Abstract
Pour améliorer l'efficacité thérapeutique de la transplantation de cellules, un système de transplantation, de sphéroïdes injectables génétiquement modifiés a été développé. Les sphéroïdes de cellules sont préparés dans un système de culture sur des plaques de microélectrodes recouvertes d'un polymère thermosensible. Un certain nombre de sphéroïdes sont formées sur les plaques, correspondant aux zones d'adhésion cellulaire de 100 um de diamètre, régulièrement disposés de manière bidimensionnelle, entourées par des zones non adhésives qui sont recouvertes par un polyéthylène glycol de matrice (PEG). Les sphéroïdes peuvent facilement être récupérés sous forme d'une suspension liquide en abaissant la température des plaques, et leur structure est bien maintenu en les faisant passer à travers des aiguilles d'injection avec un calibre suffisamment grand (plus de 27 G). La modification génétique est obtenue par transfection des gènes en utilisant le support d'origine non virale gène, nanomicelle polyplexe, qui est capable d'introduire des gènes dans des cellules sans perturber la structure du sphéroïde. Pour primsphéroïdes d'hépatocytes aires transfectées avec un gène de la luciférase exprimant la luciférase est durablement obtenus chez les animaux transplantés, ainsi que la fonction des hépatocytes conservés, comme indiqué par l'expression de l'albumine. Ce système peut être appliqué à une variété de types de cellules comprenant des cellules souches mésenchymateuses.
Introduction
La thérapie cellulaire de la transplantation a attiré l'attention généralisée pour le traitement de diverses maladies incurables. L'activité et la demi-vie de facteurs bioactifs qui sont sécrétées par les cellules transplantées sont essentiels pour améliorer l'efficacité thérapeutique d'un système de greffe de cellules. La modification génétique des cellules avant transplantation est une technique utile pour réguler et manipuler les fonctions cellulaires, y compris la sécrétion de facteurs bioactifs. Il est également important de maintenir un micro-environnement favorable pour les cellules pour éviter la mort cellulaire ou la perte de l'activité cellulaire. Three-dimensional culture (3D) de cellules de sphéroïde, dans laquelle les interactions cellule-cellule sont bien conservés, est prometteuse à cet effet, par exemple, pour améliorer la sécrétion d'albumine à partir des hépatocytes primaires et favoriser la différenciation de lignées multiples à partir de cellules souches mésenchymateuses (MSC ) 1-7.
Dans cette étude, un nouveau système de combinaison de spheroid culture et transfection génique est utilisée pour servir de plate-forme pour une transplantation de cellules génétiquement modifiées. Pour la création de cellules sphéroïdes, un système de culture sphéroïde sur des plaques de culture microélectrodes est utilisé. Sur ces plaques, les zones d'adhésion cellulaire de 100 um de diamètre sont régulièrement disposées de manière bidimensionnelle et sont entourées par des zones non adhésives revêtues par une matrice 3 de PEG. Par ensemencement d'un nombre suffisant de cellules, des matrices de sphéroïdes 3D de 100 um de diamètre correspondant sont formés dans le lit de culture microélectrodes.
Les sphéroïdes sont récupérés sans perturber leur structure 3D en utilisant thermosensibles plaques de culture cellulaire, qui a été revêtu d'un polymère thermosensible, poly (iso-propylacrylamide) (PIPAAm) 10/08. L'architecture microélectrodes est construit sur les plaques thermosensibles (construit sur mesure). En abaissant simplement la température des plaques, les sphéroïdes sont détachés du lit de culture et se dispersentd en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ainsi, un grand nombre de sphéroïdes d'une taille uniforme de 100 um peut être obtenue sous la forme d'une suspension injectable.
Figure 1. Représentation schématique du système de culture sur une plaque sphéroïde microélectrodes. La modification génétique est obtenue par transfection des gènes en utilisant le support de gène non viral initial, nanomicelle polyplex. Il est composé d'ADN plasmidique (ADNp) et de polyéthylène glycol (PEG) des copolymères séquencés de 11 -polycation. Celles-ci ont une structure noyau-enveloppe caractéristique qui consiste en une coquille PEG et un noyau interne de pDNA condensée, permettant l'introduction du gène sûr et efficace dans les cellules à des fins thérapeutiques 11. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de this figure.
