Abstract
Den Malariamyg arter komplekse omfatter den største malaria transmission myg i Afrika. Fordi disse arter er af en sådan medicinsk betydning, er flere træk typisk karakteriseret ved hjælp af molekylære assays til støtte i epidemiologiske undersøgelser. Disse træk indbefatter artsidentifikation, insekticidresistens, parasitinfektion status og præference vært. Da populationer af Malariamyg komplekset er morfologisk uskelnelige er en polymerasekædereaktion (PCR), der traditionelt anvendes til at identificere arter. Når arten vides er flere efterfølgende analyser udføres rutinemæssigt for at belyse yderligere egenskaber. For eksempel mutationer kendt som KDR i en para-genet giver resistens mod DDT og pyrethroidinsekticider. Derudover er enzym-linked immunosorbent assays (ELISA'er) eller parasitten Plasmodium DNA-detektion PCR-assays anvendes til at påvise parasitter stede i myg væv. Endelig en combination af PCR og restriktionsenzymsteder fordøjer kan anvendes til at belyse vært præference (f.eks humant vs. dyreblod) ved screening af myg blodmel for vært-specifik DNA. Vi har udviklet en multi-detektion assay (MDA), der kombinerer alle de ovennævnte assays i en enkelt multiplex reaktion genotype 33SNPs til 96 eller 384 prøver ad gangen. Fordi MDA indeholder flere markører for arter, Plasmodium afsløring og vært blod identifikation, er sandsynligheden for at generere falske positiver eller negativer stærkt reduceret fra tidligere analyser, der omfatter kun én markør pr træk. Denne robuste og enkle analyse kan afsløre disse centrale myg træk omkostningseffektivt og på en brøkdel af den tid af eksisterende analyser.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii og Malariamyg er de store vektorer der er ansvarlige for malaria transmission i Afrika 1. Disse tre arter er morfologisk skelnes 2 og kan kun skelnes ved molekylære assays 3-9. Derudover er der mange downstream assays rutinemæssigt udført for at hjælpe epidemiologiske og populationsgenetik studier. Disse omfatter (1) en genotypebestemmelsesassay for speciering øer 10-12, (2) en genotypebestemmelsesassay anerkendelse af ikke-synonyme SNP'er i 1014 th aminosyre kodonposition para gen (knock-down modstand eller KDR, SNP) 13 -18 (3) påvisning af parasitter PCR 19-23, og (4) screening for host-specifikke DNA i myg midguts 24,25.
Vi udviklede en multi-detektion assay (MDA), der kombinerer alle disse assays i en enkelt multiplex reaktion med målet om etalyzing epidemiologisk vigtige kendetegn ved malaria vektorer i Afrika. MDA assay indeholder flere markører til påvisning af (1) arter (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii eller andre (ingen af de tre)), (2) insekticidresistens repræsenteret i KDR SNP'er (både L1014F og L1014S) (3) tilstedeværelsen af to store malariaparasitter, Plasmodium falciparum og P. vivax, og (4) blod kilde fra en aviær og seks pattedyrværter.
Traditionelt blev disse assays udført i separate polymerase kædereaktioner. Når alle disse assays er udført under anvendelse af en konventionel PCR-platform, kræver det ledende 8-10 PCR-reaktionsbetingelser assays og ledsagende gelelektroforesesystemer trin. Hver enkelt PCR-reaktion fra forberedelse til dokumentere resultater tager 4-5 timer, mens MDA metoden præsenteres her tager omkring 5 timer i helhed. Det svarer til en 90% besparelse i lønomkostningerne alene. MDA præsenteres her koster $ 5per prøve at genotypebestemme alle 33 SNPs. Dette er betydeligt billigere end de enkelte agarose gel-baserede assays, som koster omkring $ 1,50 per prøve. Analyser påvisning alle de egenskaber, der er omfattet af MDA ville kræve et minimum af 8-10 separate agarose gel-baserede assays til en pris på $ 12-15 per prøve. Desuden MDA reducerer chancen for at frembringe en falsk positiv eller negativ ved at udnytte mindst tre markører for hver parasit eller vært kilde detektion.
