Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو 4 تشرين السبب الأكثر شيوعا من الأورام الخبيثة في جميع أنحاء العالم 1. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في فهمنا للأساس عائلي من هذا المرض، والاستعداد الوراثي يساهم فقط ل~ 20٪ من الحالات CRC 2. وتعزى الباقي إلى العديد من العوامل الخارجية والبيئية، بما في ذلك التهاب مزمن. في البشر، والصلة بين الالتهاب المزمن وسرطان القولون هو واضح في التهاب القولون التقرحي (UC) من المرضى، الذين لديهم خطر أكبر للإصابة بسرطان القولون والتهاب القولون المرتبط (CAC)، وهذا يتوقف على مدة ومدى وشدة المرض الالتهابي 3 -5. وفقا لذلك، علاجات جديدة هي في التنمية للسيطرة على الاستجابة المناعية وإنتاج يرتبط النمو وتعزيز عوامل من الورم المكروية التهابات 6-8. وهناك شرط المتزايد على النماذج الحيوانية ما قبل السريرية المناسبة لوصف الكفاءة العلاجية للهذه الأدوية ضد تطور وتقدم المرض.
وقد أظهرت نماذج الماوس بشكل لا لبس فيه أن المكروية التهابات تساهم في CRC التقدم، حتى في حالة عدم وجود التهاب العلني 9،10. وتشمل هذه النماذج استخدام الصوديوم السكاريد ديكستران كبريتات (DSS)، المنصوص عليها في مياه الشرب من الفئران، لنموذج إصابة الظهارية ومرض التهاب الأمعاء الحاد والمزمن (IBD) 11،12. على الرغم من أن الآلية التي DSS يدفع الضرر المخاطية والتهاب القولون ليست مفهومة تماما، وتشير بعض الدراسات إلى أن DSS يمنع الأنشطة الناسخ وريبونوكلياز عكس الخلوية داخل الخلايا، أو تشجع على تشكيل مجمعات للنانو الدهون التي تلتحم مع غشاء القولون يؤدي إلى الضرر الظهارية 13،14. وقد وفرت تعديلات على نموذج DSS القياسية أيضا نظرة كبيرة في الآليات التي الخلايا الظهارية القولون الحفاظ على توازن الأنسجة وreguأواخر الاستجابات المناعية المخاطية 15.
داخل الصفاق إدارة Azoxymethane (AOM) وحده، أو بالاشتراك مع مفاجآت صيف دبي، ويقدم نموذجا لدراسة التفاعل بين الطفرات الجسدية في الغشاء المخاطي الظهارية والتهابات وانسجة المكروية 16،17. AOM هو المستقلب من مادة مسرطنة 1،2-dimethylhydrazine (DMH) أن لا يؤدي بشكل مباشر في طفرات الحمض النووي. بدلا من ذلك، AOM هو تحلل لmethylazoxymethanol (MAM) من خلال شكل الإسوي السيتوكروم CYP2E1 في الكبد، حيث يتم مترافق MAM مع حمض الغلوكورونيك ومن ثم نقلها إلى الأمعاء عن طريق الإفرازات الصفراوية 18. ويعتقد أن البكتيريا β غلوكورونيداز يساهم في تدهور MAM مما أدى إلى الألكلة DNA وتراكم الطفرات في الخلايا الظهارية 19. معظم أورام القولون الناجم عن AOM تؤوي الطفرات مغلطة في ترميز الجين β-كاتينين، مما يجعل البروتين مقاومة للdegradati proteasomalعلى، مما يؤدي إلى تنشيط الشاذة من الكنسي مسار WNT-يشير 20. عندما يتم الجمع بين نشاط AOM مع الضرر المخاطية التي تسببها DSS، الجرح الشفاء التي تلت ذلك استجابة يخلق المكروية مواتية لنمو والتوسع في ظهارة mutagenized. في الاختلاف من هذا النموذج، والإدارة المتكررة من AOM وحدها على مدى عدة أسابيع يمكن استخدامها لنموذج سرطان القولون والمستقيم متفرقة، في غياب الناجم عن التهاب القولون DSS 10،17. وتوفر هذه نموذجين مجانية إعدادات التجريبية لدراسة CAC ومتفرقة CRC على التوالي، وكلاهما يرتبط مع ورم المكروية الموالية للالتهابات 10.
