Abstract
Para melhorar a eficiência terapêutica do transplante de células, um sistema de transplante de geneticamente modificados, esferóides injectáveis foi desenvolvido. Os esferóides de células são preparadas num sistema de cultura em placas de micropatterned revestidos com um polímero termossensível. Uma série de esferóides são formados nas placas, correspondentes às áreas de adesão celular de 100 um de diâmetro que são regularmente dispostas de uma forma bi-dimensional, rodeado por zonas não adesivas que são revestidos por um polietileno-glicol (PEG) de matriz. Os esferóides podem ser facilmente recuperado sob a forma de uma suspensão líquida, baixando a temperatura das placas, e a sua estrutura é bem conservado, passando-os através de agulhas de injecção com um calibre suficientemente grande (mais de 27 L). A modificação genética é alcançado através de transfecção de genes utilizando o suporte original não virai de genes, nanomicelle Polyplex, que é capaz de introduzir genes em células, sem perturbar a estrutura esferóide. Para primesferóides de hepatócitos ary transfectadas com um gene que expressa luciferase, a luciferase é sustentada obtido em animais transplantados, juntamente com a função de hepatócitos preservada, tal como indicado pela expressão de albumina. Este sistema pode ser aplicado a uma variedade de tipos de células, incluindo células estaminais mesenquimais.
Introduction
Terapia de transplante de células atraiu atenção generalizada para o tratamento de várias doenças incuráveis. A actividade e semi-vida de factores bioactivos, que são secretadas pelas células transplantadas são essenciais para a melhoria da eficácia terapêutica de um sistema de transplante de células. A modificação genética das células antes de transplante é uma técnica benéfica para regular e manipular as funções celulares, incluindo a secreção dos factores bioactivos. É também importante para manter um microambiente favorável para as células para evitar a morte ou perda de actividade de célula a célula. Cultura tridimensional (3D) esferóide célula, em que as interacções célula-para-célula são bem preservada, é promissor para este fim, por exemplo, para melhorar a secreção de albumina a partir de hepatócitos primários e promover a diferenciação de várias linhagens de células estaminais mesenquimais (MSCs ) 1-7.
Neste estudo, um novo sistema de combinação de spheroid cultura e transfecção do gene é usado para servir como uma plataforma para o transplante de células modificadas geneticamente. Para a criação de células de esferóides, um sistema de cultura em placas de cultura esferóide micropatterned é usado. Nessas placas, áreas de adesão celular de 100 um de diâmetro são regularmente dispostas de forma bidimensional e estão rodeados por áreas não adesivas revestidas por uma matriz de PEG 3. Semeando um número adequado de células, esferóides de matrizes 3D de 100 um de diâmetro são formadas correspondente ao leito de cultura micropadronadas.
Os esferóides são recuperados sem perturbar a sua estrutura 3D, utilizando placas de cultura celular termossensíveis, que foram revestidos com um polímero termossensível, poli (iso-propilacrilamida) (PIPAAm) 8-10. A arquitetura micropadronadas é construído sobre as placas termossensíveis (custom-built). Por simplesmente baixando a temperatura das placas, os esferóides são separadas do leito de cultura e dispersard em tampão fosfato salino (PBS). Assim, um grande número de esferóides com um tamanho uniforme de 100 mm pode ser obtido sob a forma de uma suspensão injectável.
Figura 1. Representação esquemática do sistema de cultura de esferóide sobre uma placa micropadronadas. A modificação genética é alcançado através de transfecção de genes utilizando o transportador do gene não virai original, nanomicelle Polyplex. É composto de plasmídeo de ADN (pADN) e polietileno glicol (PEG), copolímeros de bloco -polycation 11. Estes têm uma estrutura de núcleo-shell característica que consiste em um shell de PEG e um núcleo interno de pADN condensado, permitindo introdução gene segura e eficaz em células para fins terapêuticos 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do this figura.
