Abstract
כדי לשפר את היעילות הטיפולית של השתלת תאים, מערכת השתלה, spheroids זריקות מהונדס גנטי פותחה. Spheroids התא ערוכים מערכת תרבות על צלחות micropatterned מצופות פולימר thermosensitive. מספר spheroids נוצרים על הצלחות, מתאים לאזורי הידבקות תא של 100 מיקרומטר קוטר הערוך באופן קבוע באופן דו-ממדי, מוקפים באזורים שאינם דבקים שהם מצופים בפוליאתילן גליקול מטריצה (PEG). ניתן לשחזר בקלות spheroids כהשעיה נוזלית על ידי הורדת הטמפרטורה של הצלחות, והמבנה שלהם נשמר היטב על ידי עובר אותם באמצעות מחטי הזרקה עם קליבר גדול מספיק (מעל 27 G). שינוי גנטי מושגת על ידי transfection גן באמצעות המוביל המקורי שאינו נגיפי הגן, nanomicelle polyplex, אשר מסוגל החדרת גנים לתאים מבלי לשבש את מבנה אליפטית. לחסודspheroids hepatocyte ארי transfected עם גן להביע לוציפראז, לוציפראז מתקבל בר קיימא בבעלי חיים מושתלים, יחד עם פונקצית hepatocyte נשמר, כפי שצוין על ידי ביטוי אלבומין. מערכת זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי גזע mesenchymal.
Introduction
טיפול השתלת תאים משך תשומת לב נרחבת לטיפול במחלות שונות סוררות. הפעילות וזמן מחצית החיים של גורמים ביו המופרשים על ידי התאים המושתלים הם חיוניים ליעילות טיפולית משופרת של מערכת השתלת תאים. הנדסה גנטית של התאים לפני ההשתלה היא טכניקה מועילה להסדיר ולטפל פונקציות סלולריות, כולל ההפרשה של הגורמים ביו. כמו כן, חשוב לשמור על מייקרו-סביבה נוחה לתאים למניעת מוות של תאים או הפסד של פעילות תא. תרבות תלת ממדי תא (3D) אליפטית, שבו אינטראקציות תא אל התא נשמרות היטב, מבטיחה למטרה זו, למשל, לשיפור הפרשת אלבומין מhepatocytes העיקרי וקידום בידול רב שושלת מתאי גזע mesenchymal (MSCs ) 1-7.
במחקר זה, מערכת שילוב רומן של spheroiתרבות ד וtransfection הגן משמש לשמש כפלטפורמה להשתלת תאים מהונדסת גנטי. ליצירת תאי אליפטית, משמשת מערכת תרבות אליפטית על צלחות תרבות micropatterned. על צלחות אלה, אזורי הידבקות תא של 100 מיקרומטר קוטר ערוכים באופן קבוע באופן דו-ממדי ומוקפים באזורים שאינם דבקים המצופים על ידי מטריקס PEG 3. על ידי זריעת מספר מספיק של תאים, מערכים של spheroids 3D של 100 מיקרומטר בקוטר נוצרים מתאים למיטת תרבות micropatterned.
Spheroids הם התאוששו מבלי לשבש את המבנה שלהם 3D באמצעות צלחות תרבית תאי thermosensitive, שמצופים בפולימר thermosensitive, פולי (ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) 8-10. ארכיטקטורת micropatterned בנויה על צלחות thermosensitive (שנבנה מותאם אישית). פשוט על ידי הורדת הטמפרטורה של הצלחות, spheroids מנותק מהמיטה התרבות ולפזרד בפוספט שנאגרו מלוח (PBS). לפיכך, ניתן להשיג מספר רב של spheroids עם גודל אחיד של 100 מיקרומטר בצורה של השעיה להזרקה.