Figure 2. Structure de la nanomicelle polyplexe formé par le complexe d'acides nucléiques et des copolymères à blocs PEG-bloc-polycation. Dans cette étude, le principal avantage de cette technique est que la structure sphéroïde ne soit pas perturbé par transfection génique pendant les nanomicelles. Après les transfections à médiation par des nanomicelle de sphéroïdes d'hépatocytes de rat primaires, l'expression du transgène est obtenu prolongée pendant plus d'un mois avec continu sécrétion d'albumine à partir des hépatocytes à un niveau comparable à celui de sphéroïdes non transfectées 12. L'expression du transgène et de sécrétion d'albumine dans les sphéroïdes sont également maintenus après la récupération à partir des plaques thermosensibles. Il est évident que nanomicelles peuvent faciliter en toute sécurité l'introduction du gène sans altérer les fonctions innées de l'hépatiteatocytes. Ainsi, la combinaison de cellules cultivées sur des plaques sphéroïde micropatterned thermosensibles avec l'introduction du gène en utilisant nanomicelles est une plate-forme prometteuse pour la transplantation de cellules génétiquement modifiées. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
Toutes les études sur les animaux ont été menées avec l'approbation du Comité soin et l'utilisation des animaux de l'Université de Tokyo, Tokyo, Japon.
1. Préparation des cellules
- Pour hépatocytes primaires, suivre le protocole pour l'isolement des hépatocytes de rat par un processus de digestion de collagénase en deux étapes modifiée 13,14.
- Anesthésier Sprague Dawley (SD) des rats (mâles, âgés de 5 semaines) sous anesthésie par inhalation avec de l'isoflurane. Placer un rat dans une chambre reliée à un appareil d'anesthésie à l'isoflurane pour fournir de la chambre. Sortez le rat après l'endormissement, et le mettre sur la table d'opération avec une ventilation en utilisant un masque. Contrôler l'isoflurane écouler approximativement à 0,4 à 0,7 L / min en vérifiant les conditions du rat. Perfuser le foie de Sprague Dawley (SD) des rats (mâles, âgées de 5 semaines) à partir de la veine porte hépatique avec une solution spéciale composée de 8 g / L de chlorure de sodium (NaCl), 400 mg / L de chlorure de potassium (KCl), 78 mg / Lle dihydrogénophosphate de sodium dihydrate (NaH 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 mg / l phosphate disodique dodécahydraté (Na 2 HPO 4 · 12H 2 O), 2,38 g / L d'acide 2- [4- (2-hydroxyéthyl) -1 pipérazinyl] éthanesulfonique (HEPES), 190 mg / L d'acide éthylèneglycol tétraacétique (EGTA), 350 mg / L de carbonate acide de sodium (NaHCO 3), et 900 mg / L de glucose.
- Faire circuler une solution de collagénase à travers le foie.
REMARQUE: La solution est composé de 500 mg / L collagénase, 9,8 g / saline tamponnée de L Hank, 2,38 g / ml d'HEPES, 556 mg / ml de chlorure de calcium hydraté (CaCl 2 · H 2 O), 350 mg / L de NaHCO 3, et l'inhibiteur de trypsine / L de 50 mg, avec le pH ajusté à 7,2. - Retirer soigneusement le foie, et hacher le doucement sur un plat en utilisant une lame de scalpel, ajouter milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), et filtrer la suspension de cellules à travers un 100 ummaille de nylon. Pour retirer les débris supplémentaires, centrifuger la suspension cellulaire à 20 g pendant 1 min. A ce stade, les hépatocytes sont dans le surnageant.
- Répétez l'étape de centrifugation deux fois (un total de trois centrifugations). Enfin, centrifuger les hépatocytes à 50 g pendant 3 min pour les récupérer sous la forme d'une pastille.
- Re-suspendre les hépatocytes à une concentration de 4 x 10 5 cellules / ml dans un milieu de culture spécial composé de DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1% de Pen-Strep-Glut (PSQ), 1% de diméthylsulfoxyde (DMSO), 0,1 umol / L dexaméthasone, 0,5 pg / ml d'insuline, 10 mmol / L nicotinamide, 0,2 mmol / L ascorbate phosphorylé (Asc-2P), et 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique humain (hEGF) 15. Ce milieu spéciale est obligatoire pour la préservation de la fonction hépatique dans des conditions in vitro.
- Pour obtenir CSM de rats, euthanasier Sprague Dawley (SD) des rats (mâles, âgés de 5 semaines) par l'administration excessive de isoflurane. Réséquer les fémurs et tibias, et de recueillir les moelle osseuse en insérant une aiguille 22 G dans le corps de l'os de la nettoyer avec 10 ml de DMEM complété avec 10% de FBS. Recueillir les cellules par filtration à travers un tamis en nylon de 100 um.
