Abstract
Om de therapeutische werkzaamheid van celtransplantatie verbeteren, transplantatie stelsel van genetisch gemodificeerde, injecteerbare sferoïden ontwikkeld. De cel sferoïden worden op een kweeksysteem op micropatterned platen bekleed met een temperatuurgevoelige polymeer. Een aantal sferoïden zijn gevormd op de platen, die overeenkomen met de celadhesie gebied van 100 urn diameter die regelmatig zijn gerangschikt in een tweedimensionale wijze, omgeven door niet-klevende gebieden die zijn bekleed met polyethyleenglycol (PEG) matrix. De sferoïden kunnen gemakkelijk worden teruggewonnen als vloeibare suspensie door verlaging van de temperatuur van de platen en hun structuur is goed onderhouden doordat deze injectienaalden met een voldoende groot kaliber (via 27 G). Genetische modificatie wordt verkregen door gen transfectie met de oorspronkelijke niet-virale gen-carrier, Polyplex nanomicelle, dat in staat is het inbrengen van genen in cellen zonder verstoring van de bolvormige structuur. Voor primary hepatocyt sferoïden getransfecteerd met luciferase-expressie gen, wordt de luciferase duurzaam verkregen in getransplanteerde dieren, samen met bewaarde hepatocytfunctie, zoals door expressie van albumine. Dit systeem kan worden toegepast op een verscheidenheid van celsoorten waaronder mesenchymale stamcellen.
Introduction
Celtransplantatie therapie is brede aandacht trok voor de behandeling van diverse hardnekkige ziekten. De activiteit en halfwaardetijd van bioactieve factoren die worden uitgescheiden door de getransplanteerde cellen zijn essentieel voor een verbeterde therapeutische werkzaamheid van celtransplantatie systeem. Genetische modificatie van de cellen voorafgaand aan transplantatie is een techniek nuttig te reguleren en te manipuleren cellulaire functies, waaronder de afscheiding van het biologisch actieve factoren. Het is ook belangrijk om een gunstige micro voor de cellen voor het vermijden celdood of verlies van cel activiteit. Driedimensionale (3D) sferoïde celkweek, waarbij cel-cel interacties goede toestand blijven, belooft daartoe bijvoorbeeld ter verbetering albumine uitscheiding van primaire hepatocyten en bevordering multi-lijn differentiatie van mesenchymale stamcellen (MSCs ) 1-7.
In deze studie werd een nieuwe combinatie stelsel spheroid cultuur en gen transfectie wordt gebruikt om te dienen als een platform voor genetisch gemodificeerde celtransplantatie. Voor het maken van bolvormige cellen, is een bolvormige cultuur systeem micropatterned kweekplaten gebruikt. Op deze platen zijn celadhesie gebied van 100 urn diameter regelmatig gerangschikt in een tweedimensionale wijze en zijn omgeven door niet-klevende gebieden bedekt door een matrix 3 PEG. Door enten een voldoende aantal cellen, worden reeksen 3D-sferoïden van 100 micrometer diameter gevormd die overeenkomt met de micropatterned kweekbed.
De sferoïden worden teruggewonnen zonder verstoring van hun 3D structuur met warmte gevoelige celcultuur platen, die waren bekleed met een temperatuurgevoelige polymeer, poly (iso-propylacrylamide) (PIPAAm) 8-10. De micropatterned architectuur is gebouwd op de warmtegevoelige platen (maat gemaakt). Door simpelweg verlagen van de temperatuur van de platen, worden de bolletjes losgemaakt van de kweek bed en dispersed in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Aldus kan een groot aantal bolvormige deeltjes met een gelijkmatige grootte van 100 urn worden verkregen in de vorm van een injecteerbare suspensie.
Figuur 1. Schematische weergave van het bolvormige kweeksysteem op een micropatterned plaat. Genetische modificatie wordt verkregen door gen transfectie met de oorspronkelijke niet-virale gen-carrier, polyplex nanomicelle. Het bestaat uit plasmide-DNA (pDNA) en polyethyleenglycol (PEG) -polycation blokcopolymeren 11. Deze hebben een karakteristieke kern-schil structuur die bestaat uit een PEG-shell en een kern van gecondenseerde pDNA, dat een veilige en effectieve gen introductie in cellen voor therapeutische doeleinden 11. Klik hier om een grotere versie van thi bekijkens figuur.
