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Biology

मलेरिया हस्तांतरित मच्छरों के लिए एक बहु-खोज परख

Published: February 28, 2015 doi: 10.3791/52385
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Abstract

एनोफ़ेलीज़ gambiae प्रजातियों जटिल अफ्रीका में मच्छरों संचारण प्रमुख मलेरिया भी शामिल है। इन प्रजातियों जैसे चिकित्सा महत्व के होते हैं, क्योंकि कई लक्षण आम तौर पर महामारी विज्ञान के अध्ययन में सहायता करने के लिए आणविक assays का उपयोग विशेषता है। ये लक्षण प्रजातियों की पहचान, कीटनाशक प्रतिरोध, परजीवी के संक्रमण की स्थिति, और मेजबान वरीयता शामिल हैं। एनोफ़ेलीज़ gambiae परिसर की आबादी आकृति विज्ञान अप्रभेद्य हैं के बाद से, एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) पारंपरिक प्रजातियों की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रजातियों के नाम से जाना जाता है, एक बार कई बहाव के assays के नियमित आगे विशेषताओं को स्पष्ट करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, एक पैरा जीन में KDR के रूप में जाना जाता म्यूटेशन डीडीटी और pyrethroid कीटनाशकों के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays के (ELISAs) या प्लाज्मोडियम परजीवी डीएनए का पता लगाने पीसीआर assays के मच्छर के ऊतकों में मौजूद परजीवी का पता लगाने के लिए किया जाता है। अन्त में, एक combinatioपीसीआर और प्रतिबंध एंजाइम हज़म के एन मेजबान विशिष्ट डीएनए के लिए मच्छर bloodmeal स्क्रीनिंग से मेजबान वरीयता (जैसे, पशु रक्त बनाम मानव) को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम एक समय में 96 या 384 नमूनों के लिए एक एकल मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया जीनोटाइपिंग 33SNPs में aforementioned के assays के सभी को जोड़ती है कि एक बहु-खोज परख (एमडीए) विकसित किया है। एमडीए प्रजातियों, प्लाज्मोडियम का पता लगाने, और मेजबान रक्त की पहचान के लिए कई मार्करों शामिल है, क्योंकि झूठी सकारात्मक या नकारात्मक पैदा करने की संभावना बहुत विशेषता प्रति केवल एक मार्कर शामिल है कि पिछले assays से कम है। इस मजबूत और सरल परख लागत प्रभावी ढंग से और मौजूदा assays के समय का एक अंश में इन प्रमुख मच्छर लक्षण पता लगा सकते हैं।

Introduction

एनोफ़ेलीज़ arabiensis, एनोफ़ेलीज़ coluzzii और एनोफ़ेलीज़ gambiae अफ्रीका एक में मलेरिया संचरण के लिए जिम्मेदार प्रमुख वैक्टर हैं। ये तीन प्रजातियों आकृति विज्ञान के दो पृथक कर रहे हैं और केवल आणविक assays के 3-9 से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इसके अलावा, नियमित रूप से महामारी विज्ञान और जनसंख्या आनुवंशिकी के अध्ययन में सहायता करने के लिए आयोजित कई बहाव के assays के होते हैं। ये प्रजातीकरण द्वीपों 10-12 के लिए (1) एक जीनोटाइपिंग परख, (2) अमीनो एसिड कोडोन पैरा जीन की स्थिति वें 1014 में गैर पर्याय SNPs पहचानने एक जीनोटाइपिंग परख (तोड़े नीचे प्रतिरोध, या KDR, एसएनपी) 13 में शामिल -18, (3) परजीवी का पता लगाने पीसीआर 19-23, और मच्छर midguts 24,25 में मेजबान विशिष्ट डीएनए के लिए (4) स्क्रीनिंग।

हम एक के लक्ष्य के साथ एक एकल मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया में इन सभी assays के जोड़ती है कि एक बहु-खोज परख (एमडीए) विकसितअफ्रीका में मलेरिया वैक्टर epidemiologically महत्वपूर्ण विशेषताओं alyzing। एमडीए परख एकाधिक (1) प्रजातियों का पता लगाने के लिए मार्कर (ए arabiensis, ए gambiae, ए coluzzii, या तीन) के दूसरे (कोई नहीं) KDR SNPs में प्रतिनिधित्व, (2) कीटनाशक प्रतिरोध भी शामिल है (L1014F और L1014S दोनों) दो प्रमुख मलेरिया परजीवी की, (3) मौजूदगी, प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम और पी वैवाक्स, और एक एवियन और छह स्तनधारी मेजबान से (4) रक्त स्रोत है।

