Abstract
För att förbättra den terapeutiska effekten av celltransplantation, var en transplantation system av genetiskt modifierade, injicerbara sfäroider utvecklas. Cell sfäroiderna framställes i ett odlingssystem på micropatterned plattor belagda med en termosensitiv polymer. Ett antal sfäroider bildas på plattorna, som motsvarar de cellvidhäftningsområdena 100 | im i diameter som regelbundet grupperade i en tvådimensionell sätt, omgiven av icke-vidhäftande områden som är belagda med en polyetylenglykol (PEG) matris. Sfäroiderna kan lätt utvinnas som en flytande suspension genom sänkning av temperaturen hos plattorna, och deras struktur är väl underhållen genom att passera dem genom injektionsnålar med en tillräckligt stor kaliber (över 27 G). Genetisk modifiering uppnås genom gentransfektion med den ursprungliga icke-viral gen bärare, Polyplex nanomicelle, som har förmåga att introducera gener i celler utan att störa sfäroid strukturen. För primary hepatocyt sfäroider transfekterade med en luciferas-uttryckande genen, luciferas hållbart erhållen i transplanterade djur, tillsammans med konserverade hepatocyt-funktion, såsom anges med albumin uttryck. Detta system kan tillämpas på en mängd olika celltyper inklusive mesenkymala stamceller.
Introduction
Celltransplantation terapi har rönt stor uppmärksamhet för behandling av olika svåra sjukdomar. Aktiviteten och halveringstiden av bioaktiva faktorer som utsöndras av de transplanterade cellerna är avgörande för förbättrad terapeutisk effektivitet av en celltransplantation system. Genetisk modifiering av cellerna före transplantation är en fördelaktig teknik för att reglera och manipulera cellulära funktioner, inklusive utsöndring av bioaktiva faktorer. Det är också viktigt att upprätthålla en gynnsam mikro för cellerna för att undvika celldöd eller förlust av cellaktivitet. Tredimensionell (3D) sfäroid cellkultur, i vilken cell-till-cell interaktioner välbevarade, är lovande för detta ändamål, till exempel för att förbättra albumin utsöndringen från primära hepatocyter och främja flera härstamning differentiering från mesenkymala stamceller (MSC ) 1-7.
I denna studie, en ny kombination system spheroid kultur och gentransfektion används för att fungera som en plattform för genetiskt modifierade celltransplantation. För att skapa sfäroida celler, en sfäroid odlingssystem på micropatterned odlingsplattor används. På dessa plattor, är cellvidhäftningsområdena 100 | im i diameter regelbundet ordnade i ett tvådimensionellt sätt och är omgivna av icke vidhäftande områden belagda med ett PEG-matris 3. Genom att ympa ett lämpligt antal celler, är uppsättningar av 3D-sfäroider av 100 | j, m i diameter som bildas som motsvarar den Micropatterned odlingsbädden.
Sfäroiderna återvinns utan att störa deras 3D-struktur genom användning av värmekänsliga cellkulturplattor, som var belagda med en termosensitiv polymer, poly (iso-propylakrylamid) (PIPAAm) 8-10. Den micropatterned arkitekturen är uppbyggd på värmekänsliga plattorna (specialbyggd). Genom att helt enkelt sänka temperaturen hos plattorna, är sfäroiderna lossnat från odlings bädden och dispergerad i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Således kan ett stort antal av sfäroider med en enhetlig storlek av 100 ^ m erhållas i form av en injicerbar suspension.
Figur 1. Schematisk representation av sfäroid odlingssystemet på en Micropatterned platta. Genetisk modifiering uppnås genom gentransfektion med den ursprungliga icke-viral gen bärare, Polyplex nanomicelle. Den består av plasmid-DNA (pDNA) och polyetylenglykol (PEG) -polycation segmentsampolymerer 11. Dessa har en karakteristisk kärna-skalstruktur bestående av en PEG skal och en inre kärna av kondenserad pDNA, möjliggör en säker och effektiv genintroduktion i celler för terapeutiska ändamål 11. Klicka här för att se en större version av this siffra.