وقد رائدة في استخدام التنظير التسلسلي في الفئران عن طريق بيكر وزملاؤه 21، وتمكن الرصد الطولي للالتهاب القولون وتطور الورم. هنا نقدم ثلاثة بروتوكولات ما قبل السريرية على أساس الضرر الناجم عن DSS المخاطية و / أو بوساطة AOM تومور تحريض للحث على بتكاثر أمراض القولون محددة. يصف البروتوكول الأول حمل الضرر المخاطية الحاد ردا على إدارة DSS لانتزاع العديد من المظاهر التشريحية المرضية المرتبطة IBD. ويستند البروتوكول الثاني على ثلاث دورات متتالية من إدارة DSS لتقليد مشاعل من التهاب احظ عادة في المرضى IBD، ويمكن أن تنفذ بالتزامن مع الطفرات التي يسببها AOM. ويستند البروتوكول النهائي على الناجمة عن الطفرات AOM الظهارية متفرقة. لكل من هذه البروتوكولات، ونوسع على الإجراءات القياسية ذات الصلة لتشمل طرق التدخل الوقائية والعلاجية التي قمنا بتطويرها لمراقبة فعالية الأدوية الجديدة.
Protocol
معهد والتر وإليزا هول للأبحاث الطبية جنة أخلاقيات الحيوان وافق كل من الإجراءات الموضحة في هذه البروتوكولات.
1. إعداد فئران التجارب
- يؤلف الأفواج التجريبية من 4 على الأقل بين الجنسين يقابل 6-8 الاسبوع القديمة C57BL / 6 الفئران (M. العضلة) التي يتم تربيتها ويضم في نفس الممرض محدد مجانية (SPF) منشأة الحيوان / الغرفة، وقدمت مع الغذاء تعقيمها والمياه. فإن استخدام إناث الفئران تسمح شارك في السكن من الفئران من خطوط مختلفة، وأرقام مربع الحد، والحد من التباين قفص إلى قفص.
- تأكد من أن الفئران هي على الأقل 6 أسابيع من العمر لتمكين إجراءات التنظير باستخدام 3.0 مم التنظير غمد.
- استخدام الفئران من نفس الخلفية الوراثية، وحيثما أمكن، من أقفاص المخزنة على نفس الرف للحد من الاختلافات المرتبطة الأمعاء الدقيقة. ينبغي أن تؤخذ الاختلافات في الدقيقة بين مرافق الحيوان في الاعتبار عرجن تحديد الفئران والأنماط الجينية الرقابة المناسبة لكل تجربة 22.
- علامة الفئران عن طريق قصاصات الأذن / إصبع القدم، والوشم، أو ما شابه ذلك للسماح لسهولة تحديد الهوية.
- وزن الفئران في يوم 0، لتحديد الأوزان التجريبية الأساس.
- أداء التنظير (انظر القسم 5) من الفئران في يوم 0 لتسجيل الظواهر القولون خط الأساس.
2. التمهيدية السريرية في الأضرار الظهارية والحادة التهاب القولون نموذج
- يعد حل من وكيل العلاجية لفحصها. لالعلاجات التي ألقاها أنبوب تغذية عن طريق الفم (ص)، وإعداد الحلول لحجم الحد الأقصى من 100 ميكرولتر. لالعلاجات التي ألقاها داخل الصفاق (IP) حقن، وإعداد الحلول لحجم أقصى 200 ميكرولتر.
ملاحظة: المتكررة الملكية الفكرية أو بو الدواء على مدى فترات طويلة من الزمن يمكن أن يؤدي إلى سلوك الماوس تغير. بالتناوب موقع الحقن الملكية الفكرية لتجنب الانزعاج لفترة طويلة. لإدارة بو، وتوفير الفئران مع autocبذور عباد الشمس laved ك "علاج" للحد من جمعية السلبية للإجراء تسمين. - في يوم 1، إدارة العلاجية من الفائدة (المعد في الخطوة 2.1) والضوابط السيارة المناسبة. في المثال المقدمة (الشكل 6A)، و 5 ميكروغرام من iInterleukin (IL) الإنسان المؤتلف (RH) تم حله -11 البروتين في الفوسفات مخزنة 200 ميكرولتر المالحة (PBS) والملكية الفكرية تدار
- تحديد توقيت وتواتر من الإدارات، والتي ستكون تعتمد على البيانات الشخصية الدوائية التي أنشئت لكاشف العلاجية التي يتم اختبارها. الشكل 1 يحدد العلاج الوقائي باستخدام الحقن الملكية الفكرية مرتين يوميا على مدار التجربة.