परंपरागत रूप से, इन assays अलग पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं में आयोजित की गई। इन सभी assays के एक पारंपरिक पीसीआर मंच का उपयोग कर रहे हैं, यह 8-10 पीसीआर प्रतिक्रिया assays के संचालन और जेल वैद्युतकणसंचलन चरणों के साथ की आवश्यकता है। यहाँ प्रस्तुत एमडीए विधि समग्रता में लगभग 5 घंटा लेता है, जबकि दस्तावेजीकरण परिणाम के लिए तैयारी से प्रत्येक व्यक्ति पीसीआर प्रतिक्रिया, 4-5 घंटा लेता है। अकेले यह श्रम लागत में एक 90% बचत के बराबर है। एमडीए यहाँ प्रस्तुत $ 5 लागतनमूना प्रति सभी 33 SNPs जीनोटाइप के लिए। यह काफी कम खर्चीला नमूना प्रति बारे में $ 1.50 की लागत जो एक agarose जेल आधारित assays, से अधिक है। एमडीए द्वारा कवर सभी विशेषताओं का पता लगाने के assays नमूना प्रति $ 12-15 की लागत से 8-10 अलग agarose जेल आधारित assays की एक न्यूनतम आवश्यकता होगी। इसके अलावा, एमडीए बहुत प्रत्येक परजीवी या मेजबान स्रोत का पता लगाने के लिए कम से कम तीन मार्कर का उपयोग करके एक झूठी सकारात्मक या नकारात्मक पैदा करने का मौका कम कर देता है।

हम उपयोग किया मंच मलेरिया वैक्टर तक सीमित नहीं है, लेकिन इस तरह की चिकित्सा, पशु चिकित्सा, और बुनियादी जीव विज्ञान 26-28 के रूप में आवेदनों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जा सकता है। में गहराई से नमूनों की एक बड़ी (100s के क्रम में) संख्या को शामिल एसोसिएशन पढ़ाई या जनसंख्या आनुवंशिकी के अध्ययन के लिए एक साथ कई मार्करों के लिए लागत प्रभावी assays के स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है। दो या दो से अधिक अलग पीसीआर assays के उपयोग कि अधिकांश अध्ययन एक कम कीमत पर जल्दी परिणाम के लिए एमडीए लागू कर सकता है।

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Protocol

1. पीसीआर प्रवर्धन

  1. एक 1.5ml microtube में सभी पीसीआर प्राइमरों (पूरक टेबल S1 देखें) मिलाएं। प्रत्येक एसएनपी दो प्राइमरों (आगे और रिवर्स) है। प्रत्येक पीसीआर प्राइमर का जायजा एकाग्रता 100 माइक्रोन पर रखा जाता है कि सुनिश्चित करें। (पूरक तालिका S2 देखें) बेंच में त्रुटि और समय pipetting कम करने के लिए 500-1,000 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त प्राइमर मिश्रण बनाओ। अगर वांछित, -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब और दुकान प्रति 100-200 प्रतिक्रियाओं के लिए aliquots तैयार करते हैं।
  2. निर्माता प्रोटोकॉल (तालिका 1) में वर्णित के रूप में पीसीआर कॉकटेल तैयार करें। 96 प्रतिक्रियाओं के लिए मात्रा 20% की अधिकता भी शामिल है। भंवर 2000 x जी पर 30 सेकंड के लिए पीसीआर हल्के से कॉकटेल और सेंट्रीफ्यूज युक्त ट्यूब।
  3. एक के प्रत्येक कुएं में पीसीआर कॉकटेल के 3 μl बांटना 96 अच्छी तरह से थाली गैर skirted। एक अपराधी पिपेट इस प्रक्रिया के लिए समय बचाने के लिए कर सकते हैं।
  4. प्रत्येक कुएं में मच्छरों की उचित जीनोमिक डीएनए के 2 μl जोड़ें।
    नोट: एम से जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने की प्रक्रिया osquito ऊतकों (सिर / छाती, पेट या पूरे शरीर) अन्य साहित्य 29-32 में वर्णित है। (सिर / छाती में प्लाज्मोडियम) संक्रामक मच्छरों से रक्त (पेट) में प्लाज्मोडियम के साथ उन लोगों को अलग करने के लिए एक उपयुक्त डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल चुनें। हम आम तौर पर मच्छरों के शरीर के अंगों (सिर / छाती या पेट) से निकाले डीएनए का उपयोग करें, ताकि डीएनए एकाग्रता 0.05-2ng / μl से भिन्न होता है। कुल डीएनए इनपुट निर्माता की सिफारिश (5-10ng / rxn) की तुलना में कम है, हम आम तौर पर मजबूत एसएनपी पूरे जीनोम प्रवर्धन बिना डीएनए नमूने के 98% से कॉल मिलता है।
  5. 370 x जी पर 1 मिनट के लिए मिश्रण या भंवर, और अपकेंद्रित्र धीरे, थाली सील।
  6. पीसीआर प्रवर्धन से बाहर ले जाने के लिए निम्न thermocycler प्रोटोकॉल का उपयोग करें: (1) 94 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए, (2) 94 डिग्री सेल्सियस से 30 सेकंड के लिए, (3) एक मिनट के लिए 30 सेकंड के लिए 56 डिग्री सेल्सियस, (4) 72 डिग्री सेल्सियस (5) दोहराने कदम (2) - (4) 45 चक्र के लिए, (6) 1 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
_title "> 2। एसएपी उपचार