Figur 2. Uppbyggnad av Polyplex nanomicelle bildas av komplex av nukleinsyror och PEG-blocket-polykatjon segmentsampolymerer. I denna studie är den primära fördelen med denna teknik att den sfäroid strukturen inte störs under gentransfektion av nanomicelles. Efter nanomicelle-medierad transfektioner av rått primära hepatocyt sfäroider, förlängs transgenuttryck erhållas för mer än en månad med kontinuerlig albumin utsöndringen från hepatocyterna på en nivå som är jämförbar med den hos otransfekterade sfäroider 12. Den transgenexpression och albuminutsöndring från sfäroiderna också bibehållas efter återhämtning från värmekänsliga plattorna. Det är uppenbart att nanomicelles säkert kan underlätta genintroduktion utan att försämra de inneboende funktionerna hos hepatocytes. Således, en kombination av sfäroida celler odlade på värmekänsliga micropatterned plattor med genintroduktion använder nanomicelles är en lovande plattform för genetiskt modifierade cellstransplantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtliga djurstudier utfördes med godkännande av Animal Care och användning kommittén vid universitetet i Tokyo, Tokyo, Japan.
1. Cellberedning
- För primära hepatocyter, följer protokollet för hepatocyte isolering från råtta med ett modifierat tvåstegs kollagenas rötningsprocessen 13,14.
- Söva Sprague Dawley (SD) råttor (hankön, 5 veckor gamla) i inhalationsanestesi med isofluran. Placera en råtta i en kammare ansluten till en anestesiapparaten för att ge isofluran för kammaren. Ta ut råtta efter att somna, och ställ den på operationsbordet med ventilation med hjälp av en mask. Styr isofluran flöda ungefär 0,4-0,7 l / min genom att kontrollera villkoren för råttan. Perfundera levrarna av Sprague Dawley (SD) råttor (hanar, 5 veckor gamla) från den hepatiska portvenen med en speciell lösning bestående av 8 g / l natriumklorid (NaCl), 400 mg / l kaliumklorid (KCl), 78 mg / Lnatriumdivätefosfatdihydrat (NaH 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 mg / L dinatriumvätefosfat dodekahydrat (Na 2 HPO 4 · 12H 2 O), 2,38 g / L 2- [4- (2-hydroxietyl) -1 piperazinyl] etansulfonsyra (HEPES), 190 mg / l etylenglykol tetraättiksyra (EGTA), 350 mg / I natriumvätekarbonat (NaHCOs 3), och 900 mg / I glukos.
- Cirkulera kollagenaslösning genom levern.
Anmärkning Lösningen består av 500 mg / I kollagenas, 9,8 g / I Hanks buffrade salt, 2,38 g / ml HEPES, 556 mg / ml kalciumklorid-hydrat (CaCl2 • H2O), 350 mg / I NaHCOs 3, och 50 mg / l trypsininhibitor, med pH justerat till 7,2. - Avlägsna levern varsamt, och finhacka den försiktigt på en skål med användning av ett skalpellblad, lägga Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), och filtrera cellsuspensionen genom en 100 | imnylonnät. För att ta bort ytterligare skräp, centrifugera cellsuspensionen vid 20 x g under 1 minut. I detta steg, hepatocyter är i supernatanten.
- Upprepa centrifugeringen steg två gånger (totalt tre centrifuge). Slutligen, centrifugera hepatocyterna vid 50 x g under 3 min för att återvinna dem i form av en pellet.
- Återuppslamma hepatocyterna till en koncentration av 4 x 10 5 celler / ml i en särskild odlingsmedium sammansatt av DMEM kompletterat med 10% FBS, 1% Pen-Strep-Glut (PSQ), 1% dimetylsulfoxid (DMSO), 0,1 | amol / l dexametason, 0,5 ^ g / ml insulin, 10 mmol / L nikotinamid, 0,2 mmol / l fosforylerad askorbat (Asc-2P), och 10 ng / ml human epidermal tillväxtfaktor (hEGF) 15. Denna speciella medium är obligatoriskt för att bevara leverfunktion under in vitro betingelser.