Platformen vi udnyttet er ikke begrænset til malaria vektorer, men kan anvendes i en lang række anvendelser, såsom medicin, veterinærmedicin og grundlæggende biologi 26-28. Dybdegående associationsstudier eller populationsgenetik undersøgelser, hvor en stor (i rækkefølge efter 100'erne) antal prøver kræver omkostningseffektive assays screening for flere markører samtidig. De fleste undersøgelser, der anvender to eller flere separate PCR-assays kunne gennemføre MDA for hurtigere resultater til en lavere pris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCR-amplifikation
- Bland alle PCR-primere (se supplerende tabel S1) i en 1,5 ml mikrorør. Hver SNP har to primere (fremad og tilbage). Sørg for, at bestanden koncentrationen af hver PCR-primer holdes på 100 um. Gør nok primer mix til 500-1.000 reaktioner for at mindske pipetteringsfejl og tid på bænken (se supplerende tabel S2). Hvis det ønskes, forberede portioner til 100-200 reaktioner pr rør og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered PCR cocktail som beskrevet i producentens protokol (tabel 1). Lydstyrken for 96 reaktioner omfatter et udhæng på 20%. Vortex rør indeholdende PCR cocktail let og centrifugeres i 30 sekunder ved 2.000 x g.
- Dispenser 3 pi af PCR cocktail i hver brønd i en ikke-skørt 96 brønds plade. En repeater pipette kan spare tid for denne proces.
- Tilsæt 2 pi af den passende genomisk DNA af myg i hver brønd.
BEMÆRK: processen med at få genomisk DNA fra m osquito væv (hoved / thorax, abdomen eller hele kroppen) er beskrevet i andre litteraturer 29-32. Vælg en passende DNA-ekstraktion protokol til at differentiere dem med Plasmodium i blodet (underliv) fra infektiøse myg (Plasmodium i hovedet / brystkasse). Vi bruger typisk DNA ekstraheret fra kropsdele (hoved / thorax eller underliv) af myg, så DNA-koncentration varierer fra 0.05-2ng / pl. Selvom det totale DNA input er lavere end fabrikantens anbefaling (5-10ng / rxn), typisk får vi robust SNP opkald fra 98% af DNA-prøver uden hele genomet amplifikation. - Seal pladen forsigtigt blande eller vortex, og centrifugeres i 1 min ved 370 x g.
- Brug følgende thermocycler protokol til at udføre PCR-amplifikation: (1) 94 ° C i 2 min, (2) 94 ° C i 30 sek, (3) 56 ° C i 30 sek, (4) 72 ° C i 1 min (5) gentage trin (2) - (4) i 45 cyklusser (6), 72 ° C i 1 min og 4 ° C hold.
- Forbered SAP enzymopløsning i en plade med 96 brønde (se tabel 2). Proces 96 prøver i en plade. Lydstyrken for 96 reaktioner omfatter et udhæng på 20%.
- Vortex røret SAP enzymopløsning let og centrifugeres i 30 sekunder ved 2.000 x g. Dispenser 2 pi af SAP enzymopløsning i hver brønd. Igen kan en repeater pipette spare tid for denne proces.
- Seal pladen forsigtigt blande eller vortex, og centrifugeres i 1 min ved 370 x g. Inkubér pladen som følger: (1) 37 ° C i 40 minutter, (2) 85 ° C i 5 minutter for at inaktivere enzymet, (3) 4 ° C hold. Ved afslutningen af dette trin opbevares pladen ved -20 ° C før der fortsættes. Proces den lagrede plade inden for 2 uger.
3. SNP Extension
- Hvis prøven plade er frosset efter SAP behandling, gør det muligt at tø til RT, før du fortsætter.