איור 1. ייצוג סכמטי של מערכת תרבות אליפטית על צלחת micropatterned. שינוי גנטי מושגת על ידי transfection גן באמצעות המוביל המקורי שאינו נגיפי הגן, nanomicelle polyplex. הוא מורכב מפלסמיד דנ"א (pDNA) וקופולימרים לחסום -polycation פוליאתילן גליקול (PEG) 11. יש לי אלה מבנה ליבה-קליפה אופיינית מורכב מפגז PEG וליבה פנימית של pDNA תמצית, המאפשר הקדמת גן בטוחה ויעילה לתאים למטרות טיפוליות 11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של תידמות של.
איור 2. מבנה של nanomicelle polyplex שהוקם על ידי המורכב של חומצות גרעין וקופולימרים לחסום PEG-הגוש-polycation. במחקר זה, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שמבנה אליפטית לא יופרע במהלך transfection גן על ידי nanomicelles. לאחר transfections תיווך nanomicelle של spheroids hepatocyte העיקרי עכברוש, ביטוי transgene ממושך מתקבל ליותר מחודש עם הפרשת אלבומין רציפה מhepatocytes ברמה דומה לזו של spheroids untransfected 12. ביטוי transgene והפרשת אלבומין מspheroids גם נשמרים לאחר התאוששות מהצלחות thermosensitive. ברור שnanomicelles יכול להקל מבוא גן בבטחה מבלי לפגוע בפונקציות המולדת של ממולחatocytes. לפיכך, שילוב של תאי אליפטית תרבותיים על צלחות micropatterned thermosensitive עם מבוא גן באמצעות nanomicelles היא פלטפורמה מבטיחה להשתלת תאים מהונדסת גנטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים בבעלי החיים שנערכו באישור ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה של טוקיו, טוקיו, יפן.
1. תא הכנה
- לhepatocytes העיקרי, בצע את הפרוטוקול לבידוד hepatocyte מחולדה בתהליך עיכול collagenase שני שלבים שונה 13,14.
- להרדים חולדות ספראג Dawley (SD) (זכר, 5 שבועות) תחת הרדמה משאיפת עם isoflurane. מניחים חולדה בתא מחובר למכונת הרדמה כדי לספק isoflurane לתא. קח את העכברוש לאחר להירדם, והניח אותו על שולחן הניתוחים עם אוורור באמצעות מסכה. לשלוט על זרימת isoflurane כ ב0.4-0.7 L / min על ידי בדיקת התנאים של החולדה. Perfuse את הכבדים של ספראג Dawley (SD) חולדות (זכר, 5 שבועות) מוריד השער הכבד עם פתרון מיוחד המורכב של נתרן כלורי 8 גרם / L (NaCl), כלוריד 400 מ"ג / ליטר אשלגן (KCl), 78 מ"ג / Ldodecahydrate פוספט מימן disodium dihydrate פוספט dihydrogen נתרן (אא 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 מ"ג / ליטר (Na 2 HPO 4 · O 12H 2), 2.38 גר '/ ל' 2 [4 (2-hydroxyethyl) -1 -piperazinyl] קרבונט מימן נתרן חומצת ethanesulfonic (HEPES), 190 מ"ג / ליטר חומצת אתילן גליקול tetraacetic (EGTA), 350 מ"ג / ליטר (NaHCO 3), ו -900 גלוקוז מ"ג / ליטר.
- להפיץ פתרון collagenase דרך כבד.
הערה: הפתרון מורכב של 500 מ"ג / collagenase L, / מלח של L האנק 9.8 גרם נאגר, 2.38 גר '/ מיליליטר HEPES, 556 מ"ג / מימה סידן כלורי מיליליטר (CaCl 2 · O H 2), 350 מ"ג / ליטר NaHCO 3, ומעכב 50 מ"ג / ליטר טריפסין, עם החומציות מותאמת ל7.2. - הסר את הכבד בזהירות, ובררת אותו בעדינות על צלחת באמצעות סכין אזמל, להוסיף בינוני של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), השתנה Dulbecco ולסנן את ההשעיה התא דרך 100 מיקרומטררשת ניילון. כדי להסיר פסולת נוספת, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 20 × גרם דקות 1. בשלב זה, hepatocytes נמצא בsupernatant.