- För att erhålla råtta MSC, euthanize Sprague Dawley (SD) råttor (hankön, 5 veckor gamla) genom en alltför betungande administration av isoflurane. Resekera lårben och skenben, och samla benmärg genom att sätta in en 22 G nål i axeln av benet för att spola ut det med 10 ml av DMEM kompletterat med 10% FBS. Samla cellerna genom filtrering genom ett 100 | im nylonnät.
- Ympa celler på 10 cm odlingsskålar med hjälp av DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin. För sfäroiddiametern experiment använda MSC inom fem passager.
2. Beredning av 3D Cell Sfäroider
- Kommersiellt erhålla micropatterned odlingsplattor, på vilka cell limområdena regelbundet anordnade på 100 ^ m diameter i en tvådimensionell sätt, som omges av icke-vidhäftande områden belagda med PEG-matris.
OBS: För celltransplantation, är nödvändig för att tillåta cell lossnar genom kylning av plattorna en ytterligare beläggning med den termosensitiva polymeren PIPAAm (se steg 5.1). Temperaturväxlingar kan inducera förändringar i kemin för denna polymer8-10. Vid 37 ° C är PIPAAm något hydrofob, så att cellerna som skall odlas under normala förhållanden. En minskning av temperaturen under 32 ° C resulterar i snabb hydratisering av polymeren, vilket leder till spontan lösgöring av cellerna. - Seed hepatocyterna eller MSC: er på 12-brunnars micropatterned plattor vid en densitet av 4 x 10 5 celler / brunn andincubate dem vid 37 ° C i en fuktad atmosfär innehållande 5% CO2. Cellerna kommer att samlas på micropatterned vidhäftningsområdena och så småningom bilda runda sfäroider i 2 dagar.
OBS: För framställning av kontrollceller i en monolagerkultur, använda vanliga 12-brunnsplattor och utsäde cellerna vid en identisk densitet, att följa ett liknande förfarande som beskrivits ovan.
3. Framställning av Polyplex Nanomicelles
- Syntetisera en segmentsampolymer, PEG-pASP (DET) (poly [N '- [N - (2-aminoetyl) -2-aminoetyl] aspartamid]) (PEG Mw = 12,000, polymerisationsgrad (DP) av pASP (DET) segmentet = 59), och en homopolymer som består av enbart katjoniska segmentet [pASP (DET)] (DP = 55), att följa instruktionerna som tidigare beskrivits av författarna 11, 16, 17.
- Bered en blandad lösning av PEG-pASP (DET) blocksampolymer och pASP (DET) homopolymer vid en lika molförhållande av kvarvarande aminogrupper i 10 mM HEPES-buffert (pH 7,3) genom justering av polymerkoncentrationen till 33,3 pg / ml och 19,1 mikrogram / ml.
OBS: De polymerkoncentrationer som beskrivs ovan är representativa värden för framställning nanomicelles med en återstående molförhållande av de totala aminogrupperna i de två polymererna till fosfatgrupperna i pDNA (N / P-förhållande) av 10. N / P-förhållande kan variera beroende på celltyp och syftet (för mer information, se diskussion). Den kombinerade användningen av de två polymererna kan uppnå både effektiv PEG avskärmning och funktion pASP (DET) för att förbättra endosomalfly (för mer information, se diskussion) 18. - Förbered pDNA kodar Gaussia luciferas, GL4 luciferas, eller erytropoietin genom kloning segmentet uttrycker respektive gener in i pCAG-GS plasmid (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) för erhållande av uttrycket under CAG promotor / förstärkare med användning av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll. Förstärka pDNA på ett kompetent Escherichia coli-stam och rena den med en endotoxinfritt plasmid DNA-reningssystem. Bestäm pDNA koncentrationen vid en absorbans av 260 nm för erhållande av en 150 | j, g / ml lösning i 10 mM HEPES-buffert (pH 7,3).
- För att framställa de Polyplex nanomicelles, grundligt blanda pDNA lösning (150 | ig / ml i 10 mM HEPES-buffert) och förblandad lösning av de två polymererna i ett förhållande av 2: 1 (volym).