- Ensemencer les cellules sur 10 boîtes de culture cm en utilisant du DMEM contenant 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine. Pour les expériences de sphéroïde, utiliser MSC dans les 5 passages.
2. Préparation de sphéroïdes cellulaires 3D
- Obtenir dans le commerce des plaques de culture microélectrodes, sur lequel les zones adhésives cellulaires sont régulièrement disposés à 100 um de diamètre de façon bidimensionnelle, entouré par des zones non adhésives revêtues par la matrice de PEG.
NOTE: Pour la transplantation de cellules, une couche supplémentaire avec le PIPAAm de polymère thermosensible est nécessaire pour permettre le détachement des cellules en refroidissant les plaques (voir étape 5.1). Les fluctuations de température peuvent induire des changements dans la chimie de ce polymère10.8. A 37 ° C, PIPAAm est légèrement hydrophobe, ce qui permet aux cellules d'être cultivées dans des conditions normales. Une diminution de la température en dessous de 32 ° C entraîne une hydratation rapide du polymère, conduisant au détachement spontané des cellules. - Ensemencer les cellules souches mésenchymateuses ou des hépatocytes sur des plaques à 12 puits à une densité de microélectrodes de 4 x 10 5 cellules / puits les andincubate à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2. Les cellules seront accumuler sur les zones d'adhérence microélectrodes et de former progressivement sphéroïdes rondes en 2 jours.
Remarque: Pour la préparation de cellules de contrôle dans une culture monocouche, en utilisant des plaques à 12 puits normales et ensemencer les cellules à une densité identique, suivant une procédure similaire à celle décrite ci-dessus.
3. Préparation de Polyplex nanomicelles
- Synthétiser un copolymère séquence de PEG-pAsp (DET) (poly [N '- [N - (2-aminoéthyl) -2-aminoéthyl] aspartamide]) (PEG Mw = 12,000, le degré de polymérisation (DP) du PASP (DET) Segment = 59), et un homopolymère qui est composé de seulement le segment cationique [PASP (DET)] (DP = 55), suivant les procédures décrites précédemment par les 11 auteurs, 16, 17.
- Préparer une solution mixte du copolymère séquencé (DET) PEG-pAsp et PASP (DET) homopolymère dans un rapport molaire égal de groupes amino résiduels dans 10 mM de tampon HEPES (pH 7,3) en ajustant la concentration en polymère de 33,3 ug / ml et 19,1 ug / ml, respectivement.
REMARQUE: Les concentrations de polymère décrits ci-dessus sont des valeurs représentatives pour la préparation nanomicelles avec un taux résiduel molaire des groupes acides totaux dans les deux polymères aux groupes phosphate dans le ADNp (N / P) de 10. Le rapport N / P peut varier selon le type de cellule et le but (pour plus de détails, voir Discussion). L'utilisation combinée de ces deux polymères peut atteindre à la fois un blindage efficace de PEG et le fonctionnement du PASP (DET) afin d'améliorer endosomiqueéchapper (pour plus de détails, voir discussion) 18. - Préparer la luciférase ADNp codant Gaussia, GL4 luciférase, ou érythropoïétine en clonant le segment exprimant les gènes respectifs dans le plasmide pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) pour obtenir une expression sous la CAG promoteur / amplificateur en utilisant un kit commercial selon le protocole du fabricant. Amplifier l'ADNp dans une souche d'Escherichia coli compétent et le purifier en utilisant un système de purification d'ADN plasmide exempt d'endotoxine. Déterminer la concentration d'ADNp à une absorbance de 260 nm pour obtenir une solution / ml 150 ug dans du tampon HEPES 10 mM (pH 7,3).
- Pour préparer les nanomicelles polyplexe, bien mélanger la solution d'ADNp (150 ug / ml dans du tampon HEPES 10 mM) et la solution de prémélange des deux polymères dans un rapport de 2: 1 (en volume).
4. Gene transfection dans Sphéroïdes
- Incuber les cellules (hépatocytesou MSC) pendant 72 heures après l'ensemencement sur des plaques microélectrodes pour permettre la formation de sphéroïdes matures. Pour la transfection de gènes, ajouter 100 ul de la solution de polyplex nanomicelle (contenant 10 pg d'ADNp) dans chaque puits après avoir remplacé le milieu de culture avec 1 ml de milieu frais. Poursuivre l'incubation avec la solution de nanomicelle pendant 24 heures.