- חזור על שלב צנטריפוגה פעמיים (בסך הכל שלוש centrifugations). לבסוף, צנטריפוגות hepatocytes ב 50 × גרם במשך 3 דקות לשחזר אותם בצורה של גלולה.
- להשעות מחדש hepatocytes לריכוז של 4 × מיליליטר / 10 5 תאים במדיום תרבות מיוחד המורכב מDMEM בתוספת 10% FBS, 1% עט-דלקת-שפע (PSQ), 1% sulfoxide דימתיל (DMSO), 0.1 dexamethasone μmol / L, 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, nicotinamide / L 10 mmol, ascorbate 0.2 mmol / L פוספורילציה (ASC-2P), ו- 10 ng / ml גורם האנושי צמיחת אפידרמיס (hEGF) 15. מדיום מיוחד זה הוא חובה לשמירה על התפקוד הכבד בתנאים במבחנה.
- לקבלת MSCs חולדה, להרדים ספראג Dawley חולדות (SD) (זכר, 5 שבועות) על ידי ממשל יתר של isoflurAne. לכרות עצמות הירך וtibias, ולאסוף את קישואי עצם על ידי החדרת מחט G 22 לתוך הפיר של העצם כדי לשטוף אותו עם 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS. לאסוף את התאים על ידי סינון דרך רשת ניילון 100 מיקרומטר.
- זרעי התאים על 10 מנות תרבות סנטימטר באמצעות DMEM המכיל 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. לניסויי אליפטית, להשתמש MSCs בתוך 5 קטעים.
2. הכנת Spheroids הסלולרי 3D
- מסחרי להשיג צלחות תרבות micropatterned, שבאזורי דבק התא ערוכים באופן קבוע ב 100 מיקרומטר קוטר באופן דו-ממדי, מוקף באזורים שאינם דבקים המצופים על ידי מטריקס PEG.
הערה: להשתלת תאים, ציפוי נוסף עם PIPAAm פולימר thermosensitive הכרחי כדי לאפשר ניתוק תא על ידי קירור הצלחות (ראה שלב 5.1). תנודות טמפרטורה יכולה לגרום לשינויים בכימיה של פולימרים זה8-10. על 37 מעלות צלזיוס, PIPAAm הוא מעט הידרופובי, מאפשר לתאים להיות מתורבת בתנאים רגילים. ירידה בטמפרטורה מתחת 32 ° C תוצאות בלחות מהירה של הפולימר, שהובילה לניתוק הספונטני של התאים. - זרעי hepatocytes או MSCs על 12 גם צלחות micropatterned בצפיפות של 4 × 10 5 תאים / גם andincubate על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2. התאים יצטברו באזורי הדבקת micropatterned ויוצרים spheroids סיבוב בהדרגה ב 2 ימים.
הערה: להכנת תאי שליטה בתרבות monolayer, להשתמש בצלחות 12 גם נורמליות וזרע התאים בצפיפות זהה, לאחר הליך דומה כפי שתואר לעיל.
3. הכנת Polyplex Nanomicelles
- לסנתז קופולימר בלוק, PEG-PAsp (DET) (פולי [N '- [N - (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] aspartamide]) (PEG Mw = 12,000, תואר פילמור (DP) של PAsp מגזר (DET) = 59), וhomopolymer שמורכב מרק מגזר קטיוני [PAsp (DET)] (DP = 55), בעקבות ההליכים שתוארו קודם לכן על ידי מהחברים 11, 16, 17.
- הכן פתרון מעורב של PEG-PAsp קופולימר הבלוק (DET) וhomopolymer PAsp (DET) ביחס טוחנת שווה של קבוצות אמינו שיורית בחיץ 10 מ"מ HEPES (pH 7.3) על ידי התאמת ריכוז הפולימר ל33.3 מיקרוגרם / מיליליטר ו 19.1 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה.