- مراقبة، بما في ذلك اتساق البراز ووجود الدم، وتزن كل فأر يوميا. على أيام من العلاج، وزنها يجب أن يتزامن مع إدارة المخدرات العلاجية لتقليل الضغط على الفئران التي تسببها معالجة المتكررة. في يوم 3، وإعداد 2.5٪ (2.5 غرام / 100 مل) حل DSS في مياه الشرب المقدمة بشكل روتيني للفئران التي كتبها مرفق الحيوانية. حوالي 5 مل / الماوس / مطلوب اليوم من حل DSS للتجربة. استهلاك المياه DSS قد تتغير إذا كانت درجة الحرارة المحيطة للمنشأة الحيوان يتقلب.
ملاحظة: DSS هو مصدر إزعاج وينبغي التعامل معها وفقا لتعليمات MSDS. - توفير DSS جديدة لالإعلانية libitum الفئران في زجاجات مياه نظيفة لمدة 5 أيام متواصلة. في مساء يوم 5، وتوفير مياه الشرب العادية بالإضافة إلى الغذاء الكريات المهروسة وتكملة البروتين المقدمة في أطباق بتري صغيرة (100 غرام حبيبات الغذاء / 10 غرام من البروتين هزة / 10 مل من الماء). هذا يمنع جفاف وتساعد في التقليل الشديد لخسارة الوزن.
- الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 التسمم وجمع الأنسجة للتحليل النسيجي لاحق من صباح يوم 8، أو عندما تتعرض الفئران ≥15٪ لانقاص الوزن لأكثر من ثلاثة جأيام onsecutive، أيهما أسبق.
ملاحظة: ضبط الجرعة DSS بين 1-4٪ (ث / ت) اعتمادا على الدقيقة للمنشأة الحيوان ودفعة من مفاجآت صيف دبي. تنفيذ واختبار دفعة روتيني لإنشاء الجرعة المناسبة DSS والاختلاف الالتفاف دفعة إلى دفعة واحدة. ينبغي أن تستند الجرعة المناسبة على فقدان الوزن (وليس أكبر من 15٪ من الوزن الأصلي)، وأكد التشريح المرضي التهاب القولون.
3. التمهيدية السريرية في التهاب القولون المزمن أو التهاب القولون السرطان المرتبطة الموديل
- لنموذج التهاب القولون المزمن تبدأ من الخطوة 3.7.
- لنموذج السرطان المرتبطة التهاب القولون (CAC)، في يوم 1، حقن كل فأر مع 10 ملغ / كغ (ث / ث) Azoxymethane (AOM، 250 ميكرولتر، والملكية الفكرية).
ملاحظة: AOM هي مادة مسرطنة ويجب أن يتم التعامل معها وفقا لتعليمات MSDS. - يتم إعداد الحلول الأسهم من AOM 10 مغ / مليلتر مأخوذة وتخزينها في -20 ° C. في يوم من الحقن، وإذابة محلول المخزون AOM وتخفيفه إلى 1 ملغ / ملتر في برنامج تلفزيوني. وينبغي تجنب تكرار التجميد والذوبان في محلول المخزون AOM.
- الجرعة AOM يمكن تعديل بين 8-12 ملغ / كغ. مطلوب روتيني اختبار دفعة لإنشاء الجرعة AOM المناسبة من أجل الالتفاف سمية للفئران نظرا لاختلاف دفعة إلى دفعة واحدة.
- لهذا السبب مراقبة الوزن يمكن حذفها خلال أيام 1-7 لتجنب الحيوانات التعامل مع من شأنها أن تفرز نواتج الأيض السامة للخلايا في فضلاتها خلال أيام 1-7 التالية سوف الأوزان إدارة AOM تكون مستقرة و.
- في يوم 7 يحتاج الى كل أسرة يجب أن يتغير وفقا للإجراءات السامة للخلايا. بمجرد تغيير الفراش كاملة، الحيوانات لم تعد تتطلب إجراءات التعامل مع السامة للخلايا، لأنها لن تكون التغوط الأيض السامة للخلايا.
- في يوم 8، وإعداد 2.5٪ (2.5 غرام / 100 مل) DSS الحل (كما هو موضح في الخطوة 2.5) وتقدم إلى الإرضاع بحسب الرغبة الفئران.
- وزن الفئران يوميا في كافة مراحل التجربة ورصد لعلامات المرض، بما في ذلك فو تكدرتص، hunching، براز دموي وانخفاض الحركة.
- في يوم 13، وإزالة الحل DSS وتوفير الفئران مع مياه الشرب العادي حتى يوم 28. أيام 8-28 تشكل 'دورة' واحدة من بروتوكول التهاب القولون / CAC المزمن.