Figuur 2. Structuur van de polyplex nanomicelle gevormd door het complex van nucleïnezuren en PEG-block-polykation blokcopolymeren. In deze studie, het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de bolvormige structuur niet verstoord tijdens gentransfectie door nanomicelles. Na nanomicelle gemedieerde transfectie van primaire rat hepatocyten sferoïden, verlengd transgenexpressie verkregen meer dan een maand continu albumine uitscheiding van de hepatocyten op een niveau vergelijkbaar met dat van ongetransfecteerde sferoïden 12. De transgene expressie en albumine-uitscheiding van de sferoïden ook gehandhaafd na herstel van de warmtegevoelige platen. Het is duidelijk dat nanomicelles veilig gen-introductie te vergemakkelijken zonder dat de aangeboren functies van de hepatocytes. Zo is de combinatie van bolvormige cellen gekweekt op warmtegevoelige micropatterned platen met geninbrenging behulp nanomicelles is een veelbelovend platform voor genetisch gemodificeerde celtransplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Tokyo, Tokyo, Japan.
1. Celbereiding
- Voor primaire hepatocyten, volgt u het protocol voor hepatocyt isolatie van de rat door een aangepaste twee-staps collagenase spijsvertering 13,14.
- Verdoven Sprague Dawley (SD) ratten (mannelijk, 5 weken oud) onder inhalatie-anesthesie met isofluraan. Plaats een rat in een kamer verbonden met een anesthesie met isofluraan machine voorzien in de kamer. Haal de rat na een val in slaap, en zet deze op de operatietafel met ventilatie met behulp van een masker. Controleer de isofluraan stroom bij benadering 0,4-0,7 L / min door het controleren van de omstandigheden van de rat. Perfuseren de levers van Sprague Dawley (SD) ratten (mannelijk, 5 weken oud) vanaf de poortader met een bijzondere oplossing bestaande uit 8 g / l natriumchloride (NaCl), 400 mg / l kaliumchloride (KCl), 78 mg / lnatriumdiwaterstoffosfaat dihydraat (NaH 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 mg / l dinatriumwaterstoffosfaat-dodecahydraat (Na 2 HPO 4 · 12H 2 O), 2,38 g / l 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1 piperazinyl] ethaansulfonzuur (HEPES), 190 mg / l ethyleenglycol azijnzuur (EGTA), 350 mg / l natriumbicarbonaat (NaHCO3) en 900 mg / L glucose.
- Circuleren collagenase oplossing door de lever.
OPMERKING: De oplossing is samengesteld uit 500 mg / L collagenase, 9,8 g / l Hank's gebufferde zoutoplossing, 2,38 g / ml HEPES, 556 mg / ml calciumchloride hydraat (CaCl 2 · H2O), 350 mg / l NaHCO 3, en 50 mg / L trypsine-remmer, de pH aangepast tot 7,2. - Verwijder voorzichtig de lever en gehakt voorzichtig op een schotel met een scalpel, voeg Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum (FBS) en filtreer de celsuspensie door een 100 urnnylon mesh. Om extra vuil te verwijderen, centrifuge de celsuspensie bij 20 x g gedurende 1 minuut. Bij deze stap hepatocyten in de supernatant.
- Herhaal het centrifugeren stap twee keer (in totaal drie centrifugeringen). Tenslotte gecentrifugeerd hepatocyten bij 50 x g gedurende 3 min om te herstellen in de vorm van een pellet.
- Resuspendeer de hepatocyten tot een concentratie van 4 x 10 5 cellen / ml in een speciale kweekmedium samengesteld uit DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 1% Pen-Strep-Glut (PSQ), 1% dimethylsulfoxide (DMSO), 0,1 umol / L dexamethason, 0,5 ug / ml insuline, 10 mmol / L nicotinamide, 0,2 mmol / L gefosforyleerd ascorbaat (Asc-2P), en 10 ng / ml humane epidermale groeifactor (hEGF) 15. Deze speciale medium is verplicht voor het behoud van de leverfunctie onder in vitro omstandigheden.
- Voor het verkrijgen van MSC's rat, euthanaseren Sprague Dawley (SD) ratten (mannelijk, 5 weken oud) door overmatige toediening van isoflurane. Resectie scheen- en dij- en verzamel het beenmerg door het met een 22 G naald in de schacht van het been om het te spoelen met 10 ml DMEM gesupplementeerd met 10% FBS. Verzamel de cellen door filtratie door een 100 um nylon mesh.