Figura 2. Estrutura do nanomicelle Polyplex formado pelo complexo de ácidos nucleicos e copolímeros de bloco de PEG-bloco-policatião. Neste estudo, a principal vantagem desta técnica é que a estrutura de esferóides não é interrompido durante a transfecção de genes pelos nanomicelles. Após as transfecções mediada por nanomicelle de esferóides de hepatócitos de rato primária, a expressão do transgene prolongada é obtida por mais de um mês, com a secreção de albumina a partir dos hepatócitos contínua a um nível comparável ao de esferóides não transfectadas 12. A expressão do transgene e a secreção de albumina a partir dos esferóides também são mantidas após recuperação a partir das placas termossensíveis. É evidente que nanomicelles pode facilitar a introdução do gene de forma segura, sem prejudicar as funções inatas do hepatocytes. Assim, a combinação de células cultivadas em placas de esferóides micropatterned termossensíveis com introdução de genes utilizando nanomicelles é uma plataforma promissora para o transplante de células geneticamente modificadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os estudos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Tokyo, Tokyo, Japão.
1. Preparação celular
- Para hepatócitos primários, seguir o protocolo para o isolamento de hepatócitos de rato por uma de duas etapas processo de digestão de colagenase modificado 13,14.
- Anestesiar Sprague Dawley (SD) ratos (machos, 5 semanas de idade), sob anestesia inalatória com isoflurano. Colocar um rato numa câmara ligada a uma máquina de anestesia com isoflurano para proporcionar a câmara. Retire o rato depois de adormecer, e configurá-lo na mesa de operação com ventilação usando uma máscara. Controlar o fluxo de isoflurano a cerca de 0,4-0,7 L / min, verificando as condições do rato. Perfundir os fígados de ratos Sprague Dawley (SD) ratos (machos, 5 semanas de idade) a partir da veia da porta hepática, com uma solução especial composto de cloreto de sódio 8 g / L (NaCl), 400 mg / L de cloreto de potássio (KCl), 78 mg /EUdi-hidrato de di-hidrogenofosfato de sódio (NaH 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 mg / L de fosfato dissódico dodeca-hidrogénio (Na 2 HPO 4 · 12H 2 O), 2,38 g / L de 2- [4- (2-hidroxietil) -1 piperazinil] etanossulfónico (HEPES), 190 mg / L de etileno glicol de ácido tetraacético (EGTA), 350 mg / L de carbonato de hidrogénio de sódio (NaHCO3), e 900 mg / L de glucose.
- Circular solução de colagenase através do fígado.
NOTA: A solução é composta de 500 mg / L de colagenase, 9,8 g / salina tamponada de L Hank, 2,38 g / ml de HEPES, 556 mg / hidrato de cloreto de cálcio ml (CaCl 2 H 2 O), 350 mg / L NaHCO3, e 50 mg / L de inibidor de tripsina de, com o pH ajustado para 7,2. - Remover cuidadosamente o fígado, e mediu-o suavemente em um prato usando uma lâmina de bisturi, adicionar Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), e filtra-se a suspensão de células através de um 100 pmmalha de nylon. Para remover os detritos adicional, centrifugar a suspensão de células a 20 xg durante 1 min. Neste passo, os hepatócitos são no sobrenadante.
- Repetir o passo de centrifugação, duas vezes (de um total de três centrifugações). Finalmente, centrifugar os hepatócitos a 50 x g durante 3 minutos para recuperá-los sob a forma de um pelete.
- Re-suspender os hepatócitos a uma concentração de 4 x 10 5 culas / ml num meio de cultura especial, composto por DMEM suplementado com 10% FBS, 1% de Pen-Strep-Glut (QSP), 1% de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,1 nmol / L dexametasona, 0,5 ug / ml de insulina, 10 mmol / L de nicotinamida, 0,2 mmol / L fosforilada ascorbato (Asc-2P), e 10 ng / ml de factor de crescimento epidérmico humano (hEGF) 15. Este meio especial é obrigatório para a preservação da função hepática em condições in vitro.