  1. एक 96 अच्छी तरह से थाली में एसएपी एंजाइम समाधान तैयार (2 टेबल देखें)। एक थाली में 96 नमूनों की प्रक्रिया। 96 प्रतिक्रियाओं के लिए मात्रा 20% की अधिकता भी शामिल है।
  2. भंवर 2000 x जी पर 30 सेकंड के लिए एसएपी एंजाइम को हल्के ढंग से समाधान और सेंट्रीफ्यूज की ट्यूब। प्रत्येक कुएं में एसएपी एंजाइम समाधान के 2 μl बांटना। फिर, एक मुजरिम पिपेट इस प्रक्रिया के लिए समय बचाने के लिए कर सकते हैं।
  3. 370 x जी पर 1 मिनट के लिए मिश्रण या भंवर, और अपकेंद्रित्र धीरे, थाली सील। 40 मिनट के लिए (1) 37 डिग्री सेल्सियस, (2) 85 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए (3) 4 डिग्री सेल्सियस पकड़, इस प्रकार है: थाली सेते हैं। इस चरण के पूरा होने पर, आगे बढ़ने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर थाली की दुकान। 2 सप्ताह के भीतर जमा प्लेट की प्रक्रिया।

3. एसएनपी एक्सटेंशन

  1. नमूना थाली एसएपी उपचार के बाद जमे हुए है, तो यह आगे बढ़ने से पहले आरटी के लिए पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. विस्तार प्राइमर मिश्रण (पूरक तालिका S2) तैयार करें। प्रत्येक एसएनपी एक exte हैnsion प्राइमर। 500 माइक्रोन पर हर विस्तार प्राइमर का जायजा एकाग्रता रखें। वैकल्पिक रूप से, -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब और दुकान प्रति 100-200 प्रतिक्रियाओं के लिए विभाज्य।
  3. 96 प्रतिक्रिया मात्रा 20% की अधिकता शामिल तालिका 3 में वर्णित के रूप में विस्तार मिश्रण तैयार करें।
  4. भंवर 2000 x जी पर 30 सेकंड के लिए विस्तार हल्के से कॉकटेल और सेंट्रीफ्यूज की ट्यूब। प्रत्येक कुएं में विस्तार कॉकटेल के 2 μl बांटना। फिर, एक मुजरिम पिपेट इस प्रक्रिया के लिए समय बचाने के लिए कर सकते हैं।
  5. 370 x जी पर 1 मिनट के लिए मिश्रण या भंवर, और अपकेंद्रित्र धीरे, थाली सील। चित्र 1 में दिखाया के रूप में थाली Thermocycle। इस बिंदु पर, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए आगे बढ़ना या दो सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस के ऊपर पर थाली की दुकान।

4. कंडीशनिंग एसएनपी एक्सटेंशन उत्पाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण अनुकूलन करने के लिए

  1. नमूना थाली एसएनपी विस्तार के बाद जमे हुए है, तो यह आगे बढ़ने से पहले आरटी के लिए पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. इसके conta से राल की 15mg स्थानांतरणएक लम्बी चम्मच का उपयोग करते हुए डिंपल की थाली पर iner। डिंपल थाली के कुओं में राल प्रसार करने के लिए खुरचनी का प्रयोग करें। राल प्रसार करने के लिए डिंपल थाली भर पक्ष की ओर से खुरचनी स्वीप। राल प्रत्येक कुएं में वहाँ है सुनिश्चित करें।
  3. खुरचनी का उपयोग करते हुए डिंपल की थाली से दूर अतिरिक्त राल परिमार्जन। राल में कम से कम 20 मिनट के लिए डिंपल थाली में खड़े हैं। राल, डिंपल थाली में खड़े नमूना थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एचपीएलसी ग्रेड पानी के 41 μl जोड़ने जबकि दे।
  4. धीरे डिंपल की थाली पर नमूना प्लेट ऊपर से नीचे, जगह है। डिंपल थाली में कुओं के साथ नमूना थाली में कुओं aligns जो डिंपल थाली के छोटे गोल पोस्ट के खिलाफ नमूना थाली रिसेट सुनिश्चित करें।
  5. राल नमूना थाली के कुओं में डिंपल की थाली से बाहर जाता है तो एक साथ नमूना थाली और डिंपल थाली होल्डिंग, धीरे उन पर फ्लिप। राल नमूना थाली में बाहर हो जाता है इसलिए डिंपल थाली ठोकर। डि में सुनिश्चित करें कि सभी राल बनाओmple थाली नमूना थाली कुओं में बाहर हो जाता है। 30 सेकंड के लिए 3200 XG पर थाली अपकेंद्रित्र।
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए एक रोटेटर पर नमूना थाली घुमाएँ। रोटेटर नमूना थाली लंबे अक्ष के बारे में 360 डिग्री बारी बारी से करना चाहिए।
  7. 5 मिनट के लिए 3200 XG पर नमूना थाली अपकेंद्रित्र। इस कदम के बाद, अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले दो सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना थाली की दुकान।

5. MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस तरह के SpectroCHIP के रूप में एक bioarray पर वातानुकूलित एसएनपी विस्तार उत्पाद स्थानांतरण। हम इस कदम के लिए MassArray Nanodispenser का उपयोग करें।
  2. हस्तांतरण पूरा हो गया है एक बार, assays और प्लेटें परख डेटाबेस में स्थापित हो रहे हैं कैसे परिभाषित करते हैं। प्रत्येक थाली विशिष्ट परख डिजाइन (पूरक टेबल S3) के लिए लिंक है कि अद्वितीय पहचानकर्ता है कि इस तरह की परख और प्लेटों का नाम।
  3. परख और थाली में परिभाषित किया गया है, के बाद एक मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण।

  1. ऐसे टाइपकर्ता विश्लेषक या TyperViewer (Sequenom) के रूप में एक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण डेटा व्याख्या सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण करते हैं। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए नमूना लेआउट, जन spectrogram शामिल है जो .xml प्रारूप में डेटा प्राप्त, नाम सहित मार्कर जानकारी, इसी एसएनपी के प्रत्येक संस्करण के लिए उम्मीद की बड़े पैमाने पर, और किसी भी त्रुटि या प्रत्येक प्रतिक्रिया के साथ जुड़े चेतावनी संदेश। जिसके परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर spectrogram के लिए चित्र 2 देखें।
  2. । और प्रत्येक जीनोटाइप के लिए अनुमति दी सहिष्णुता / विचरण (शोर अनुपात करने के लिए परिमाण या संकेत) का पता लगाने दहलीज निर्धारित करके एसएनपी जीनोटाइप क्लस्टरिंग विश्लेषण बाहर ले जाने 3 एक 04,707-KDR # 2 एसएनपी जीनोटाइप समूहों का एक उदाहरण से पता चलता है।
  3. एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में जिसके परिणामस्वरूप एसएनपी जीनोटाइप कॉल निर्यात करें।

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Representative Results

प्रजातियों की पहचान:

एक नमूना तीन प्रजातियों में से एक नहीं है, तो निम्नलिखित 5 SNPs एक साथ,। तीन SNPs (01073-213, 04679-157 और 10,313 तीन प्रजातियों (ए arabiensis, ए coluzzii और ए gambiae) (तालिका 4) की पहचान -052) बढ़ाना असफल।

कीटनाशक प्रतिरोध inferring के लिए KDR जीनोटाइप:

पैरा वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल के 1014 वें कोडोन KDR से मेल खाती है। 1014 वें कोडोन के 2 एन डी और 3 आरडी आधार पर दो SNPs तीन संभावित अमीनो एसिड का निर्धारण। । जीनोटाइप के संभावित संयोजनों 5 तालिका में सूचीबद्ध हैं इस एसएनपी अफ्रीकी मलेरिया वैक्टर की तीन प्रजातियों के लिए काम करता है: ए arabiensis, ए coluzzii और ए gambiae। ये SNPs ए में बढ़ाना करने में विफल darlingi, ब्राजील के एक मलेरिया वेक्टर। यह नहींआश्चर्य की बात यह देखते हुए कि ए के बीच माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अनुक्रम समानता darlingi और ए तीन अफ्रीकी मलेरिया वैक्टर बीच माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अनुक्रम समानता 98% से अधिक कर रहे हैं, जबकि gambiae केवल 88.9% है। अन्य प्रजातियों का परीक्षण नहीं किया गया है। हम माली, कैमरून, तंजानिया और जाम्बिया में एकत्र नमूनों से प्रवर्धन में सफल रहे थे।