- Zaad de cellen op 10 cm kweekschalen met behulp DMEM met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine. Voor de sferoïde experimenten, gebruik MSC binnen 5 passages.
2. Voorbereiding van de 3D-Cell Sferoïden
- Commercieel verkrijgen micropatterned kweekplaten, waarop de cel kleefmiddelgebieden regelmatig zijn gerangschikt op 100 urn diameter in een tweedimensionale wijze, omgeven door niet-klevende gebieden bedekt door de PEG-matrix.
OPMERKING: Voor celtransplantatie, een extra coating met het temperatuurgevoelige polymeer PIPAAm nodig is om mobiele onthechting mogelijk door het koelen van de platen (zie stap 5.1). Temperatuurschommelingen kunnen veranderingen induceren in de chemie van het polymeer8-10. Bij 37 ° C, PIPAAm enigszins hydrofoob, waardoor de cellen onder normale omstandigheden worden gekweekt. Een verlaging van de temperatuur onder 32 ° C resulteert in een snelle hydratatie van het polymeer, leidt tot de spontane loslating van de cellen. - Zaad de hepatocyten of MSCs on 12-well micropatterned platen bij een dichtheid van 4 x 10 5 cellen / putje te andincubate bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. De cellen zullen ophopen op de micropatterned hechting ruimtes geleidelijk vormen door sferoïden in 2 dagen.
: Voor het verkrijgen controlecellen in een monolaagkweek de hiervoor in de 12-well platen en zaden van de cellen op een identieke dichtheid, daarbij een vergelijkbare werkwijze als hierboven beschreven.
3. Voorbereiding van Polyplex Nanomicelles
- Samenstel van een blokcopolymeer, PEG-PASP (DET) (poly [N '- [N - (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] aspartamide]) (PEG Mw = 12,000, polymerisatiegraad (DP) van PASP (DET) segment = 59), en een homopolymeer dat is samengesteld uit alleen de kationische segment [PASP (DET)] (DP = 55), volgens de procedures eerder beschreven door de auteurs 11, 16, 17.
- Bereid een gemengde oplossing van de PEG-PASP (DET) blokcopolymeer en PASP (DET) homopolymeer in een gelijke molaire verhouding van overblijvende aminogroepen in 10 mM HEPES buffer (pH 7,3) door instellen van de polymeerconcentratie tot 33,3 ug / ml en 19,1 pg / ml, respectievelijk.
OPMERKING: De polymeerconcentraties bovenbeschreven representatieve waarden voor het bereiden nanomicelles met een resterende molaire verhouding van de totale aminogroepen in de twee polymeren aan de fosfaatgroepen in het pDNA (N / P-verhouding) van 10. De N / P verhouding kan variëren afhankelijk van het type cel en het doel (voor details, zie Discussie). Het gecombineerde gebruik van de twee polymeren kunnen zowel effectief PEG afscherming en de werking van PASP (DET) tot endosomale verbeteren verwezenlijkenontsnappen (voor details, zie Discussie) 18. - Bereid de pDNA Gaussia luciferase codeert, GL4 luciferase of erythropoïetine door kloneren van het segment expressie brengen van de respectievelijke genen in de pCAG GS-plasmide (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) om expressie te verkrijgen onder de CAG promotor / enhancer met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Versterken de pDNA op een competente Escherichia coli stam en zuiveren met behulp van een endotoxine vrij plasmide DNA zuiveringssysteem. Bepaal de pDNA concentratie bij een absorptie van 260 nm tot 150 ug / ml oplossing in 10 mM HEPES buffer (pH 7,3) te verkrijgen.
- 1 (volumeverhouding): Om de Polyplex nanomicelles bereiden grondig de pDNA oplossing (150 ug / ml in 10 mM HEPES buffer) en de vooraf gemengde oplossing van de twee polymeren in een verhouding van 2 mengen.
4. gentransfectie in sferoïden
- Incubeer de cellen (hepatocytenof MSCs) voor 72 uur na het zaaien op de micropatterned platen, teneinde de vorming van rijpe sferoïden. Voor gentransfectie, voeg 100 ul van de polyplex nanomicelle oplossing (bevattende 10 pg pDNA) aan elk putje na vervanging van het kweekmedium met 1 ml vers medium. Ga door de incubatie met de nanomicelle oplossing voor 24 uur.