4. gentransfektion in Sfäroider
- Inkubera cellerna (hepatocyternaeller MSC: er) för 72 timmar efter ympning på de micropatterned plattorna för att medge bildning av mogna sfäroider. För gentransfektion, tillsätt 100 | il av Polyplex nanomicelle lösning (innehållande 10 | j, g av pDNA) till varje brunn efter byte av odlingsmediet med en ml färskt medium. Fortsätt inkubationen med nanomicelle lösning för 24 timmar.
- För en kontroll med användning av en lipid-baserad transfektionsreagens, blanda pDNA lösningar med reagenset vid ett viktförhållande reagens / pDNA av 3. Justera den slutliga dosen av pDNA vara lika för både lipidbaserade reagenset och nanomicelle metoder.
5. Återvinning och transplantation av cell Sfäroider
- Byt odlingsmediet med 200 ^ il kylt PBS och placera plattorna på is.
OBS: I allmänhet kan sfäroiderna lösgöra i omkring 15 min och kan utvinnas i form av en suspension för transplantation. - Aspirera Försiktigt cellerna i 200 | j, lsuspensionen med användning av en spruta med en 23 G eller 27 G nål för in vivo-injektioner.
6. Utvärdering av transgen expression
- För utvärderingen in vitro av expressionen av Gaussia luciferas utsöndras i odlingsmediet, samla 50-100 ul av mediet exakt 24 timmar efter byte med färskt medium. Uppskatta luciferasuttryck användning av en kommersiell Renilla luciferas analyssystem och en luminometer enligt tillverkarens protokoll.
OBS! Gaussia luciferas förblir stabilt i odlingsmedium för mer än en vecka. Således, för att utvärdera den realtids effektivitet transgenexpression, ersätta mediet med färskt en före uppsamling av provmediet. Tidpunkten för byte av medium kan vara flexibla. - För utvärderingen in vivo av transgen expression i värddjur efter celltransplantation, söva BALB / c nakna möss (honor, 7 veckorgamla) under inhalationsanestesi med isofluran.
- Placera en mus i en kammare ansluten till en anestesiapparaten för att ge isofluran för kammaren. Ta ut musen efter att somna, och ställ den på operationsbordet med ventilation med hjälp av en mask. Styr isofluran flöda ungefär 0,2-0,5 l / min genom att kontrollera villkoren för musen.
- Injicera 200 pl av cellsuspensionen innehållande sfäroider transfekterade med GL4 luciferas-uttryck pDNA (enligt beskrivningen i 4.1) i den subkutana vävnaden av den abdominala regionen.
- Omedelbart efter injicering av D-luciferin (150 mg / kg, intravenös väg), mät luciferasuttryck använder IVIS avbildningssystem enligt tillverkarens protokoll.
- För att utvärdera de terapeutiska effekterna av celltransplantation, injicera 200 ul av cellsuspensionen innehållande sfäroider transfekterade med erytropoietin-kodande pDNA in isubkutana vävnaden av den abdominala regionen.
- Samla blodprov genom submandibulära blödning att erhålla cirka 200 pl blod 19. Mät hemoglobin och hematokrit med hjälp av ett blodprov analysator.
OBS: cellantal för transplantation regleras med antalet ympas på plattorna. Tyvärr är det svårt att fastställa det exakta antalet celler eftersom antalet inuti sfäroider inte kan mätas.
- Samla blodprov genom submandibulära blödning att erhålla cirka 200 pl blod 19. Mät hemoglobin och hematokrit med hjälp av ett blodprov analysator.
- Efter experiment, placera möss på en värmedyna i samband med en temperaturregulator tills uppvaknande från narkos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gentransfektion av Gaussia luciferas-uttryck pDNA utfördes i sfäroiderna bildas av hepatocyterna eller MSC: er som använder Polyplex nanomicelles eller styr lipidbaserade transfektionsreagens 12. De nanomicelles inducerade nästan ingen förändring i sfäroid strukturen jämfört med icke-transfekterade sfäroiderna på micropatterned plattorna, medan kontrollreagens störde väsentligt strukturen en dag efter transfektion (fig 3). Efter transfektion med hjälp av nanomicelles, konsekvent albuminutsöndring och transgenen (Gaussia luciferas) uttryck var väl underhållna för nästan en månad. När emellertid kontrollreagens användes ades ingen albuminutsöndring observeras, även om graden av transgen expression var liknande den som erhölls från nanomicelles (Figur 4) 12.