- Para a obtenção de MSCs de rato, eutanásia Sprague Dawley (SD) ratos (machos, 5 semanas de idade) por administração excessiva de isoflurane. Ressecar os fémures e as tíbias, e recolher as medulas ósseas através da inserção de uma agulha G 22, no eixo do osso para a nivelar-se com 10 ml de DMEM suplementado com FBS a 10%. Recolher as células por filtração através de uma malha de nylon de 100 um.
- Semente as células sobre 10 cm pratos de cultura utilizando DMEM contendo 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina. Para as experiências de esferóides, utilizar as MSCs a 5 passagens.
2. Preparação de esferóides de células 3D
- Comercialmente obter placas de cultura de micropatterned, em que as zonas adesivas células são regularmente dispostas a 100 um de diâmetro, de forma bidimensional, rodeado por zonas não adesivas revestidas pela matriz de PEG.
NOTA: Para o transplante de células, um revestimento adicional com o polímero termossensível PIPAAm é necessário para permitir a separação celular por as placas de arrefecimento (ver passo 5.1). As flutuações de temperatura pode induzir alterações na química deste polímero8-10. A 37 ° C, PIPAAm é ligeiramente hidrofóbica, permitindo que as células a ser cultivadas sob condições normais. Uma diminuição na temperatura abaixo de 32 ° C resulta em rápida hidratação do polímero, levando ao desprendimento espontâneo das células. - Semente os hepatócitos ou MSC em placas de 12 poços micropatterned a uma densidade de 4 x 10 5 células / poço andincubate-los a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO 2. As células irá acumular-se nas áreas de adesão micropatterned e gradualmente formar esferóides redondas em 2 dias.
NOTA: Para a preparação de células de controlo numa cultura em monocamada, utilizar placas de 12 poços normais e semear as células a uma densidade idêntica, seguindo um procedimento semelhante ao descrito acima.
3. Preparação de Polyplex Nanomicelles
- Sintetizar um copolímero de bloco de PEG-PSAP (DET) (poli [N '- [N - (2-aminoetil) -2-aminoetil] aspartamida]) (PEG Mw = 12,000, grau de polimerização (DP) do segmento PSAP (DET) = 59), e um homopolímero que é composta de apenas o segmento catiónico [PSAP (DET)] (DP = 55), seguindo os procedimentos anteriormente descritos pelos autores 11, 16, 17.
- Prepara-se uma solução mista do (DET) copolímero em bloco PEG-PSAP e o PSAP (DET) homopolímero em uma proporção molar igual de grupos amino residuais, em HEPES 10 mM (pH 7.3) por ajuste da concentração de polímero de 33,3 ^ g / ml e 19,1 ug / ml, respectivamente.
NOTA: As concentrações de polímero descritos acima são os valores representativos para a preparação de nanomicelles com uma razão molar residual do total de grupos amino nos dois polímeros para os grupos fosfato no (relação N / P) de ADNp de 10. A relação N / P pode variar dependendo do tipo de célula e da finalidade (para mais detalhes, ver discussão). A utilização combinada dos dois polímeros pode atingir tanto PEG blindagem eficaz e funcionamento do PSAP (DET) para melhorar endossomalescapar (para detalhes, ver Discussão) 18. - Prepara-se o ADNp que codifica a luciferase Gaussia, GL4 de luciferase, ou eritropoietina por clonagem do segmento de expressar os respectivos genes no plasmídeo pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) para se obter a expressão sob o CAG promotor / potenciador usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Amplificar o pDNA em uma cepa Escherichia coli competente e purificá-la usando um plasmídeo sistema de purificação de ADN livre de endotoxina. Determinar a concentração de ADNp a uma absorvância de 260 nm para se obter uma solução / ml 150 ug em tampão HEPES 10 mM (pH 7,3).
- Para preparar as nanomicelles poliplex, homogeneiza-se a solução de ADNp (150 ug / ml em tampão HEPES 10 mM) e a solução pré-misturada dos dois polímeros numa proporção de 2: 1 (em volume).
4. Gene transfecção em esferóides
- Incubar as células (hepatócitosou MSC) durante 72 horas após a sementeira em placas micropatterned para permitir a formação de esferóides maduros. Para a transfecção de genes, adicionar 100 uL da solução Polyplex nanomicelle (contendo 10 ug de ADNp) a cada poço após a substituição do meio de cultura com 1 ml de meio fresco. Continuar a incubação com a solução nanomicelle durante 24 horas.