הערה: ריכוזי הפולימר שתוארו לעיל הם ערכי נציג להכנת nanomicelles עם יחס שייר טוחנת בסך הכל קבוצות אמינו בשני פולימרים לקבוצות פוספט בpDNA (N / יחס P) של 10. היחס / P N יכול להשתנות בהתאם לסוג התא והמטרה (לפרטים, ראה דיון). השימוש בשילוב של שני פולימרים יכול להשיג את שניהם מיגון יעיל PEG ותפקוד של PAsp (DET) כדי לשפר את endosomalלברוח (לפרטים, ראה דיון) 18. - הכן את לוציפראז pDNA קידוד Gaussia, לוציפראז GL4, או אריתרופויאטין על ידי שיבוט המקטע המבטא את הגנים המתאימים לפלסמיד pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) כדי לקבל ביטוי תחת האמרגן / משפר CAG באמצעות ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. להגביר את pDNA בזן coli Escherichia מוסמך ולטהר אותו באמצעות מערכת טיהור פלסמיד דנ"א ללא רעלן פנימי. קבע את ריכוז pDNA בספיגה של 260 ננומטר כדי להשיג פתרון / מיליליטר 150 מיקרוגרם בחיץ 10 מ"מ HEPES (pH 7.3).
- כדי להכין את nanomicelles polyplex, ומערבב היטב פתרון pDNA (150 / מיליליטר מיקרוגרם ב 10 חיץ HEPES מ"מ) ופתרון המעורבב מראש של שני הפולימרים ביחס של 2: 1 (לפי נפח).
4. ג'ין Transfection לSpheroids
- דגירה התאים (hepatocytesאו MSCs) במשך 72 שעות לאחר זריעה על צלחות micropatterned כדי לאפשר ההיווצרות של spheroids הבוגר. עבור transfection גן, להוסיף את פתרון nanomicelle polyplex 100 μl (המכיל 10 מיקרוגרם של pDNA) זה טוב לאחר החלפת מדיום התרבות עם 1 מיליליטר של מדיום טרי. המשך דגירה עם פתרון nanomicelle למשך 24 שעות.
- לשליטה באמצעות מגיב transfection שומנים מבוסס, לערבב פתרונות pDNA עם מגיב במגיב / pDNA יחס משקל של 3. כוון את המינון הסופי של pDNA להיות שווה לשניהם מגיב שומנים מבוססי ושיטות nanomicelle.
שחזור 5. והשתלות של Spheroids הסלולרי
- החלף את מדיום התרבות עם 200 μl של PBS הקר ומניח את הצלחות על קרח.
הערה: באופן כללי, spheroids יכול לנתק בכ -15 דק 'וניתן לשחזר בצורה של השעיה להשתלה. - לשאוב בעדינות את התאים בμl 200השעיה באמצעות מזרק עם G 23 או מחט 27 G זריקות in vivo.
6. הערכה של ביטוי transgene
- להערכה במבחנה של הביטוי של בלוציפראז Gaussia מופרש במדיום התרבות, לאסוף 50-100 μl של המדיום בדיוק 24 שעות אחרי החלפה עם מדיום חדש. להעריך את הביטוי בלוציפראז באמצעות מערכת מסחרית לוציפראז renilla assay וluminometer פי הפרוטוקול של היצרן.
הערה: לוציפראז Gaussia נותר יציב במדיום התרבות ליותר משבוע. לכן, כדי להעריך את היעילות של ביטוי transgene בזמן אמת, להחליף בינוני עם טרי אחד לפני האיסוף בינוני המדגם. העיתוי של השינוי הבינוני יכול להיות גמיש. - להערכה in vivo של ביטוי transgene בבעלי חיים מארח לאחר השתלת תאים, להרדים BALB / עכברים בעירום ג (נקבה; 7 שבועותישן) תחת הרדמה משאיפת עם isoflurane.