Under sfäroid återhämtning med hjälp av värmekänsliga micropatterned plattor, 3D sTRUKTUR av sfäroiderna var väl bevarad för både de primära hepatocyter och MSCs i suspension efter återvinning från de kylda plattorna (fig 5). Strukturen var också väl underhållna efter passage sfäroiderna genom injektionsnålar med en tillräckligt stor kaliber, såsom 23 (400 ^ m) och 27 G (220 | j, m) nålar.
Efter subkutana injektioner av återvunna hepatocyt sfäroiderna, var luciferasuttryck påvisas i djur för mer än ett par veckor (Figur 6) 20. Albumin expression från transplanterade hepatocyter observerades i värdvävnaden 20, vilket antyder att cellfunktionen bevarades genom processen av sfäroid återhämtning och transplantation. För att testa deras potential för terapeutiska tillämpningar, ades hepatocyt sfäroiderna också transfekteras med erytropoietin-kodning pDNA. Efter subkutan transplantation av sfäroiderna uttrycker erythropoietin ades en signifikant hematopoietisk effekt erhölls i djuren under en månad (Figur 7) 20.
Figur 3. Mikroskopiska bilder Hepatocyte sfäroider (A, B) och MSC sfäroider (C, D) på en micropatterned platta en dag efter gentransfektion, med hjälp av Polyplex nanomicelles (A, C) eller lipid-reagens (B, D). Skala bar:. 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. (A) Transgene uttryck för Gaussia luciferas efter transfektion av levercell sfäroiderna. (B) Albumin sekretion frånde hepatocyt sfäroider eller hepatocyter i en monolagerkultur efter transfektionen. Sfäroider transfekterades med hjälp av nanomicelle (●) eller kontrollera lipidbaserad transfektionsreagens (○), eller naken pDNA (▲). Den albuminutsöndring från kontroll (otransfekterade) hepatocyter (i sfäroider (△) eller monokultur (x)) visas också. Resultaten representeras som medelvärde ± SEM; n = 4 för enskiktskultur och n = 6 för sfäroider. (Återges med tillstånd från 12 referens). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Mikroskopiska bilder av hepatocyt spheroids i suspension efter att ha passerat dem genom (A) 23- eller (B) 27 g injektionsnålar Skala bar:. 100 pm.
Figur 6. luciferasuttryck i värd möss efter hepatocyte transplantation. Efter 24 timmar efter transfektion med luciferas (GL4) kodande pDNA ades hepatocyt sfäroiderna och encelliga fjädring från monoskiktkulturer transplanteras i den subkutana vävnaden i bukhålan. Den luciferasuttryck i värd möss utvärderades med hjälp av en IVIS Imaging System (Återges med tillstånd från referens 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
igure 7 "src =" / filer / ftp_upload / 52.384 / 52384fig7.jpg "/>
Figur 7. Blodbildning efter transplantation av erytropoietin-uttryck hepatocyter. Hepatocyter i sfäroiddiametern och monoskiktkulturer transfekterades med erytropoietin-kodning pDNA. Efter 24 timmar efter transfektion, var sfäroiderna och encelliga suspensioner från monoskiktkulturer transplanterades subkutant i musen buken. Vid 22 och 28 dagar efter transplantation var (A) hemoglobin och (B) hematokritnivåer mätt från blodproven. Data presenteras som medelvärde ± SEM; n = 12 för sfäroid och monolagergrupper och n = 6 för obehandlade kontroller. Statistisk signifikans bestämdes genom en 2-tailed t-test (Återges med tillstånd från referens 20). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll är det viktigt att behålla 3D-strukturen av sfäroider under stegen genintroduktion och sfäroid återhämtning. Det är viktigt att upprätthålla en gynnsam mikromiljöer för cellerna att undvika celldöd eller förlust av cellaktivitet. Till exempel, albumin utsöndring, ett representativt inneboende funktion av leverceller, är väl bevarad i levercell sfäroiderna, medan hepatocyter i den konventionella monokultur förlorar snabbt sin sekretoriska kapacitet några dagar efter sådd 12. För MSC, sfäroiderna avsevärt förbättra effektiviteten av differentiering till adipocyter eller osteoblaster, med ökade uttrycksnivåer av gener involverade i adipogenes och osteogenes och nedreglering av gener som upprätthålla MSC självförnyelse fenotyp 4.