- Para um controlo usando um reagente de transfecção à base de lípidos, misturar soluções pADN com o reagente em uma proporção em peso de reagente / pDNA de 3. Ajustar a dose final de pADN para ser igual, tanto para o reagente à base de lípidos e métodos nanomicelle.
5. Recuperação e Transplante de esferóides celulares
- Substituir o meio de cultura com 200 ul de PBS arrefecido e colocar as placas em gelo.
NOTA: De um modo geral, os esferóides podem separar em cerca de 15 min e pode ser recuperada na forma de uma suspensão para o transplante. - Suavemente aspirar as células em 200 ul dosuspensão utilizando uma seringa com uma 23 G ou 27 G agulha para injeções in vivo.
6. Avaliação da Transgene Expression
- Para a avaliação in vitro da expressão de luciferase Gaussia segregada no meio de cultura, recolher 50 - 100 ul do meio de precisamente 24 horas após a substituição com meio fresco. Estimar a expressão da luciferase utilizando um sistema de ensaio de luciferase de Renilla comercial e um luminómetro de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: A luciferase Gaussia permanece estável no meio de cultura durante mais de uma semana. Assim, para avaliar a eficiência em tempo real da expressão do transgene, substituir o meio com um meio fresco antes da recolha do meio da amostra. O momento da mudança de meio pode ser flexível. - Para a avaliação in vivo de expressão do transgene em animais hospedeiros, após o transplante de células, anestesiar ratos BALB / c nu (fêmea; 7 semanasidade), sob anestesia inalatória com isoflurano.
- Colocar um rato numa câmara ligada a uma máquina de anestesia com isoflurano para proporcionar a câmara. Retire o mouse depois de adormecer, e configurá-lo na mesa de operação com ventilação usando uma máscara. Controlar o fluxo de isoflurano a cerca de 0,2-0,5 L / min, verificando as condições do mouse.
- Injectar 200 ul da suspensão de células contendo esferóides transfectadas com os ADNp que expressam luciferase GL4 (como descrito em 4.1) para dentro do tecido subcutâneo da região abdominal.
- Imediatamente após a injecção de D-luciferina (150 mg / kg; via intravenosa), medir a expressão de luciferase utilizando o sistema de imagiologia IVIS de acordo com o protocolo do fabricante.
- Para avaliar os efeitos terapêuticos do transplante de células, injectar 200 ul da suspensão de células contendo esferóides transfectadas com os ADNp que codifica para a eritropoietinatecido subcutâneo da região abdominal.
- Coletar amostras de sangue por sangramento submandibular obter cerca de 200 l de sangue 19. Medir a hemoglobina e hematócrito usando um analisador de amostra de sangue.
NOTA: O número de células para transplante é regulada pelo número semeadas nas placas. Infelizmente, é difícil determinar o número de células exactos, porque o número dentro de esferóides não pode ser medido.
- Coletar amostras de sangue por sangramento submandibular obter cerca de 200 l de sangue 19. Medir a hemoglobina e hematócrito usando um analisador de amostra de sangue.
- Depois de experiências, os ratinhos colocar sobre uma almofada de aquecimento ligada a um controlador de temperatura até que o despertar da anestesia.
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Representative Results
Gene transfecção do Gaussia que expressam a luciferase de ADNp foi realizada nos esferóides formadas pelos hepatócitos ou MSC, utilizando nanomicelles poliplex ou o reagente de transfecção baseada em lípidos de controlo 12. Os nanomicelles induzida quase nenhuma alteração na estrutura esferóide comparação com esferóides não transfectadas nas placas micropatterned, ao passo que o reagente de controlo perturbado significativamente a estrutura de um dia após a transfecção (Figura 3). Após transfecção utilizando os nanomicelles, secreção de albumina consistente e o transgene (Gaussia luciferase) expressão foram bem cuidados por quase um mês. No entanto, quando o reagente de controlo foi utilizado, foi observada nenhuma secreção de albumina, embora o grau de expressão do transgene foi semelhante ao obtido a partir dos nanomicelles (Figura 4) 12.