- Voor besturing met een lipide-gebaseerde transfectie reagens, meng pDNA oplossing met het reagens in een gewichtsverhouding reagens / pDNA van 3. Pas de laatste dosis van pDNA gelijk zijn voor zowel de op lipide gebaseerde reagens en nanomicelle methoden zijn.
5. Herstel en Transplantatie van de Cel Sferoïden
- Vervang het kweekmedium met 200 ul koud PBS en plaats de platen op ijs.
Opmerking: In het algemeen kunnen de sferoïden los in ongeveer 15 minuten en kan worden gerealiseerd in de vorm van een suspensie voor transplantatie. - Zuig de cellen in 200 glsuspensie op met een spuit met een 23 G en 27 G naald in vivo injectie.
6. Evaluatie van transgenexpressie
- Voor de in vitro evaluatie van de expressie van luciferase Gaussia afgescheiden in het kweekmedium, verzamel 50-100 ui van het medium exact 24 uur na vervanging door vers medium. Schat de luciferase expressie met behulp van een commercieel Renilla luciferase testsysteem en een luminometer volgens protocol van de fabrikant.
OPMERKING: De Gaussia luciferase blijft stabiel in het kweekmedium voor meer dan een week. Dus, om de real-time efficiency van de transgenexpressie evalueren vervangt het medium met verse één vóór het verzamelen van het monstermedium. De timing van de mediumverversing kunnen flexibel. - Voor de in vivo evaluatie van de transgenexpressie in gastheerdieren na celtransplantatie, verdoven BALB / c naakt muizen (vrouwelijk, 7 wekenoud) onder inhalatie-anesthesie met isofluraan.
- Plaats een muis in een kamer verbonden met een anesthesie met isofluraan machine voorzien in de kamer. Neem de muis na het in slaap vallen, en stel ze op de operatietafel met ventilatie met behulp van een masker. Controle van de isofluraan stromen ongeveer op 0,2-0,5 l / min door het controleren van de voorwaarden van de muis.
- Injecteer 200 ui van de celsuspensie die sferoïden getransfecteerd met het GL4-luciferase expressie pDNA (zoals beschreven in 4.1) in het subcutane weefsel van de buikstreek.
- Onmiddellijk na het injecteren van D-luciferine (150 mg / kg; intraveneuze route), meet de luciferase-expressie met behulp IVIS beeldvormingssysteem volgens het protocol van de fabrikant.
- Voor het evalueren van de therapeutische effecten van de celtransplantatie Injecteer 200 ui van de celsuspensie die sferoïden getransfecteerd met de coderende erytropoëtine pDNA in deonderhuidse weefsel van de buikstreek.
- Verzamel bloedmonsters door submandibulaire bloeden tot ongeveer 200 ul bloed 19 te verkrijgen. Meet de hemoglobine en hematocriet gebruik van een bloedmonster analyzer.
Opmerking: Het aantal cellen voor transplantatie wordt geregeld door het aantal gezaaid op de platen. Helaas is het moeilijk om het exacte aantal cellen te bepalen omdat het cijfer in sferoïden niet meetbaar.
- Verzamel bloedmonsters door submandibulaire bloeden tot ongeveer 200 ul bloed 19 te verkrijgen. Meet de hemoglobine en hematocriet gebruik van een bloedmonster analyzer.
- Na experimenten, plaats de muizen op een verwarmingselement verbonden met een temperatuurregelaar tot ontwaken uit narcose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gentransfectie van de Gaussia-luciferase expressie pDNA werd uitgevoerd in de sferoïden gevormd door de hepatocyten of MSCs middels polyplex nanomicelles of control lipide-gebaseerde transfectie reagens 12. De nanomicelles veroorzaakte vrijwel geen verandering in de bolvormige structuur in vergelijking met niet getransfecteerde sferoïden op micropatterned platen, terwijl het reagens aanzienlijk verstoord structuur dag na transfectie (Figuur 3). Na transfectie met behulp van de nanomicelles, consistente albumine-uitscheiding en de transgene (Gaussia luciferase) expressie goed werden gehandhaafd voor bijna een maand. Wanneer de reagens werd gebruikt, dat albumine uitscheiding waargenomen, hoewel de mate van de transgenexpressie vergelijkbaar met die verkregen uit de nanomicelles (figuur 4) 12.