- في أيام 13-28، عندما تعطى الفئران مياه الشرب العادي، وتوفير الفئران مع الغذاء الكريات المهروسة وتكملة البروتين المقدمة في أطباق بتري صغيرة (100 غرام الغذاء الكريات / 10 غرام من البروتين هزة / 10 مل من الماء). هذا يمنع جفاف وتساعد في التقليل الشديد لخسارة الوزن.
ملاحظة: يجب أن لا يتم توفير مكملات البروتين في الهريس عند الفئران يتلقون التي تحتوي على DSS مياه الشرب لضمان الاتساق في استهلاك DSS. - في يوم 20 إجراء فحص بالمنظار الثاني لرصد الصحة الماوس الفردية (انظر القسم 5).
- في يوم 29 تكرار دورة DSS (دورة 2: 2.5٪ (ث / ت) مفاجآت صيف دبي الذي قدم خلال أيام 29-33 ومياه الشرب العادي خلال أيام 34-50).
- في يوم 40 إجراء ثيطريق الفحص بالمنظار لمراقبة الصحة الماوس الفردية وتحديد عبء الورم (انظر القسم 5).
- إذا لم يكن هناك الأورام مرئية عن طريق التنظير في يوم 40، وتبدأ دورة DSS الثالثة على أيام 50-72 (دورة 3: 2.5٪ (ث / ت) مفاجآت صيف دبي الذي قدم خلال أيام 50-55 ومياه الشرب العادي خلال أيام 56-72). عموما، والأورام واضحة من قبل يوم 40، وبالتالي فإن دورة الثالثة من DSS يمكن حذفها.
- مرة واحدة تصبح مرئية الأورام عن طريق الفحص بالمنظار، تعيين كل الماوس على درجة الورم بالمنظار (انظر القسم 5) وتعيين الفئران الفردية إلى الأفواج مع أعباء الورم أساسية مماثلة.
- في يوم 42 (أو عندما الأورام مرئية)، وإدارة المجمع العلاجي أو السيطرة على السيارة ذات الصلة (انظر القسم 2.2). فإن توقيت جرعات أن يعتمد على البيانات الشخصية الدوائية للالعلاجية. مثال لعلاج تدخل حقن الملكية الفكرية ثلاث مرات أسبوعيا في الفئران مع الاورام أنشئت يتم توفير (الشكل 2).
- أداء هامتحانات ndoscopic مرة واحدة في الأسبوع على مدى فترة من العلاج العلاجية لرصد عبء الورم. عموما، 4 أسابيع من العلاج العلاجية كافية لمراقبة استجابة معالجة موضوعي. وبعد وقف العلاج، لفيف من الفئران يمكن أيضا أن يتم رصدها من قبل التنظير للورم الانتكاس.
- الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 التسمم وجمع الأنسجة لتحليل الكيمياء الحيوية و / أو النسيجي في صباح يوم 72 أو عندما تتعرض الفئران ≥15٪ لانقاص الوزن لأكثر من ثلاثة أيام متتالية، أيهما أسبق.
4. التمهيدية السريرية في المتقطع سرطان القولون والمستقيم نموذج
- في يوم 1، وضخ كل IP الفأر مع 10 ملغ / كغ AOM (راجع الخطوة 3.2). الجرعة AOM يمكن تعديل بين 8-12 ملغ / كغ. مطلوب روتيني اختبار دفعة لإنشاء الجرعة AOM المناسبة من أجل الالتفاف سمية للفئران نظرا لاختلاف دفعة إلى دفعة واحدة.
- تكرار الحقن في اليوم الأول من كل أسبوعلمدة 5 أسابيع التالية (الشكل 3). وينبغي التعامل مع الفئران وفقا لإجراءات السلامة السامة للخلايا لكامل 6 أسابيع.
- وزن كل فأر في يوم حقن AOM للحد من الضائقة للفئران الناجمة عن التعامل المتكررة.
ملاحظة: AOM هي مادة مسرطنة ويجب أن يتم التعامل معها وفقا لتعليمات MSDS. - يجب التعامل مع جميع الحيوانات وفقا لإجراءات السلامة السامة للخلايا لأسابيع 6 من الحقن الملكية الفكرية AOM المطلوبة لهذا البروتوكول.
- خلال الأسبوع 8 أداء الفحص بالمنظار لمراقبة الأورام الناشئة (انظر القسم 5). يجب أن يتم تنفيذ الفحص بالمنظار مرة كل أسبوعين حتى تصبح الأورام مرئية. عموما، من النوع البري C57BL / 6 الحيوانات تبدأ في تطوير الأورام قبل ما يقرب من 40 أسبوعا بعد الادارة الأولى من AOM.