Durante a recuperação esferóide usando as placas micropatterned termossensíveis, o 3D sstrutura dos esferóides foi bem preservada para ambos os hepatócitos primários e as MSCs em suspensão após recuperação a partir das placas arrefecida (Figura 5). A estrutura também foi bem cuidados, depois de passar os esferóides através de agulhas de injecção com um suficientemente grande calibre, como o 23 (400 mm) e 27 G (220 mm) agulhas.
Após as injecções subcutâneas de esferóides de hepatócitos recuperados, a expressão da luciferase foi detectada nos animais durante mais de algumas semanas (Figura 6) 20. Expressão Albumina de hepatócitos transplantados foi observada no tecido do hospedeiro 20, sugerindo que a função das células foi preservada através do processo de recuperação esferóide e transplante. Para testar o seu potencial de aplicações terapêuticas, os esferóides de hepatócitos foram também transfectadas com a eritropoietina de codificação de ADNp. Após o transplante subcutâneo dos esferóides que expressam erythropoietin, um efeito hematopoiético significativo foi obtido nos animais durante um mês (Figura 7) 20.
Figura 3. As imagens microscópicas de esferóides de hepatócitos (A, B) e esferóides MSC (C, D) sobre uma placa micropadronadas um dia após a transfecção do gene, usando nanomicelles poliplex (A, C) ou um reagente à base de lípidos (B, D). Barra de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. (A) A expressão de transgenes de Gaussia luciferase após transfecção os esferóides de hepatócitos. (B) albumina de secreçãoos esferóides de hepatócitos ou hepatócitos em uma cultura monocamada após a transfecção. Os esferóides foram transfectadas utilizando nanomicelle (●) ou controlar o reagente de transfecção à base de lípidos (○), ou de ADNp nu (▲). A secreção de albumina a partir do controle (untransfected) hepatócitos (em esferóides (△) ou cultura em monocamada (×)) também é mostrada. Os resultados são representados como a média ± SEM; n = 4 para cultura em monocamada e n = 6 para esferóides. (Reproduzido com permissão da referência 12). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. As imagens microscópicas dos esferóides de hepatócitos em suspensão, depois de passar através deles (A) ou (23- B) 27 g de agulhas de injecção Barra de escala:. 100 um.
Figura 6. expressão da luciferase em ratinhos de acolhimento após o transplante de hepatócitos. Depois de 24 horas após a transfecção com luciferase (GL4) -Encoding pADN, os esferóides de hepatócitos e suspensão de uma única célula a partir das culturas em monocamada foram transplantados no tecido subcutâneo da região abdominal. A expressão luciferase nos ratos hospedeiros foi avaliada utilizando um sistema de imagem IVIS (Reproduzido com permissão da referência 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 7. A hematopoiese após transplante de hepatócitos que expressam eritropoietina. Os hepatócitos nos esferóides e culturas em monocamada foram transfectadas com codificação de eritropoietina-ADNp. Após 24 horas de transfecção, os esferóides e uma única célula suspensões das culturas em monocamada foram transplantados subcutaneamente no abdómen mouse. Aos 22 e 28 dias após o transplante, (A) e hemoglobina (B), os níveis de hematócrito foram medidos a partir das amostras de sangue. Os dados são apresentados como a média ± SEM; n = 12 para esferóide e grupos de monocamada e n = 6 para controlos não tratados. A significância estatística foi determinada por um teste t de Student 2-atado (Reproduzido com permissão da referência 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, é fundamental a manutenção da estrutura 3D de esferóides durante os passos de introdução de gene e recuperação esferóide. É essencial manter uma microambientes favoráveis para as células para evitar a morte ou perda de actividade de célula a célula. Por exemplo, a secreção de albumina, uma função representativa inato de hepatócitos, é bem preservada nos esferóides de hepatócitos, enquanto que os hepatócitos em cultura em monocamada convencionais perdem rapidamente a sua capacidade de secreção de alguns dias após a sementeira 12. Para as MSCs, os esferóides aumentar significativamente a sua eficiência de diferenciação em adipocitos ou osteoblastos, com o aumento dos níveis de genes envolvidos na expressão adipogénese e osteogénese, e sub-regulação de genes que manter o MSC auto-renovação fenótipo 4.