För genintroduktion hade olika transfektionsreagenser testats tidigare, inklusive lipid-baserade sådana (Figur 3, 4) ochpolymerbaserade sådana, såsom polyetylenimin. Tyvärr har ingen av de reagens tillgänglig framgångsrik genintroduktion utan att störa sfäroid strukturen. Speciellt de lipidbaserade reagenser tenderar att inducera fullständig rubbning av sfäroiderna, fastän transgenexpression är effektiv, även i de återstående cellerna på de micropatterned plattorna. Det är troligt att de lipidbaserade reagenser inducera signifikant membran destabilisering, vilket leder till hög transgenexpression, men störa sfäroiderna genom att göra de cell-till-cell-interaktioner instabil.
Däremot störde den katjoniska polymeren sfäroiderna i mindre utsträckning än de lipider, särskilt i villkoren för låga N / P-förhållanden, för att bilda de polyplex. Standardprotokollet som visas här använder Polyplex nanomicelles som uppvisar PEG-skärmning. Alternativt kan polyplex med katjoniska homopolymerer, såsom polyetylenimin, också användas för genintroduktion i sfäroiderna. Faktum cationic polyplex utan PEG ytan ger i allmänhet hög transgen expression i in vitro-transfektioner och är attraktiva alternativ beroende på celltyp och syftet med sfäroid transplantation.
Kännetecknande för detta protokoll är användningen av micropatterned odlingsplattor belagda med en termosensitiv polymer. De micropatterned arrayer kan producera ett stort antal cell sfäroider med en likformig diameter. Detta protokoll använder arrayer diameter 100 pm, men denna aspekt är flexibel; dock mycket stora diametrar, såsom 500 um, orsakar ofta cellnekros i kärnan av sfäroiderna (opublicerade data). Genom att helt enkelt kyla plattorna på is, kan sfäroiderna erhållas i form av en injicerbar suspension genom försiktig aspirering med en spruta. En potentiell begränsning av denna teknik är storleken på nålen används för att injicera sfäroiderna. Det bekräftades att en 27-G nål kan användas säkert för sfäroider med 100 pm diameter. Däremot kan smala nålar inte tillämpas för dessa sfäroider. Eftersom en 27-G nål är för stor, särskilt för omplantering spheroids i mus ryggmärg, är ett möjligt alternativ att använda ställningar för att behålla celler inuti dem.
Protokollet kan potentiellt användas för flera ändamål av celltransplantation. Jämfört med suspensions sfäroid odlingssystemet, de micropatterned plattorna har fördelen att ett tillräckligt antal av sfäroider med likformig diameter kan lätt erhållas. Även om metoden för genintroduktion kan vara flexibel, som tidigare nämnts, Polyplex nanomicelles med PEG-skärmning är särskilt effektiva för att undvika sfäroid störningar. Förhoppningsvis kommer detta system att förbättra de terapeutiska effekterna av transplanterade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi uppskattar djupt Dr. Takeshi Ikeya och teknisk personal i Toyo Gosei, Tokyo, Japan för att ge värmekänsliga micropatterned odlingsplattor samt vetenskapliga råd. Vi vill också tacka Ms Satomi Ogura, Ms Sae Suzuki, Ms Asuka Miyoshi och Ms. Katsue Morii för tekniskt bistånd med djurförsök. Detta arbete stöds ekonomiskt delvis av JSPS KAKENHI Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning, Centrum för innovation (COI) Program och S-innovationsprogram från Japan Science and Technology Agency (JST), och JSPS Core- till kärnor Program, A. Advanced Research Networks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