- מניחים את העכבר בתא מחובר למכונת הרדמה כדי לספק isoflurane לתא. קח את העכבר לאחר שנרדם, והניח אותו על שולחן הניתוחים עם אוורור באמצעות מסכה. לשלוט על זרימת isoflurane כ ב0.2-0.5 L / min על ידי בדיקת התנאים של העכבר.
- להזריק 200 μl של ההשעיה התא המכילה spheroids transfected עם pDNA להביע לוציפראז GL4 (כפי שמתואר ב4.1) לרקמה התת עורית באזור הבטן.
- מייד לאחר הזרקת D-luciferin (150 מ"ג / קילוגרם; מסלול תוך ורידי), למדוד את הביטוי בלוציפראז באמצעות מערכת ההדמיה IVIS פי הפרוטוקול של היצרן.
- להערכת ההשפעות הטיפוליות של השתלת התאים, להזריק 200 μl של ההשעיה התא המכילה spheroids transfected עם pDNA קידוד-אריתרופויאטין לרקמה התת עורית באזור הבטן.
- לאסוף דגימות דם על ידי דימום submandibular להשיג כ -200 μl דם 19. מדוד את ההמוגלובין והמטוקריט באמצעות נתח דגימת דם.
הערה: מספר התאים להשתלה מוסדר על ידי המספר נזרע על הצלחות. למרבה הצער, קשה לקבוע את מספר התא המדויק, כי המספר בתוך spheroids לא ניתן למדוד.
- לאסוף דגימות דם על ידי דימום submandibular להשיג כ -200 μl דם 19. מדוד את ההמוגלובין והמטוקריט באמצעות נתח דגימת דם.
- לאחר ניסויים, למקם את העכברים על כרית חימום מחוברת עם בקר טמפרטורה עד התעוררות מהרדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
transfection הגן של pDNA להביע לוציפראז Gaussia בוצע בspheroids הוקם על ידי hepatocytes או MSCs באמצעות nanomicelles polyplex או מגיב transfection שומנים מבוססי שליטה 12. Nanomicelles מושרה כמעט ללא שינוי במבנה אליפטית לעומת spheroids-transfected לא על צלחות micropatterned, ואילו מגיב השליטה שיבש באופן משמעותי את המבנה יום לאחר transfection (איור 3). לאחר transfection באמצעות nanomicelles, הפרשת אלבומין עקבית וtransgene (לוציפראז Gaussia) הביטוי נשמרו היטב במשך כמעט חודש. עם זאת, כאשר מגיב השליטה שימש, אין הפרשת אלבומין נצפתה, אם כי מידת ביטוי transgene הייתה דומה לזה שהתקבל מnanomicelles (איור 4) 12.
במהלך התאוששות אליפטית באמצעות צלחות micropatterned thermosensitive, של 3Dtructure של spheroids השתמר היטב לשני hepatocytes העיקרי וMSCs בהשעיה לאחר התאוששות מהצלחות מקוררות (איור 5). המבנה נשמר גם כן לאחר שעבר את spheroids באמצעות מחטי הזרקה עם קליבר גדול מספיק, כמו 23 (400 מיקרומטר) ו -27 G (220 מיקרומטר) מחטים.
לאחר זריקות תת עורית של spheroids hepatocyte התאושש, ביטוי לוציפראז זוהה בבעלי החיים ליותר מכמה שבועות (איור 6) 20. ביטוי אלבומין מhepatocytes המושתל נצפה ברקמת המארח 20, טוען כי תפקוד התא נשמר בתהליך של התאוששות והשתלה אליפטית. כדי לבחון את הפוטנציאל שלהם ליישומים טיפוליים, spheroids hepatocyte היו גם transfected עם pDNA אריתרופויאטין הקידוד. לאחר השתלה תת עורית של spheroids להביע erythropoietin, השפעת hematopoietic משמעותית הושגה בבעלי החיים לחודש אחד (איור 7) 20.