प्लाज्मोडियम का पता लगाने:

बरकरार प्लाज्मोडियम डीएनए मच्छर के ऊतकों में मौजूद है, तो हम पी का पता लगाने के लिए उम्मीद फाल्सीपेरम या पी मच्छर से निकाले डीएनए नमूने के बीच वैवाक्स विशिष्ट डीएनए। प्रजातियों विशिष्ट SNPs 123 पी की साइटोक्रोम बी अनुक्रम के अनुक्रम संरेखण से पहचान की गई फाल्सीपेरम, 97 पी वैवाक्स, 11 पी मलेरी और 18 पी ओवेल GenBank पर अफ्रीका से दृश्यों उपलब्ध अलग। हम पी भेद करने के लिए अद्वितीय एसएनपी जीनोटाइप जो उत्पादन 6 SNPs डिजाइन किए फाल्सीपेरम या पी VI VAX अन्य प्लाज्मोडियम प्रजातियों से (तालिका 6)। हम माली, कैमरून, तंजानिया, जाम्बिया और ब्राजील में एकत्र मच्छर नमूनों पर इस परख का परीक्षण किया और मार्कर के इस विशेष सेट की परवाह किए बिना मच्छर प्रजातियों का काम करता है कि पुष्टि की है।

Bloodmeal पता लगाने पीसीआर:

7 मेजबान प्रजातियों (मानव, चिकन, गाय, कुत्ते, बकरी, सुअर और भेड़) से साइटोक्रोम बी दृश्यों GenBank से एकत्र किए गए थे और आम सहमति के दृश्यों उत्पन्न किया गया। प्रत्येक मेजबान के लिए जानकारीपूर्ण SNPs तो जीनोटाइपिंग के लिए चयन किया गया था। हम 7 विभिन्न जानवरों (तालिका 7) से रक्त सूत्रों से यह परीक्षण किया गया।

पीसीआर टुकड़े (80-120 बीपी) कम कर रहे हैं, क्योंकि यह कुछ हद तक अपमानित डीएनए या मच्छर के ऊतकों से पर आंशिक रूप से पच bloodmeals पर काम करता है। झूठी सकारात्मक कॉल की संभावना बहुत मेजबान प्रकार प्रति एकाधिक मार्करों होने से कम हो जाता है।

एस "> चित्र 1
एसएनपी विस्तार कदम के लिए चित्रा 1. thermocycler कार्यक्रम। प्रवर्धन चक्र 200 (5X40) की कुल है।

चित्र 2
एमडीए के लिए चित्रा 2. मास-spectrogram। एक्स अक्ष एसएनपी विस्तार उत्पादों की बड़े पैमाने पर (डीए) और वाई अक्ष संकेत तीव्रता है। लाल लाइनों चयनित मार्कर के लिए उम्मीद की अनिगमित एक्सटेंशन प्राइमर की बड़े पैमाने पर, एसएनपी एलील एक और एलील दो संकेत मिलता है। ग्रे लाइनों एमडीए में अन्य मार्करों के द्रव्यमान की उम्मीद से संकेत मिलता है। इस साजिश चरण 5 के बाद उत्पादन डेटा फ़ाइल से डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (टाइपकर्ता विश्लेषक या टाइपकर्ता दर्शक) से उत्पन्न होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ई = "हमेशा"> चित्र तीन
चित्रा 3. व्यक्तिगत एसएनपी जीनोटाइप क्लस्टर एक्स अक्ष वाई अक्ष जीनोटाइप कॉल संकेत की भयावहता है एसएनपी एलील एक और एसएनपी एलील 2. का संकेत तीव्रता के ("कोण" के रूप में चिह्नित) arctangent मूल्य है देखने के लिए। इस साजिश डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (टाइपकर्ता विश्लेषक या टाइपकर्ता दर्शक) में प्रदान की जाती है। किसी विशेष डेटा एक माउस बटन के एक क्लिक के साथ चुना जा सकता है और चयनित नमूना डेटा मंडली ने संकेत दिया है। सॉफ्टवेयर समूहों में प्रदान की क्लस्टरिंग विश्लेषण एक उपयोगकर्ता परिभाषित विचरण दहलीज और स्वचालित रूप से रंग एक biallelic एसएनपी के तीन जीनोटाइप के साथ जीनोटाइप। यहाँ दिखाए गए उदाहरण नीला त्रिकोण, हरे वर्गों और नारंगी उल्टे त्रिकोण के रूप में समयुग्मक ए (एए) व्यक्तियों के रूप में विषम युग्मज (टीए) के रूप में समयुग्मक टी (टीटी) व्यक्तियों को इंगित करता है। लाल हलकों कोई कॉल (कोई प्रवर्धन) का प्रतिनिधित्व करते हैं।टी = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक 5 μl में एकाग्रता आयतन आयतन
(1 rxn) (96 rxns)
जल (एचपीएलसी ग्रेड) एनए 0.8 μl 92.2 μl
20 मिमी और MgCl2 साथ 10x पीसीआर बफर 1x (2 मिमी और MgCl2) 0.5 μl 57.6 μl
MgCl2 (25 मिमी) ** 2 मिमी 0.4 μl 46.1 μl
dNTP मिश्रण (25 मिमी प्रत्येक) *** 500 माइक्रोन 0.1 μl 11.5 μl
प्राइमर मिश्रण (500 एनएम प्रत्येक) 100 एनएम 1.0 μl 115.2 μl
पीसीआर एंजाइम (5 यू / μl) 1.0 यू / rxn 0.2 μl 23.0 μl
कुल मात्रा: 3.0 μl 345.6 μl