- مرة واحدة تصبح مرئية الأورام عن طريق الفحص بالمنظار، تعيين كل الماوس على درجة الورم بالمنظار (انظر القسم 5) وتعيين الفئران الفردية لأتراب مع مماثلة أعباء الورم قبل بداية العلاج العلاجية.
- خلال الأسبوع 40 (أو عندما الأورام الأولى للعيان) وإدارة مجمع العلاجي أو السيطرة على السيارة ذات الصلة.
- فإن توقيت جرعات أن يعتمد على البيانات الشخصية الدوائية للالعلاجية (راجع الخطوة 2.1). مثال لعلاج تدخل حقن الملكية الفكرية 3 مرات أسبوعيا في الفئران مع الاورام أنشئت يتم توفير (الشكل 3).
- الفحص بالمنظار أداء أسبوعيا لمدة الفترات العلاجية لمراقبة عبء الورم. عموما، 4 أسابيع من العلاج العلاجية كافية لاستجابة معالجة موضوعي. وبعد وقف العلاج، لفيف من الفئران يمكن أيضا أن يتم رصدها من قبل التنظير للورم الانتكاس.
- الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 التسمم وجمع الأنسجة لتحليل الكيمياء الحيوية و / أو النسيجي من القولون والأورام خلال الأسبوع 45، أو بعد 4 أسابيع من العلاج.
- يجب أن يتم تجميعها المعدات التنظير وفقا للإجراءات القياسية 16.
- تعقيم وتنظيف المنظار التحقيق مع 70٪ من الإيثانول أو زيوت التشحيم مضادة للبكتيريا.
- ويمكن أشرطة الفيديو المسجلة باستخدام جهاز كمبيوتر محمول أو كمبيوتر سطح المكتب وبرمجيات الوسائط القياسية، مثل موفي. لشاشة الكمبيوتر القياسية، بدلا من شاشة الصف الطبية، ويكفي لتصور القولون أثناء إجراء التنظير (الشكل 4).
- تخدير مجموعات من 5-6 الفئران في وقت واحد في غرفة مع 3٪ الأيزوفلورين في O 2 100٪ بمعدل 0،2-0،4 لتر / دقيقة. مرة واحدة يتم تخدير الفئران، وهو ما يؤكده قرصة أخمص قدميه. يجب أن تتغير مستويات الأيزوفلورين إلى 0.5-2٪ للصيانة.
- إزالة الماوس الفردية من الغرفة، ووضعه الجانب بطني حتى مع رئيسها مؤمنة في الأنف مخروط. وينبغي رصد تخدير كامل وينبغي تعديل رجليه الخلفيتين بحيث تكون الصورةtretched من وراء الماوس.
- وضع مرهم التعليم والتدريب المهني في أعين الفئران لمنع جفاف.
- عقد ذيل الماوس حيث يلتقي أسفل العمود الفقري لتكشف بوضوح فتحة الشرج. إدراج غمد المنظار جامدة في كوب من الماء وضبط تدفق الهواء للسماح بالافراج عن فقاعة صغيرة واحدة في وقت واحد.
- سوف تدفق الهواء تسمح القولون لتضخيم. إذا كان تدفق الهواء قوي جدا، وسوف يتم ضخ الهواء إلى المعدة من الفأرة. لا يلزم تزييت إضافية.
- إدراج بعناية غمد المنظار جامدة في المستقيم. عموما، يمكن إدخال المنظار تصل إلى 3 سم، وعند هذه النقطة القولون في منحنيات الفئران وليس في متناول المنظار جامدة.
- وثمة صعوبة المشتركة خلال إجراءات التنظير هو انسداد الوصول إلى تجويف القولون بسبب البراز. تجنب هذا عن طريق تدليك بلطف من البطن من الفئران قبل الإجراء إلى تشجيع التغوط، أو بعناية المناورة المنظار حول fecaل المسألة خلال الإجراء. يمكن أن يحدث التمعج أيضا، حيث ينبغي أن تعقد المنظار في المنصب حتى يرتاح عضلات القولون.
- بدء تسجيل الفيديو في أي مرحلة من مراحل إجراءات التنظير. مرض التهديف يمكن تسجيلها من قبل مساعد من ذوي الخبرة أثناء إجراء، أو في نقطة زمنية لاحقة من ملفات الفيديو.
- وبعد الامتحان بالمنظار، والعودة إلى قفص الفئران ومراقبتهم أثناء التعافي من التخدير. الحيوانات مستيقظا عموما والمتنقلة في غضون 2 دقيقة بعد إزالة من الأيزوفلورين إدارة مخروط الأنف.