- Pour un contrôle en utilisant un réactif de transfection à base de lipides, mélanger les solutions ADNp avec le réactif à un rapport en poids de réactif / de l'ADNp 3. Ajuster la dose finale d'ADNp à être égale à la fois pour le réactif à base de lipides et les méthodes de nanomicelle.
5. Récupération et la transplantation de Sphéroïdes cellulaires
- Remplacez le milieu de culture avec 200 pi de PBS froide et placer les plaques sur de la glace.
NOTE: En général, les sphéroïdes peuvent se détacher dans environ 15 min et peut être récupéré sous la forme d'une suspension pour la transplantation. - Aspirer délicatement les cellules dans le 200 pisuspension en utilisant une seringue avec une aiguille 23 G ou 27 G pour injections in vivo.
6. Évaluation de l'expression transgénique
- Pour l'évaluation in vitro de l'expression de la luciférase de Gaussia sécrétée dans le milieu de culture, de recueillir de 50 à 100 ul de milieu précisément 24 heures après le remplacement par du milieu frais. Estimer l'expression de la luciférase en utilisant un système de dosage de la luciférase de Renilla commercial et un luminomètre selon le protocole du fabricant.
NOTE: La luciférase Gaussia reste stable dans le milieu de culture pour plus d'une semaine. Ainsi, pour évaluer l'efficacité en temps réel de l'expression du transgène, remplacer le milieu avec une douce avant de recueillir le milieu de l'échantillon. Le calendrier de la changement de milieu peut être flexible. - Pour l'évaluation de l'expression du transgène dans des animaux hôtes in vivo après transplantation de cellules, anesthésier souris BALB / c nu (femelle; 7 semainesancienne) sous anesthésie par inhalation avec de l'isoflurane.
- Placer une souris dans une chambre reliée à un appareil d'anesthésie à l'isoflurane pour fournir de la chambre. Sortez la souris après l'endormissement, et le mettre sur la table d'opération avec une ventilation en utilisant un masque. Contrôler l'isoflurane écouler approximativement à 0,2 à 0,5 L / min en vérifiant les conditions de la souris.
- Injecter 200 ul de la suspension cellulaire contenant des sphéroïdes transfectées avec les ADNp exprimant la luciférase GL4 (comme décrit en 4.1) dans le tissu sous-cutané de la région abdominale.
- Immédiatement après l'injection de D-luciférine (150 mg / kg; voie intraveineuse), mesurer l'expression de la luciférase en utilisant le système d'imagerie IVIS selon le protocole du fabricant.
- Pour évaluer les effets thérapeutiques de la transplantation de cellules, injecter 200 ul de la suspension cellulaire contenant des sphéroïdes transfectées avec les ADNp codant pour l'érythropoïétine dans latissu sous-cutané de la région abdominale.
- Recueillir des échantillons de sang par des saignements sous-maxillaire pour obtenir environ 200 pi de sang 19. Mesurer le taux d'hémoglobine et l'hématocrite utilisant un échantillon de sang analyseur.
REMARQUE: Le nombre de cellules pour la transplantation est réglementée par le nombre ensemencées sur les plaques. Malheureusement, il est difficile de déterminer le nombre de cellules exacte parce que le nombre à l'intérieur sphéroïdes ne peut être mesurée.
- Recueillir des échantillons de sang par des saignements sous-maxillaire pour obtenir environ 200 pi de sang 19. Mesurer le taux d'hémoglobine et l'hématocrite utilisant un échantillon de sang analyseur.
- Après des expériences, placez la souris sur un coussin chauffant relié à un contrôleur de température jusqu'à ce que l'éveil de l'anesthésie.
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Representative Results
Gene transfection de la luciférase de Gaussia exprimant ADNp a été effectuée dans les sphéroïdes formés par les hépatocytes ou les cellules souches mésenchymateuses à l'aide nanomicelles Polyplex ou le réactif de transfection à base de lipide de commande 12. Les nanomicelles induites pratiquement aucun changement dans la structure de sphéroïde par rapport à sphéroïdes non transfectées microélectrodes sur les plaques, tandis que le réactif de contrôle perturbé de manière significative la structure d'un jour après la transfection (figure 3). Après transfection en utilisant les nanomicelles, la sécrétion d'albumine cohérente et le transgène (Gaussia luciférase) expression ont été bien entretenu pendant presque un mois. Toutefois, lorsque le réactif de contrôle a été utilisé, aucune sécrétion d'albumine a été observée, bien que le degré de l'expression du transgène était similaire à celle obtenue à partir des nanomicelles (figure 4) 12.