तालिका 1 मल्टीप्लेक्स पीसीआर कॉकटेल नुस्खा। एक प्रतिक्रिया है और एक 20% की अधिकता के साथ 96 प्रतिक्रियाओं के लिए पीसीआर विस्तार कदम के लिए प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा।

कुल मात्रा
अभिकर्मक खंड (1 rxn) वॉल्यूम (96 rxn)
जल (एचपीएलसी ग्रेड) 1.53 μl 176.3 μl
एसएपी बफर (10x) 0.17 μl 19.6 μl
एसएपी एंजाइम (1.7 यू / μl) 0.30 μl 34.6 μl
2.00 μl 230.4 μl

तालिका 2 एसएपी एंजाइम समाधान। एक प्रतिक्रिया है और एक 20% की अधिकता के साथ 96 प्रतिक्रियाओं के लिए झींगा alkaline फॉस्फेट के इलाज के लिए प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा।

अभिकर्मक सान्द्र। 9 μl में वॉल्यूम (1rxn) वॉल्यूम (96 rxns)
जल (एचपीएलसी ग्रेड) एनए 0.6190 μl 71.3 μl
iPLEX बफर प्लस (10x) 0.222x 0.2000 μl 23.0 μl
iPLEX समाप्ति मिश्रण 1x 0.2000 μl 23.0 μl
एक्सटेंशन प्राइमर मिश्रण 0.9400 μl 108।3 μl
iPLEX एंजाइम 1x 0.0410 μl 4.7 μl
कुल मात्रा 2.0000 μl 230.4 μl

तालिका 3. एसएनपी एक्सटेंशन कॉकटेल एक प्रतिक्रिया है और एक 20% की अधिकता के साथ 96 प्रतिक्रियाओं के लिए एसएनपी विस्तार कदम के लिए प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा।

तालिका 4
प्रत्येक प्रजातियों के लिए तालिका 4 एसएनपी जीनोटाइप। 28S IGS-540, 28S IGS-649 और 01073-213 एक्स गुणसूत्र पर स्थित हैं, 04679-157 गुणसूत्र दो पर है और 10313-052 गुणसूत्र 3. हाइब्रिड जीनोटाइप पर है (विषम युग्मज) पीले रंग में प्रकाश डाला है। ए में फिक्स्ड संस्करण coluzzii ए में हल्के नीले और निश्चित संस्करण में चिह्नित है gambiae अंधेरे में चिह्नित हैनीला।

टेबल 5
सारणी 5. एसएनपी KDR के लिए जीनोटाइप। दो SNPs KDR # 1 और KDR # दो पैरा जीन के 1014 वें कोडोन के लिए एक जीनोटाइप का गठन। यह परख में शामिल नहीं है इसलिए पहले बेस अविकारी है। अतिसंवेदनशील समयुग्मक जीनोटाइप नीले रंग में चिह्नित कर रहे हैं। सबसे प्रतिरोधी L1014F homozygote जीनोटाइप गहरे नीले रंग में चिह्नित है। पीला रंग विषम युग्मज इंगित करता है। Intermediately प्रतिरोधी जीनोटाइप L1014 एस, नारंगी में दिखाया गया है।