- ضمان أن يتم تنفيذ هذه الإجراءات من قبل عالم ذوي الخبرة. وكل إجراء التنظير تأخذ حوالي 2 دقيقة لكل الماوس.
6. الأمراض التهديف
- لمراقبة التهاب القولون، ويسجل ملفات الفيديو لمؤشر الفئران بالمنظار من التهاب القولون شدة (MEICS) 16، الذي يوثق التغيرات في (ط) سمك جدار القولون يدل على الشفافية، (ب) قوام البراز، (ج) سلامة الأوعية الدموية وجود، (د) القرحة ومجالات التجديد التي تقدم بطريقة الحبيبية، (ت) نزيف أشار من قبل الفيبرين الودائع (الشكل 5A).
- لمراقبة عبء الورم، ويسجل ملفات الفيديو لحدوث الأورام وحجمها. يتم تحديد حجم الورم عن طريق قطر التجويف القولون التي تحتلها الورم 16 (الشكل 5B). ومن الشائع استخدام كل من التهاب القولون والأورام التهديف المعلمات للماوس واحدة. عن طريق التنظير، والأورام الفردية وصحة الغشاء المخاطي للقولون يمكن رصدها مع مرور الوقت، وتوفير التدريجي قراءة لنجاح علاجات جديدة في حيوان واحد.
- (اختياري) الصور الثابتة يمكن استخراجها من أشرطة الفيديو لجيل من الشخصيات التمثيلية (الشكل 6).
Representative Results
يستخدم لانقاص الوزن كمعلمة القياسية لمراقبة الأمراض المرتبطة التهاب القولون، والذي يستخدم بشكل روتيني لمراقبة الصحة العامة للفئران. الحيوانات المحافظة عموما وزنهم بينما تحتوي DSS المياه يدار، وتبدأ فقط لفقدان الوزن عندما عادوا إلى مياه الشرب العادي. وينبغي وضع مقبولة المعلمات انقاص الوزن وفقا للجنة الأخلاقيات الحيوان المؤسسة. من أجل منع الجفاف المرتبطة بالإسهال لفترات طويلة، استخدام توفير الروتيني للالهريس (الكريات الطعام المهروس ويخلط مع مياه الشرب) تستكمل مع هزة البروتين بالإضافة إلى مياه الشرب العادي.
باعتبارها التخدير البديل، الكيتامين / زيلازين أو وكلاء مماثل يمكن استخدامها، إذا المعدات الأيزوفلورين غير متوفرة. ونظرا لطبيعة جامدة من المنظار، هذه الإجراءات تسمح فقط لتصور من 3 سم الأكثر البعيدة من القولون الماوس. أحدث المناظير مع تتوفر قدرات إضافية (بما في ذلك المرونة ومضان) اعتمادا على احتياجات التجربة. ومع ذلك، منذ الآثار الضارة للDSS تقتصر أساسا إلى القولون البعيدة من الفئران، مع أكثر اعتدالا علم الأمراض التي لوحظت في القولون الأوسط، والمنظار جامدة لا يعوق رصد صحة الغشاء المخاطي من الفئران الفردية. على الرغم من أن وصفنا بروتوكول للعلاج وقائي من الحاد الناجم عن التهاب القولون DSS، وهذا البروتوكول يمكن بسهولة تعديل لاختبار استراتيجيات العلاج التدخل. فعالية دواء مصممة لتخفيف الضرر الظهارية والتهاب القولون يمكن رصد طوليا في الفئران الفردية وكميا على أساس المعايير التهديف وصفها (الشكل 5). هذا هو مفيد أكثر من التصاميم التجريبية التقليدية، والتي تتطلب اعدام الفئران في نقطة زمنية محددة خلال بروتوكول تجريبي، ولا تسمح توصيف استجابة المرض للعلاج مع مرور الوقت.