Lors de la récupération sphéroïde utilisant les plaques micropatterned thermosensibles, la 3D structure des sphéroïdes a été bien conservé, tant pour les hépatocytes primaires et les MSC en suspension après récupération à partir des plaques refroidies (Figure 5). La structure a été maintenue aussi bien après le passage à travers les sphéroïdes aiguilles d'injection avec un calibre suffisamment grand, tel que le 23 (400 pm) et 27 g (220 um) d'aiguilles.
Après des injections sous-cutanées de sphéroïdes d'hépatocytes récupérés, expression de la luciférase n'a été détectée chez les animaux pendant plus de quelques semaines (Figure 6) 20. Expression de l'albumine hépatocytes transplantés a été observée dans le tissu de l'hôte 20, ce qui suggère que la fonction des cellules a été préservée au cours du processus de récupération sphéroïde et la transplantation. Pour tester leur potentiel pour des applications thérapeutiques, les sphéroïdes d'hépatocytes ont également été transfectées avec l'érythropoïétine encodage pDNA. Après la transplantation sous-cutanée de sphéroïdes exprimant erythropoietin, un effet significatif hématopoïétique a été obtenu chez les animaux pendant un mois (Figure 7) 20.
Figure 3. Les images microscopiques de sphéroïdes d'hépatocytes (A, B) et sphéroïdes MSC (C, D) sur une plaque microélectrodes un jour après transfection de gènes, en utilisant nanomicelles polyplexe (A, C) ou réactif à base de lipides (B, D). Barre d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. (A) L'expression du transgène de luciférase de Gaussia après transfection des sphéroïdes d'hépatocytes. (B) de sécrétion d'albumine à partir deles sphéroïdes ou des hépatocytes hépatocytes dans une culture monocouche après la transfection. Sphéroïdes sont transfectées en utilisant nanomicelle (●) ou contrôler réactif de transfection à base de lipides (○), ou ADNp nu (▲). La sécrétion d'albumine à partir du contrôle non transfectées (hépatocytes) (dans sphéroïdes (△) ou culture monocouche (x)) est également indiquée. Les résultats sont représentés sous forme de moyenne ± SEM; n = 4 pour la culture monocouche et n = 6 pour les sphéroïdes. (Reproduit avec la permission de la référence 12). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Les images microscopiques de sphéroïdes d'hépatocytes en suspension après passage dans (A) ou (23- B) 27 g d'aiguilles d'injection de la barre Echelle:. 100 um.
Figure 6. expression de la luciférase chez la souris de l'hôte après transplantation d'hépatocytes. Au bout de 24 heures après la transfection avec de la luciférase (GL4) -encoding ADNp, les sphéroïdes d'hépatocytes et de la suspension de cellules isolées à partir des cultures monocouches ont été transplantées dans le tissu sous-cutané de la région abdominale. L'expression de la luciférase dans les souris d'accueil a été évaluée en utilisant un système d'imagerie IVIS (Reproduit avec la permission de la référence 20). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 7. hématopoïèse après la transplantation des hépatocytes exprimant d'érythropoïétine. Hépatocytes dans les sphéroïdes et cultures monocouches ont été transfectées avec l'érythropoïétine-encodage pDNA. Après 24 heures de transfection, les sphéroïdes et des suspensions monocellulaires à partir des cultures monocouches ont été transplantées par voie sous- cutanée dans l'abdomen de la souris. A 22 et 28 jours après la transplantation, (A) et l'hémoglobine (b) les niveaux d'hématocrite ont été mesurées à partir des échantillons de sang. Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM; n = 12 pour sphéroïde et groupes monocouches et n = 6 pour les contrôles non traités. La signification statistique a été déterminé par le test t de Student 2-tailed (Reproduit avec la permission de la référence 20). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette fifigure.