Para a introdução do gene, vários reagentes de transfecção tinha sido previamente testado, incluindo aqueles à base de lípidos (Figura 3, 4) eaqueles à base de polímeros, tais como polietilenoimina. Infelizmente, nenhum dos reagentes fornecida introdução bem sucedida do gene sem perturbar a estrutura esferóide. Especialmente, os reagentes à base de lípidos tendem a induzir a ruptura completa dos esferóides, embora a expressão do transgene é eficiente, mesmo nas células restantes nas placas micropatterned. É provável que os reagentes à base de lípidos de membrana induzir desestabilização significativa, conduzindo a elevada expressão do transgene, mas perturbar os esferóides, tornando as interacções célula-para-célula instável.
Em contraste, o polímero catiónico interrompido os esferóides a uma menor extensão do que os lípidos, especialmente nas condições de rácios C / P N baixos, para formar os poliplexos. O protocolo padrão mostrado aqui usa nanomicelles poliplex que possuem PEG blindagem. Alternativamente, poliplexos com homopolímeros catiónicos, tais como polietilenoimina, pode também ser usado para a introdução de genes para os esferóides. Com efeito, cationic poliplexos sem a superfície de PEG proporcionam geralmente a alta expressão de transgene em transfecções in vitro, e são atractivos opções dependendo do tipo de célula e da finalidade do transplante esferóide.
Uma característica do presente protocolo é a utilização de placas de cultura de micropatterned revestidos com um polímero termossensível. As matrizes micropatterned pode produzir um grande número de células de esferóides com um diâmetro uniforme. Este protocolo utiliza matrizes 100 um de diâmetro, mas este aspecto é flexível; no entanto, diâmetros muito grandes, tais como 500 um, frequentemente causar necrose celular no centro dos esferóides (dados não publicados). Por simplesmente as placas de arrefecimento em gelo, os esferóides podem ser obtidos sob a forma de uma suspensão injectável por aspiração suave com uma seringa. Uma limitação potencial desta técnica é o tamanho da agulha utilizada para injectar os esferóides. Foi confirmado que uma agulha de 27-G pode ser utilizada com segurança para esferóides com 100 um de diâmetroeter. No entanto, agulhas estreitas não pode ser aplicada para esses esferóides. Uma vez que uma agulha de 27-G é muito grande, especialmente para o transplante de esferóides em medulas espinais de rato, uma alternativa possível é a utilização de andaimes para reter células no seu interior.
Este protocolo pode ser potencialmente aplicada para diversos fins de transplante de células. Em comparação com o sistema de cultura de suspensão esferóide, as placas micropatterned tem a vantagem de que um número suficiente de esferóides de diâmetro uniforme pode ser facilmente obtido. Embora o método de introdução do gene pode ser flexível, como mencionado anteriormente, nanomicelles poliplex com PEG blindagem são particularmente eficazes para evitar a ruptura esferóide. Espera-se que este sistema irá melhorar os efeitos terapêuticos das células transplantadas.
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Acknowledgments
Nós apreciamos profundamente Dr. Takeshi Ikeya e pessoal técnico em Toyo Gosei, Tokyo, Japão por fornecer placas de cultura de micropadronadas termossensíveis, bem como os pareceres científicos. Agradecemos também Ms. Satomi Ogura, Ms. Sae Suzuki, Ms. Asuka Miyoshi e Ms. Katsue Morii de assistência técnica com experiências em animais. Este trabalho foi apoiado financeiramente em parte pela JSPS KAKENHI Grant-in-Aid para a Investigação Científica, o Centro de Inovação Programa (COI) eo programa de inovação S- da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão (JST), ea JSPS Core- para-Core Programa, A. avançadas redes de pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
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