Tijdens spheroïde herstel met behulp van de temperatuurgevoelige micropatterned platen, de 3D-sTRUCTUUR van de sferoïden was goed bewaard zowel primaire hepatocyten en MSCs in suspensie na herstel van de afgekoelde platen (Figuur 5). De structuur werd ook goed onderhouden na passeren sferoïden door middel van injectienaalden met een voldoende groot kaliber, zoals 23 (400 pm) en 27 G (220 pm) naalden.
Na subcutane injecties van de teruggewonnen hepatocyt sferoïden, werd luciferase-expressie gedetecteerd in de dieren langer dan enkele weken (figuur 6) 20. Albumine expressie van getransplanteerde hepatocyten waargenomen in het gastheerweefsel 20, wat suggereert dat de celfunctie werd behouden door het proces van bolvormige herstel en transplantatie. Om hun potentieel voor therapeutische toepassingen te testen, werden de hepatocyten sferoïden ook getransfecteerd met erytropoëtine coderende pDNA. Na subcutane transplantatie van de sferoïden expressie erythropoietin een significant hematopoietische effect werd verkregen bij de dieren gedurende één maand (Figuur 7) 20.
Figuur 3. Microscopische beelden van hepatocyten sferoïden (A, B) en MSC sferoïden (C, D) op een plaat micropatterned dag na gen transfectie middels polyplex nanomicelles (A, C) en lipide-gebaseerde reagens (B, D). Schaal bar:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. (A) Transgene expressie van Gaussia luciferase na transfecteren de levercel sferoïden. (B) albumine-uitscheiding vanDe hepatocyt sferoïden of hepatocyten in een monolaag kweek na de transfectie. Sferoïden werden getransfecteerd met behulp nanomicelle (●) of Control-lipide-gebaseerde transfectiereagens (○), of naakt pDNA (▲). De albumine-uitscheiding van de controle (ongetransfecteerde) hepatocyten (in sferoïden (△) of monolaagcultuur (x)) wordt ook getoond. De resultaten zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM; n = 4 voor monolaagkweek en n = 6 voor sferoïden. (Overgenomen met toestemming uit referentie 12). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Microscopische beelden van de hepatocyten in suspensie sferoïden na doorvoering (A) 23- of (B) 27 G injectienaalden Schaalbalk. 100 urn.
Figuur 6. Luciferase expressie in ontvangende muizen na hepatocyt transplantatie. Na 24 u na transfectie met luciferase (GL4) coderende pDNA de hepatocyt sferoïden en single-celsuspensie van de monolaag kweken werden getransplanteerd in het subcutane weefsel van de buikstreek. De luciferase uitdrukking in de ontvangende muizen werd geëvalueerd met behulp van een IVIS Imaging System (Overgenomen met toestemming uit referentie 20). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
IGUUR 7 "src =" / files / ftp_upload / 52.384 / 52384fig7.jpg "/>
Figuur 7. Hematopoiese transplanten van de erytropoëtine expressie hepatocyten. Hepatocyten in de bolvormige en monolaag kweken werden getransfecteerd met erytropoëtine coderende pDNA. Na 24 uur na transfectie werden de bolletjes en single-celsuspensies van monolaagkweken subcutaan getransplanteerd in de muis abdomen. Op 22 en 28 dagen na transplantatie werden (A) en hemoglobine (B) hematocrietwaarde gemeten vanaf de bloedmonsters. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM; n = 12 voor bolvormige en monolaag groepen en n = 6 voor onbehandelde controles. Statistische significantie werd bepaald door t-test een 2-tailed Student's (Overgenomen met toestemming uit referentie 20). Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijkenguur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol is het essentieel om de 3D structuur van sferoïden tijdens de stappen van gen introductie en sferoïde herstel behouden. Het is essentieel om een gunstig microenvironments behouden de cellen om celdood of verlies van celactiviteit te vermijden. Bijvoorbeeld, albumine uitscheiding, een vertegenwoordiger aangeboren functie van hepatocyten, goed geconserveerd in de hepatocyten sferoïden, terwijl de hepatocyten in de conventionele monolaag kweek verliezen snel hun secretoire capaciteit enkele dagen na zaaien 12. Voor MSCs, de sferoïden aanzienlijk de efficiëntie van differentiatie verhogen tot adipocyten of osteoblasten, met verhoogde expressieniveaus van genen betrokken bij adipogenese en osteogenese en neerwaartse regulatie van genen die de MSC zelfvernieuwing fenotype 4 handhaven.