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Discussion
Dans ce protocole, il est essentiel de maintenir la structure 3D de sphéroïdes lors des étapes d'introduction de gène et la récupération de sphéroïde. Il est essentiel de maintenir un micro-environnements favorables pour les cellules afin d'éviter la mort cellulaire ou la perte de l'activité cellulaire. Par exemple, la sécrétion d'albumine, une fonction innée représentant des hépatocytes, est bien conservés dans les sphéroïdes d'hépatocytes, tandis que les hépatocytes dans la culture monocouche classique perdent rapidement leur capacité de sécrétion quelques jours après l'ensemencement 12. Pour MSC, les sphéroïdes améliorer significativement leur efficacité de différenciation en adipocytes ou ostéoblastes, des niveaux accrus de gènes impliqués dans l'adipogenèse et l'ostéogenèse expression et la régulation des gènes qui maintiennent le MSC auto-renouvellement phénotype 4.
Pour l'introduction de gènes, divers réactifs de transfection ont été testés précédemment, y compris ceux à base de lipides (Figure 3, 4) etceux à base de polymères, tels que la polyéthylèneimine. Malheureusement, aucun des réactifs fournis introduction de gène réussi sans perturber la structure du sphéroïde. En particulier, les réactifs à base de lipides ont tendance à induire une perturbation complète des sphéroïdes, bien que l'expression du transgène est efficace, même dans les cellules restant sur les plaques microélectrodes. Il est probable que les réactifs à base de lipides provoquent une déstabilisation significative de la membrane, conduisant à une expression élevée du transgène, mais perturbent les sphéroïdes en rendant les interactions de cellule à cellule instable.
En revanche, le polymère cationique perturbé les sphéroïdes dans une moindre mesure que les lipides, en particulier dans les conditions de rapports / P faible N, pour former les polyplexes. Le protocole standard montrée ici utilise nanomicelles de polyplexe qui possèdent PEG blindage. Alternativement, polyplexes avec homopolymères cationiques, tels que la polyéthylèneimine, peuvent également être utilisés pour l'introduction de gènes dans les sphéroïdes. En effet, cationic polyplexes la surface sans PEG prévoient généralement l'expression du transgène en haut transfections in vitro et sont des options attrayantes en fonction du type de cellule et le but de la transplantation de sphéroïde.
Un trait caractéristique de ce protocole consiste à utiliser des plaques de culture revêtues de microélectrodes un polymère thermosensible. Les tableaux microélectrodes peuvent produire un grand nombre de sphéroïdes de cellules avec un diamètre uniforme. Ce protocole utilise 100 um tableaux de diamètre, mais cet aspect est flexible; Cependant, de très grands diamètres, par exemple 500 um, sont souvent la cause la nécrose des cellules dans le noyau des sphéroïdes (données non publiées). Par simplement les plaques de refroidissement sur de la glace, les sphéroïdes peuvent être obtenus sous la forme d'une suspension injectable par aspiration douce avec une seringue. Une limitation potentiel de cette technique est la taille de l'aiguille utilisée pour injecter les sphéroïdes. Il a été confirmé que une aiguille 27-G peut être utilisé en toute sécurité pour les sphéroïdes avec 100 um diameter. Cependant, aiguilles étroites ne peuvent pas être appliquées pour ces sphéroïdes. Depuis une aiguille 27 G est trop grande, en particulier pour la transplantation de la moelle épinière dans des sphéroïdes de souris, une solution possible est d'utiliser les échafaudages pour retenir les cellules à l'intérieur.
Ce protocole peut être appliqué éventuellement à plusieurs fins de transplantation cellulaire. Par rapport au système de suspension de culture sphéroïde, les plaques microélectrodes présentent l'avantage qu'un nombre suffisant de sphéroïdes avec un diamètre uniforme peut être facilement obtenu. Bien que le procédé d'introduction de gène peut être flexible, comme mentionné précédemment, nanomicelles polyplexe avec PEG blindage sont particulièrement efficaces pour éviter la perturbation du sphéroïde. Espérons que ce système permettra d'améliorer les effets thérapeutiques des cellules transplantées.
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Acknowledgments
Nous sommes profondément reconnaissants à Dr. Takeshi Ikeya et le personnel technique dans Toyo Gosei, Tokyo, Japon pour fournir des plaques de culture microélectrodes thermosensibles ainsi que des conseils scientifiques. Nous remercions également Mme Ogura Satomi, Mme Sae Suzuki, Mme Asuka Miyoshi et Mme Katsue Morii d'assistance technique avec des expérimentations animales. Ce travail a été soutenu financièrement en partie par la JSPS KAKENHI Grant-in-Aid pour la recherche scientifique, le Centre du Programme d'innovation (COI) et le programme d'innovation de l'Agence S Japan Science and Technology (JST), et de la JSPS Core- à-Core Programme, A. Réseaux de recherche avancée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
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