verletzung inkonsistent zwischen den Tieren sein.

4. Schließen und Wiederherstellung

  1. Positionieren Sie das Fett und die Muskeln in den darunterliegenden Strukturen.
  2. Näherungsweise die Kanten des Einschnitts und schließen Sie die Wunde mit einem 7,5 mm Wundklammer. Nahtmaterial oder Klebstoff sind auch für den Wundverschluss akzeptabel. Postoperative Schmerz kann zu diesem Zeitpunkt zur Verfügung gestellt werden.
  3. Entfernen Sie das Band von Ohr die Maus. Schalten Sie die Isofluran Fluss und damit die Maus, um reinen Sauerstoff für 30 Sekunden zu atmen, um 1 Min. PlAss der Maus in einem leeren Käfig ohne Einstreu aus der Narkose zu erholen.
  4. Wenn die Maus wieder, verfolgen Sie sein Verhalten für bestätigende Anzeichen von Gesichtslähmung. Die Schnurrhaare werden gelähmt und abgewinkelt zurück in Richtung der Wange sein, wird die Nase abgewichen werden, und das Auge wird nicht als Reaktion auf einen Luftstoß blinken.
  5. Haustieren gemeinsam nach der Operation, wenn sie weiblich sind. Vermeiden männlichen Mäusen gemeinsam, weil sie sind aggressiver und neigen dazu, Gewalt zu entfernen Wundklammern ihres cagemate, die Infektion führt. Bereitzustellen postoperativen Schmerz zu dieser Zeit, falls erforderlich.
  6. Überwachen die Mäuse einmal am Tag über mehrere Tage nach der Operation, um sicherzustellen, dass keine Infektion oder andere Komplikation tritt postoperativ. Entfernen Wundklammern 7-10 Tage nach der Operation, wenn sie nicht auf eigene Faust zurückgegangen.
  7. Bewerben Schmieraugensalbe in das betroffene Auge täglich Hornhautkomplikationen zu vermeiden, sei es, bis das Auge Blinkreflex ist neuabgedeckt oder bis Euthanasie.

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Representative Results

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Nach der Gesichtsnerv Axotomie durchgeführt wird, tritt Motoneuronenverlust als Folge der Verletzung. Motoneuronenüberleben nach der Verletzung hängt von vielen Faktoren, wie Geschlecht, Alter der Tiere zum Zeitpunkt der Operation und den Zeitpunkt, zu dem die Motoneuron zählt fertig sind, und der Moran und Graeber Überprüfung 24 und Jinno und Yamada Rezension 22 beide zusammenzufassen Motoneuron Überlebensdaten. Typischerweise werden etwa 86% der Motoneuronen überleben 28 Tage nach der Axotomie 14,15,26. Kinetik der Motoneuronenverlust in Serpe et al. 2000. 1 zeigt die Variation der Motoneuronenüberlebens in mehreren genetisch veränderten Mäusen. Keine signifikanten Unterschiede in Gesichtsmotoneuron Grafen von der Steuerseite beobachtet, was anzeigt, dass die genetischen Veränderungen wirken sich nicht auf Grundlinie zählt. Im Vergleich zu den Motoneuronen Überleben in Wildtyp-Mäusen (84% ± 2,0; 1A, D), die wesentlichen Zellverlust wird in einem Mausmodell beobachtetder amyotrophen Lateralsklerose (SOD1 G93A; 68% ± 1; 1B, E) sowie die immundefizienten Rekombination aktivierenden Gen-2-Knockout-Maus (RAG-2 - / -; 57% ± 2,5; 1C, F) 27 .

Abbildung 2 zeigt die Laser Mikrodissektion Technik auf das Gesichts motorischen Kern aufgebracht. Die gesamte Gesichts motorischen Kern eingefangen werden (2A-C) oder Unterkernen getrennt (2D-F) aufgefangen werden. Für eine höhere Genauigkeit kann Moto einzeln erfasst werden, und die restlichen Neuropil können zur Analyse (2G-I) gesammelt werden, Fig. 3 zeigt qPCR Ergebnisse der von den Proben subnuclear Vergleichen des ventromedialen und ventrolateralen Kernen extrahierte RNA Materials. Die vier Gene getestet, β II Tubulin, Wachstum assoziierten Protein-43 (Gap-43), hemopoieTic- und neurologischen exprimierten Sequenz-1 (Hn1) und dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) sind alle mit der Nervenregeneration Reaktion verbunden und es gibt interessante Unterschiede zwischen den beiden Unterkernen und ihre Genexpressionsprofile nach Axotomie 16.