Voor genintroductie, hadden verschillende transfectie reagentia eerder getest, waaronder op lipiden gebaseerde degenen (figuur 3, 4) enop basis van polymeren die, zoals polyethyleenimine. Jammer genoeg heeft geen van de reagentia verschaft succesvolle geninbrenging zonder verstoring van de bolvormige structuur. Vooral de lipide-gebaseerde reagentia meestal volledige verstoring van de sferoïden te induceren, alhoewel de transgenexpressie is efficiënt, zelfs in de overige cellen op micropatterned platen. Het is waarschijnlijk dat de lipide-gebaseerde reagentia induceren significant membraan destabilisatie, wat leidt tot hoge transgenexpressie, maar verstoren de sferoïden door waardoor de cel-cel interacties instabiel.
In tegenstelling, het kationogene polymeer verstoorde de sferoïden in mindere mate dan de lipiden, met name in de omstandigheden van lage N / P ratio, de polyplexen vormen. De standaard protocol hier getoonde gebruikt polyplex nanomicelles dat PEG afscherming bezitten. Alternatief kan polyplexen met kationische homopolymeren, zoals polyethyleenimine, ook voor genintroductie in de sferoïden. Inderdaad, cationic polyplexen zonder PEG oppervlak doorgaans hoge transgenexpressie in in vitro transfecties en zijn aantrekkelijke mogelijkheden, afhankelijk van het celtype en het doel van de sferoïde transplantatie.
Kenmerkend voor dit protocol is het gebruik van micropatterned kweekplaten bekleed met een temperatuurgevoelige polymeer. De micropatterned arrays kan een groot aantal cellen sferoïden te produceren met een uniforme diameter. Dit protocol maakt gebruik van 100 micrometer arrays diameter, maar dit aspect is flexibel; echter zeer grote diameters, zoals 500 urn, veroorzaken vaak celnecrose in de kern van de sferoïden (ongepubliceerde gegevens). Door simpelweg het afkoelen van de platen op ijs, kan de sferoïden worden verkregen in de vorm van een injecteerbare suspensie door voorzichtig afzuigen met een injectiespuit. Een mogelijke beperking van deze techniek is de grootte van de naald gebruikt om de bolletjes te injecteren. Bevestigd werd dat een 27-G naald veilig kan worden gebruikt voor sferoïden met 100 urn diameter. Echter, kunnen smalle naalden niet worden toegepast voor deze bolletjes. Aangezien een 27-G naald te groot, vooral voor transplanteren sferoïden in muis ruggenmerg, een mogelijk alternatief is voor scaffolds gebruiken om cellen te behouden binnen hen.
Dit protocol kan eventueel worden toegepast voor verschillende doeleinden van celtransplantatie. Vergeleken met de suspensie sferoïde kweeksysteem de micropatterned platen hebben als voordeel dat een voldoende aantal sferoïden met uniforme diameter eenvoudig kan worden verkregen. Hoewel de werkwijze van geninbrenging flexibel zijn, zoals eerder vermeld, polyplex nanomicelles met PEG afscherming zijn bijzonder effectief voor het vermijden sferoïde onderbreking. Hopelijk zal dit systeem de therapeutische effecten van getransplanteerde cellen verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We waarderen ten zeerste Dr. Takeshi Ikeya en technisch personeel in Toyo Gosei, Tokyo, Japan voor het verstrekken van temperatuurgevoelige micropatterned cultuur platen evenals wetenschappelijke adviezen. We danken ook mevrouw Satomi Ogura, mevrouw Sae Suzuki, mevrouw Asuka Miyoshi en mevrouw Katsue Morii voor technische bijstand met dierproeven. Dit werk werd financieel ondersteund in het kader van de JSPS KAKENHI Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek, het Centrum voor Innovatie (COI) Programma en de S-innovatieprogramma van de Japan Science and Technology Agency (JST), en de JSPS Core- to-Core Program, A. Advanced Research Networks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