ر "> الدراسات السريرية على البشر وقد أبرزت تفاوتا كبيرا في كيفية أورام مختلفة في هذا المريض يستجيب للعلاجات، والإجراءات الموضحة هنا توفر وسيلة لمراقبة عبء الورم بشكل عام، فضلا عن الاستجابة للعلاج من الأورام الفردية على مدار من تجربة. ومن المهم أن نعتبر أن البروتوكولات تدخل الموضحة للنماذج السرطان لا تأخذ في الاعتبار آثار العلاج على بدء الورم. البروتوكولات الوقائية، مع العلاج المقدم قبل عندما تصبح الأورام مرئية بواسطة التنظير، ويلزم الحصول على هذه المعلومات. البروتوكولات المذكورة هنا توفر معلومات عن الآثار العلاجية على على التقدم (يقاس حجم الورم) من الأورام الفردية. ويمكن أيضا أن أشار ورم الانحدار عن طريق تخفيض في عدد من الأورام مرئية.ز "/>
الشكل 1: رصد فعالية العلاج علاج وقائي في نموذج الضرر القولون الحاد ويتطلب بروتوكول تجريبي (أ) 8 أيام من البداية الى النهاية. وتدار العلاجات (ب) من يوم 1 لعلاجات وقائية. يتم توفير DSS في مياه الشرب (ج) من يوم 3 من بروتوكول تجريبي. يتم تنفيذ التنظير (د) لمراقبة تطور المرض في الحيوانات. وتشمل timepoints اقترح يوم 0 (غير المعالجة)، ويوم 2 (المراقبة الصحية)، يوم 5 و 8 (لتحديد عبء المرض). يتم إنهاء التجربة (ه) من صباح يوم 8. في الماوس من النوع البري) و (تطور المرض يزداد مع مرور الوقت.
الشكل 2: رصد فعالية العلاج التدخل في نموذج لسو التهاب القولون المرتبط بالسرطان. بروتوكول تجريبي (أ) يتطلب 72 يوما من البداية الى النهاية. وتدار العلاجات (ب) على الفئران مع الاورام أنشئت من يوم 46 لعلاجات التدخل. يتم حقن AOM (ج) في يوم 1، ويتم توفير DSS في المياه الصالحة للشرب على مدار ثلاث دورات للبروتوكول تجريبي، ابتداء من يوم يتم تنفيذ 8. التنظير (د) لمراقبة تطور المرض في الحيوانات. وتشمل timepoints اقترح يوم 0 (غير المعالجة)، يوم 20 (المراقبة الصحية)، ويوم 40 (لحيوانات المجموعة وفقا لعبء الورم). يتم تنفيذ التنظير أسبوعيا على مدار علاج العلاجية لمراقبة نتائج المرض. التجربة (ه) يتم إنهاء صباح يوم 72. وفي عبء الورم من النوع البري الماوس (و) يزيد من يوم 40 وما بعده.
الرقم 3: مراقبة فعالية العلاج التدخل في نموذج من سرطان القولون والمستقيم عفوية البروتوكول التجريبي (أ) يتطلب> 50 أسبوعا من البداية الى النهاية. وتدار العلاجات (ب) على الفئران مع الاورام التي أنشئت لعلاجات التدخل. يتم حقن AOM (ج) في يوم 1، وبعد ذلك أسبوعيا لمدة 6 حقن متتالية على مدار البروتوكول التجريبي. التنظير (د) يتم تنفيذ لمراقبة تطور المرض في الحيوانات. وتشمل timepoints اقترح يوم 0 (غير المعالجة) وأسبوع 8 (مراقبة الورم) ومرة كل أسبوعين هناك بعد (لإقامة عبء الورم). يتم تنفيذ التنظير أسبوعيا على مدار العلاج لمراقبة النتائج العلاجية. يتم إنهاء التجربة (ه) في أسبوع 50. وفي عبء الورم من النوع البري الماوس (و) يزيد من الأسبوع 40 فصاعدا. P>
الرقم 4: معدات انشاء والتجريبية (أ) مجموعة المتابعة للوحدة بالمنظار، مع القطع الفردية من المعدات أشار. وأشار المنظار جامدة (ب)، مع المكونات الفردية. مقياس شريط = 2.5 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: المعلمات المرض التهديف عن طريق التنظير مخطط (أ) من مؤشر بالمنظار الفئران من التهاب القولون شدة (MEICS). مخطط (ب) من المعلمات الفردية الورم التهديف.وفاق / ftp_upload / 52383 / 52383fig5highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: العلاجات العلاجية التمثيلية التمثيلية لخسارة الوزن، والصور وعشرات بالمنظار ل: (أ) الحادة DSS-يسببها الضرر المخاطية (ب) الأورام التي وضعت في أعقاب AOM بروتوكول / DSS (ج) أورام التي وضعت في أعقاب متتابعة. AOM البروتوكول. N = 3 الفئران في المجموعة. * P <0.05، *** P <0.001 (T-اختبار الطالب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
البروتوكولات الثلاثة التي تم وصفها أساليب الخطوط العريضة للتحريض موثوقة وقابلة للتكرار علم الأمراض مرض القولون في الفئران. عندما يقترن مراقبة بالمنظار الروتيني واستراتيجيات التدخل المذكورة هنا، فإن هذه البروتوكولات توفير نظرة ما قبل السريرية قوية في فعالية العلاجات. مختبراتنا بشكل روتيني استخدام كل من هذه البروتوكولات لمراقبة نجاح علاجات جديدة 10،23،24.