איור 3. תמונות מיקרוסקופיות של spheroids hepatocyte (A, B) וspheroids MSC (C, D) על צלחת micropatterned יום לאחר transfection הגן, באמצעות nanomicelles polyplex (A, C) או מגיב שומנים מבוססי (B, D). בר סולם:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. (א) ביטוי transgene של לוציפראז Gaussia לאחר transfecting spheroids hepatocyte. (ב) הפרשת אלבומין מspheroids hepatocyte או hepatocytes בתרבות monolayer לאחר transfection. Spheroids היה transfected באמצעות nanomicelle (●) או לשלוט מגיב transfection שומנים מבוסס (○), או pDNA עירום (▲). הפרשת אלבומין משליטת hepatocytes (untransfected) (בspheroids (△) או תרבות monolayer (×)) מוצגת גם. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM; n = 4 לתרבות monolayer וn = 6 לspheroids. (הודפס מחדש באישור מההתייחסות 12). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. תמונות מיקרוסקופיות של spheroids hepatocyte בהשעיה לאחר שעבר אותם באמצעות (א) 23. או (ב) 27 מחטי הזרקה G בר סולם:. 100 מיקרומטר.
איור 6. ביטוי לוציפראז בעכברי מארח לאחר השתלת hepatocyte. לאחר 24 שעות לאחר transfection עם לוציפראז (GL4) -encoding pDNA, spheroids hepatocyte וההשעיה תא בודד מתרבויות monolayer הושתלו הרקמה התת עורית באזור הבטן. ביטוי לוציפראז בעכברי המארח הוערך באמצעות מערכת IVIS הדמיה (הודפס מחדש באישור מההתייחסות 20). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
igure 7 "src =" / קבצים / ftp_upload / 52,384 / 52384fig7.jpg "/>
איור hematopoiesis 7. לאחר ההשתלה של hepatocytes להביע אריתרופויאטין. Hepatocytes בתרבויות אליפטית וmonolayer היה transfected עם pDNA אריתרופויאטין הקידוד. לאחר 24 שעות של transfection, spheroids ותא בודד השעיות מתרבויות monolayer הושתלו מתחת לעור לתוך בטן העכבר. בגיל 22 ו -28 ימים לאחר השתלה, רמות המוגלובין המטוקריט () ו- (ב) נמדדו מדגימות הדם. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM; n = 12 לאליפטית וקבוצות monolayer וn = 6 לבקרה שלא טופלה. משמעות סטטיסטי נקבעה על ידי מבחן t של סטודנט 2-זנב (הודפס מחדש באישור מההתייחסות 20). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זהדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לשמור על מבנה 3D של spheroids במהלך השלבים של מבוא גן והתאוששות אליפטית. זה חיוני כדי לשמור על מייקרו-סביבות נוחים לתאים, כדי למנוע מוות של תאים או הפסד של פעילות תא. לדוגמא, הפרשת אלבומין, פונקציה מולדת נציג hepatocytes, נשמרה היטב בspheroids hepatocyte, בעוד hepatocytes בתרבות monolayer הקונבנציונלי במהירות לאבד את יכולת ההפרשה שלהם כמה ימים לאחר זריעת 12. לתאי גזע, spheroids לשפר באופן משמעותי את יעילותם של בידול לתאי שומן או osteoblasts, עם רמות ביטוי מוגברות של גני המעורבים בadipogenesis וOsteogenesis, וכי לשמור את תקנה של גני הפנוטיפ ההתחדשות עצמית MSC 4.