6 तालिका
पी के लिए 6 तालिका एसएनपी जीनोटाइप फाल्सीपेरम और पी वैवाक्स ओंग>। कुल 6 SNPs मलेरिया परजीवी की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए किया जाता है। PL-0041, PL-1269 और PL-1549 पी होते हैं फाल्सीपेरम विशिष्ट एलील (क्रमशः जी, टी और टी)। तीन alleles की एक साथ प्रवर्धन अपेक्षाकृत बरकरार पी की उपस्थिति का संकेत नमूना डीएनए में फाल्सीपेरम डीएनए। वैकल्पिक एलील (PL-0041 और PL-1269 के लिए ए) के प्रवर्धन नमूने में अन्य प्लाज्मोडियम प्रजातियों (जैसे, पी.वैवाक्स, पी.ओवेल या पी मलेरी) की उपस्थिति इंगित करता है। PF-1549 बहुत से अधिक पी के साथ क्षेत्रों में स्थित है इस प्रकार इस एसएनपी क्षेत्रों flanking फाल्सीपेरम विशिष्ट केवल जब पी परिलक्षित होता है फाल्सीपेरम मौजूद है। PL-0071, PL-1245 और PL-0157 पी होते हैं वैवाक्स विशिष्ट एलील (क्रमशः जी, जी और टी)। वैकल्पिक एलील (ए, क्रमश: ए और सी) के प्रवर्धन नमूने में अन्य प्लाज्मोडियम डीएनए की उपस्थिति इंगित करता है। असंक्रमित मच्छरों सभी 6 मार्करों पर कोई प्रवर्धन होगा। टेबल 7
। 7 मेजबान के लिए टेबल 7. एसएनपी जीनोटाइप: मानव, चिकन, गाय, कुत्ता, बकरी, सुअर और भेड़ "नेकां" निम्न तालिका में "कोई कॉल" (कोई प्रवर्धन) के लिए खड़ा है। लेकिन नहीं एक विशेष मेजबान के सभी SNPs के लिए, कुछ गैर विशिष्ट प्रवर्धन कुछ loci में हो सकता है कि ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

- उड़ान (MALDI-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री 33-37 के समय पीसीआर प्रवर्धन, झींगा alkaline फॉस्फेट (एसएपी) प्रतिक्रिया, एसएनपी विस्तार, विस्तार उत्पाद कंडीशनिंग, और मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / आयनीकरण: एमडीए पांच प्रमुख कदम से बना है। पहले पीसीआर प्रवर्धन कदम पर्याप्त है कि टेम्पलेट डीएनए एसएनपी विस्तार कदम पर उपलब्ध हो जाएगा तो प्रत्येक एसएनपी flanking डीएनए amplifies। एसएपी प्रतिक्रिया निम्नलिखित एसएनपी विस्तार कदम के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो अप्रयुक्त dNTPs neutralizes। एसएनपी विस्तार एसएनपी ठिकाना और बड़े पैमाने पर संशोधित टर्मिनेटर न्यूक्लियोटाइड प्रति एक विस्तार प्राइमर शामिल है। 3'-अंत संशोधित न्यूक्लियोटाइड विस्तार प्राइमर में शामिल होने से बाद के न्यूक्लियोटाइड रोका जा सके। इस प्रकार एकल आधार के द्रव्यमान के लिए इसी एसएनपी की जीनोटाइप इंगित करता है।

इस दृष्टिकोण की सफलता सुनिश्चित करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य जीव में मौजूदा बहुरूपताओं का एक अच्छा डाटासेट चल रहा हैएस। हम प्रजातियों की पहचान (एन> 900) 10,12,38-40 और KDR (एन> 1000) 15,18 के लिए अच्छी तरह से विशेषता SNPs इस्तेमाल किया। प्लाज्मोडियम के लिए प्रजातियों विशिष्ट SNPs 123 पी की साइटोक्रोम बी दृश्यों के अनुक्रम संरेखण से पहचान की गई फाल्सीपेरम, 97 पी वैवाक्स, 11 पी मलेरी और 18 पी ओवेल GenBank पर उपलब्ध थे जो अफ्रीका से दृश्यों को अलग। 7 मेजबान प्रजातियों (मानव, चिकन, गाय, कुत्ते, बकरी, सुअर और भेड़) से साइटोक्रोम बी दृश्यों मेजबान विशिष्ट एसएनपी पहचान के लिए GenBank से एकत्र किए गए थे। अनुक्रम डेटा के इस बड़े शरीर के आधार पर हमने एक परख डिजाइनर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक मजबूत नैदानिक ​​परख डिजाइन करने में सक्षम थे।

प्रत्येक प्रतिक्रिया समायोजित कर सकते हैं मार्करों की संख्या डिमर क्षमता (0-1 पैमाने की 0.9) प्राइमर के लिए एक सहिष्णुता दिया प्राइमर मिश्रण के जैव रासायनिक अनुकूलता से निर्धारित होता है। झूठी भड़काना क्षमता के लिए; लेखक डिफ़ॉल्ट मूल्य (सबसे सख्त 1) का इस्तेमाल किया। आरइस पैरामीटर के elaxation संभावित SNPs इस अध्ययन में शामिल करने के अलावा एक भी प्रतिक्रिया में assayed किया जा सकता है कि SNPs की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं।