وهناك عدد من الاعتبارات عند اختيار نموذج حيواني ما قبل السريرية لاختبار علاجات جديدة. وتشمل هذه أهمية النموذج إلى الأمراض التي تصيب البشر، ومساهمة المكروية الورم إلى العمل المقترحة من الهدف العلاجي. هنا نقدم ثلاثة بروتوكولات للتدخل العلاجي في إنشاء نماذج مرض الأمعاء. هذه النماذج هي استنساخه وتسليم الكواشف للحث على المرض من السهل السيطرة عليها. الأهم من ذلك أن النماذج هي ذات أهمية كبيرة لجوانب ومراحل التهاب القولون البداية، وبدء الورم والتقدم متعددة. يجب على الباحثين أن تأخذ في الاعتبار الخلفية الوراثية للسلالات الماوس تستخدم عند تصميم التجارب، حيث أن الاستعداد للإصابة بالأمراض الناجمة عن DSS و / أو AOM يمكن أن تختلف إلى حد كبير 25. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون المجتمعات الميكروبية المختلفة القدرات الأيضية المختلفة في سياق AOM، والتي يتم استقلاب من البكتيريا. ونحن نحذر من استخدام الأفواج مختلفة من الفئران التي ولدت في مرافق حيوانية مختلفة (بما في ذلك الباعة التجارية) في تجربة واحدة. وبالمثل، فإن الدقيقة المختلفة في الفئران المستخدمة من المرافق المختلفة قد يؤدي إلى استجابات المضيف مختلفة لمفاجآت صيف دبي التي يسببها الضرر الحاجز الظهاري 11. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر أيضا في التحليل المناسب للأنسجة (لتنقية المثال RNA)، منذ قدرة DSS لمنع الناسخ العكسي سيؤثر على التحليل الجزيئي لاحق 26،27.
ق ق = "jove_content"> ماوس التنظير هو تقنية المتطورة لمراقبة مرارا وتكرارا بداية ظهور أعراض المرض والتقدم في الماوس الفردية. القدرة على تسجيل الفيديو واستخراج الصور الثابتة تسمح رصد سهل من المعلمات المرض متعددة والأورام. وبالإضافة إلى تحسين رعاية الحيوان، ورصد بالمنظار يقلل أيضا الحاجة إلى الأفواج متعددة من فئران التجارب، التي أعدمت تقليديا على مختلف نقاط الوقت لتتبع نتائج المرض. نظام التسجيل MEICS ليس بديلا للتحليل الأنسجة، ولكن يوفر بديلا يعني لمراقبة صحة الحيوان والغشاء المخاطي الضرر في الفئران الحية. الماوس التنظير هو تقنية المختبرات المتخصصة، ويجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات من قبل الأفراد المدربين لكفالة التلاعب والتعامل المناسب من الفئران، وكذلك لتوفير جودة ثابتة في الصور المستخدمة لتسجيل المرض. في أيدي الشخصية المؤهلة، وجدنا أن التنظير يدفع الضرر ضئيلة أو معدومة للtumoRS التي من شأنها أن تسبب نزيف داخل ورمي. البروتوكولات العلاجية المذكورة، ونحن نعتبر التنظير المفيد للغاية، نظرا لأنه يوفر وسيلة لتحديد عبء الورم الأولي، ويسمح لنا الأفواج مجموعة من الحيوانات مع أعباء الورم مماثلة قبل إدارة الدواء العلاجية. مراقبة متتابعة من الفئران تمكن الباحثين من تحديد مدى فعالية علاجات جديدة في وقت مبكر، مع خيار لإنهاء التجارب غير الناجحة في الوقت المناسب.
كما فهمنا من مرض التهاب الأمعاء وسرطان القولون والمستقيم مسبقا، وسيتم تحديد أهداف جديدة للعلاج. سوف نماذج حيوانية مناسبة أن يكون جزءا لا يتجزأ من التأكد من أن العلاجات الجديدة الواعدة يتم نقل نحو التجارب السريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla protein shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflurane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fiber optic light cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | Apple | iMovie | |
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
- Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
- Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
- Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
- Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
- Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
- Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
- Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
- Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
- Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Rose, W. A. 2nd, Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
- Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
- Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
- Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
- Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
- Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
- Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
- Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