למבוא גן, ריאגנטים transfection שונים שנבדקו בעבר, כוללים אלה המבוססים על שומנים (איור 3, 4) ואלה המבוססים על פולימר, כגון polyethylenimine. למרבה הצער, אף אחד מהמגיבים סיפק מבוא גן מוצלח מבלי לשבש את מבנה אליפטית. במיוחד, חומרים כימיים המבוסס על השומנים נוטים לגרום לשיבוש של spheroids מלא, אם כי ביטוי transgene הוא יעיל, אפילו בתאים שנותרו בצלחות micropatterned. סביר להניח שהחומרים כימיים המבוסס על השומנים לגרום יציבות קרום משמעותית, שמוביל לביטוי transgene גבוה, אבל לשבש את spheroids על ידי מתן אינטראקציות תא אל התא לא יציב.
לעומת זאת, פולימר קטיוני שיבש את spheroids מהשומנים במידה פחותה, במיוחד בתנאים של יחסים / P הנמוכים N, כדי ליצור את polyplexes. הפרוטוקול הסטנדרטי המוצג כאן משתמש nanomicelles polyplex שיש מיגון PEG. לחלופין, polyplexes עם homopolymers קטיוני, כגון polyethylenimine, יכול לשמש גם למבוא לגן spheroids. ואכן, cationipolyplexes ג ללא משטח PEG מספק בדרך כלל ביטוי transgene גבוה במבחנת transfections, ואפשרויות אטרקטיביות בהתאם לסוג התא ומטרה של השתלת אליפטית.
מאפיין של פרוטוקול זה הוא השימוש בצלחות תרבות micropatterned מצופות פולימר thermosensitive. מערכי micropatterned יכולים לייצר מספר רב של spheroids תא בקוטר אחיד. פרוטוקול זה משתמש 100 מיקרומטר מערכי קוטר, אבל היבט זה הוא גמיש; עם זאת, בקטרים גדולים מאוד, כגון 500 מיקרומטר, לעתים קרובות לגרום לנימק תא בליבה של spheroids (נתונים שלא פורסמו). פשוט על ידי קירור הצלחות על קרח, ניתן להשיג spheroids בצורה של השעיה להזרקה על ידי שאיפה עדינה עם מזרק. הגבלת פוטנציאל של טכניקה זו היא בגודל של המחט המשמשת להזרקת spheroids. הוא אישר כי מחט 27-G ניתן להשתמש בבטחה לspheroids עם קוטר 100 מיקרומטרנצח,. עם זאת, לא ניתן להחיל מחטים צרות לspheroids אלה. מאז מחט 27-G היא גדולה מדי, במיוחד להשתלת spheroids לחוט שדרת עכבר, חלופה אפשרית היא להשתמש בפיגומים לשמר תאים בתוכם.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם פוטנציאל לכמה מטרות של השתלת תאים. בהשוואה למערכת תרבות אליפטית השעיה, יש צלחות micropatterned יתרון שניתן להשיג בקלות מספר מספיק של spheroids עם קוטר אחיד. למרות שהשיטה של מבוא גן יכולה להיות גמישה, כאמור, nanomicelles polyplex עם מיגון PEG יעיל במיוחד למניעת ההפרעה אליפטית. יש לקוות, מערכת זו תשפר את ההשפעות הטיפוליות של תאים מושתלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מעריכים מאוד את ד"ר טאקשי Ikeya וצוות טכני בToyo Gosei, טוקיו, יפן למתן צלחות תרבות micropatterned thermosensitive כמו גם ייעוץ מדעי. כמו כן, אנו מודים לגב 'Satomi Ogura, הגב' Sae סוזוקי, הגב 'אסוקה Miyoshi והגב' Katsue Morii לקבלת סיוע טכני בניסויים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה כלכלית בחלקו על ידי JSPs KAKENHI גרנט ב- Aid למחקר מדעי, המרכז של חדשנות תכנית (COI) ותכנית חדשנות S- מהמדע והטכנולוגיה סוכנות יפן (JST), וCore- JSPs ל- Core תכנית, א רשתות מחקר מתקדם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