Figur 1
Abbildung 1. Representative koronalen Gesichts motorischen Kern Abschnitte mit Thionin angefärbt und quantifiziert 28 Tage nach der Gesichtsnerven durchtrennt. Gesichts motorischen Kernen aus (A, D) WT, (B, E) SOD1 G93A, und (C, F) RAG gezeigt 2 - / - Mäusen (Steuerungsseite, axotomisierten Seite). Maßstabsbalken = 120 um. Diese Zahl hat sich von 27 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen thist Figur.

Abbildung 2
Abbildung 2. Lasermikrodissektion der Gesichts motorischen Kern. (A) Thionin-gefärbten Abschnitt axotomisierten Facialiskern, (B) mit Teil Lasermikrodissektion der axotomisierten Facialiskern, und (C) Sammlung von Laser mikrodissektiert Gewebe. Eine Vorlage (D) des Unterkernen auf dem Rechnerbild die ventromedialen identifizieren und ventrolateralen Gesichtskernen zur Laser-Mikrodissektion (E, F). Gesichtsmotoneuronen wurden Laser mikrodissezierten anhand ihrer Morphologie mit einem Kern und sichtbaren Nucleolus (* gibt Motoneuron, G, H), während FMN Zellkörperfragmente, die durch die Pfeile (G) angegeben, wurden die Laser Mikrodissektion getrennt und entsorgt zu beseitigen FMN mRNA im Neuropil sBeispiele. Nachdem alle FMN und Zellkörperfragmente gesammelt, die verbleibende Facialiskern Gewebe wurde Laser Neuropil Probe (I) mikrodissektiert. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Diese Zahl hat sich von 16 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Pro-Regeneration und pro-Überleben-mRNA-Expression in den ventromedialen (VM) und ventrolateralen (VL) Gesichtsmotor subnuklearen Regionen folgenden Gesichtsnerven Axotomie. Durchschnittliche Prozent der mRNA-Expression ± SEM in der durchtrennten VM und VL Gesichtskernen gegenüber der operierten Steuerkernen (AD). Zeitverlauf der mRNA-Expression enthält keine Verletzung (0), 3, 7, 14 und 28 DPO für βII Tubulin (A (B), Hn1 (C) und BDNF (D). # Für signifikante Unterschiede im Vergleich zu VL VM, p <0,05. Diese Zahl hat sich von 16 modifiziert.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microscope Leica M60
Labeling tape Fisher Scientific 15-952
Vannas-Tübingen spring scissors - straight/sharp/8.5 cm/5 mm cutting edge Fine Science Tools 15003-08 Sterilize before use
Dumont #5/45 forceps - standard tips/angled 45°/Dumoxel/11 cm Fine Science Tools 11251-35 Sterilize before use
Michel suture clips - 7.5 mm x 1.75 mm Fine Science Tools 12040-01 Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use
Hagenbarth cross action wound clip applier 5" George Tiemann & Co 160-910 Used to apply wound clip, sterilize before use
Michel suture clip applicator & remover - For 7.5 mm clips Fine Science Tools 12029-12 Used to remove wound clip
0.9% Sodium chloride injection, USP Hospira 0409-4888-10
Betadine, 16 oz, with dispenser Fisher Scientific 19-027132
70% Ethanol
Glass bead sterilizer

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References

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Olmstead, D. N., Mesnard-Hoaglin, N. A., Batka, R. J., Haulcomb, M. M., Miller, W. M., Jones, K. J. Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury. J. Vis. Exp. (96), e52382, doi:10.3791/52382 (2015).More

Olmstead, D. N., Mesnard-Hoaglin, N. A., Batka, R. J., Haulcomb, M. M., Miller, W. M., Jones, K. J. Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury. J. Vis. Exp. (96), e52382, doi:10.3791/52382 (2015).

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