पीसीआर प्रवर्धन चरणों मजबूत कर रहे हैं और आम तौर पर प्रारंभिक परख डिजाइन से समायोजन की आवश्यकता नहीं है। एसएनपी विस्तार मिश्रण (3 टेबल), तथापि, प्रत्येक प्राइमर के लिए हासिल की है शोर अनुपात करने के लिए एक पर्याप्त संकेत सुनिश्चित करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर प्रत्येक प्राइमर के रिश्तेदार मात्रा में संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। प्रदान की एसएनपी विस्तार प्राइमर नुस्खा इन समायोजन का परिणाम है। विस्तार प्राइमरों के बीच संगतता एक भी प्रतिक्रिया में मल्टीप्लेक्स हो सकता है कि SNPs की कुल संख्या सीमित कर सकता है। प्रतिक्रिया मात्रा (5-8 μl) छोटा है के बाद से, नमूना प्लेट ठीक से प्रवर्धन चरणों के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए सील करने की जरूरत है।

अन्य एसएनपी जीनोटाइपिंग प्लेटफार्मों accommodat सकता है, जबकि यह मंच एक साथ, प्रतिक्रिया प्रति 35 SNPs अप करने के लिए स्कोर कर सकते हैंप्रतिक्रिया 41 प्रति ई एक हजार से अधिक SNPs। जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के साथ, एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 29,42,43 का उपयोग कर SNPs के लाखों प्राप्त कर सकते हैं। हालांकि, यहां इस्तेमाल तकनीक कई (100s-1000) के लिए व्यक्तियों मार्करों की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या जीनोटाइपिंग की आवश्यकता होती है कि अध्ययन के लिए एक आदर्श आवेदन प्रदान करता है। अलग एसएनपी जीनोटाइपिंग मंच के डिजाइन की कमी के अतिरिक्त चर्चा पिछले अध्ययनों 41 में शामिल किया है।

एमडीए मलेरिया वैक्टर epidemiologically महत्वपूर्ण लक्षण निस्र्पक के उद्देश्य और प्राकृतिक आबादी से एकत्र मच्छरों के हजारों का विश्लेषण मध्यम throughput के एसएनपी जीनोटाइपिंग assays के लिए एक आदर्श प्रोटोकॉल प्रदान करता है। एमडीए अभिकर्मक लागत में (2) एक 60% की कमी है, और कई मार्कर का उपयोग करके झूठी सकारात्मक / नकारात्मक (3) में कमी, श्रम समय में एक 90% की कमी यहाँ पर प्रस्तुत (1) प्रदान करता है। प्रस्तावित परख द्वारा महामारी विज्ञान के अध्ययन में वृद्धि कर सकतेबहुत डेटा संग्रह की सुविधा। इसके अलावा, यह जनसंख्या मूल के संबंध में, कीटनाशक प्रतिरोध, परजीवी संवेदनशीलता और मेजबान विकल्प के साथ मच्छर के नमूने निस्र्पक द्वारा जीनोम चौड़ा संघ के अध्ययन में सुधार कर सकते हैं। अंत में, इस एमडीए प्रेरणा और एक MALDI-TOF आधारित एसएनपी जीनोटाइपिंग मंच का उपयोग अन्य मल्टीप्लेक्स assays के डिजाइन करने के लिए एक टेम्पलेट उपलब्ध करा सकता है।

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Acknowledgments

हम डीआरएस धन्यवाद। तंजानिया से मच्छर नमूनों प्रदान करने के लिए ग्लासगो विश्वविद्यालय में यूसी डेविस और डॉ कथरीना Kreppel पर एंथोनी Cornel और लौरा नॉरिस। हम जाम्बिया से मच्छर के नमूने बांटने के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य के जॉन्स हॉपकिन्स स्कूल से सुश्री स्मिता दास और डॉ डगलस नॉरिस धन्यवाद। हम यह भी परख डिजाइन पर प्रशिक्षण के लिए पशु चिकित्सा आनुवंशिकी प्रयोगशाला में श्री ली वी मिलोन धन्यवाद। इस काम R01AI 078,183 और R21AI062929 अनुदान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

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संक्रामक रोग अंक 96 मच्छर एसएनपी जीनोटाइपिंग मल्टीप्लेक्स परख iPLEX MALDI-TOF कीटनाशक प्रतिरोध प्रजातीकरण द्वीप समूह प्रजातियों निदान परजीवी का पता लगाने रक्त स्रोत का पता लगाने मेजबान वरीयता संक्रमण की स्थिति
मलेरिया हस्तांतरित मच्छरों के लिए एक बहु-खोज परख
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