- Forbered primerblanding (Supplemental tabel S2). Hver SNP har en Electroluxnsion primer. Hold stamkoncentration hver forlængelse primer på 500 uM. Eventuelt portion for 100-200 reaktioner per rør og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered udvidelse blanding som beskrevet i tabel 3. 96 reaktionsvolumen indeholder et overhæng på 20%.
- Vortex røret udvidelse cocktail let og centrifugeres i 30 sekunder ved 2.000 x g. Dispenser 2 pi af forlængelsen cocktail i hver brønd. Igen kan en repeater pipette spare tid for denne proces.
- Seal pladen forsigtigt blande eller vortex, og centrifugeres i 1 min ved 370 x g. Thermocycle pladen som vist i figur 1. På dette tidspunkt, videre til massespektrometri eller opbevare pladen ved -20 ° C i op til 2 uger.
4. Conditioning SNP Extension Produkt Optimer massespektrometrianalyse
- Hvis prøven plade er frosset efter SNP udvidelse, gør det muligt at tø til RT, før du fortsætter.
- Overfør 15 mg harpiks fra sin container på dimple plade ved hjælp af et aflangt spoon. Brug skraberen til at sprede harpiks i brøndene i dimple plade. Fej skraberen fra side til side på tværs af dimple plade til at sprede harpiksen. Sørg for at der er harpiks i hver brønd.
- Skrab overskydende harpiks fra den smilehul plade ved hjælp af skraber. Lad harpiksen stå i dimple plade mindst 20 min. Samtidig lade harpiksen stå i dimple plade tilsættes 41 pi af HPLC-kvalitet vand til hver brønd af prøven plade.
- Anbring forsigtigt prøve plade på hovedet, på smilehul plade. Sørg prøvepladen nulstiller mod den lille afrundede stillingen som smilehul plade, som justerer brøndene i prøven plade med brønde i smilehul plade.
- Hold prøveplade og dimple plade sammen forsigtigt vende dem over så harpiksen falder ud af dimple plade i brøndene på prøvepladen. Tryk på smilehul pladen, så harpiksen falder ud i prøveplade. Sørg for at alle harpiksen i dimple plade falder ud i prøve brønde. Centrifugeres pladen ved 3.200 xg i 30 sek.
- Drej prøveplade på en rotator i 5 minutter ved stuetemperatur. Rotator skal rotere prøveplade 360 ° omkring den lange akse.
- Centrifuger prøven plade ved 3.200 xg i 5 min. Efter dette trin, gemme prøven plade ved -20 ° C i op til 2 uger før du går videre til næste trin.
5. MALDI-TOF-massespektrometri
- Overfør det konditionerede SNP forlængelsesprodukt på en bioarray såsom SpectroCHIP ifølge producentens anvisninger. Vi bruger MassArray Nanodispenser til dette trin.
- Når overførslen er færdig, skal du definere, hvordan assays og plader er at blive oprettet i analysen databasen. Navngiv assay og plader, således at hver plade har entydigt id, der linker til specifik analyse design (Supplemental tabel S3).
- Efter assay og pladen er blevet defineret erhverve spektre ved hjælp af et massespektrometer.
- Udfør dataanalyse ved hjælp af en real-time PCR-analyse af data fortolkning software som Typer Analyzer eller TyperViewer (Sequenom). Indhente data i .xml format, som indeholder prøven layout, masse spektrogram for hver brønd, markøren oplysninger, herunder navn, forventede masse for hver variant af den tilsvarende SNP, og eventuelle fejl eller advarselsmeddelelser forbundet med hver reaktion. Se Figur 2 for den resulterende masse spektrogram.
- Udføre SNP genotypen clustering analyse ved at sætte detektionsgrænsen og tolerance / varians tilladt for hver genotype (størrelsesorden eller signal støjforhold). Figur 3 viser et eksempel på en 04.707-KDR # 2 SNP genotype klynger.
- Eksporter de resulterende SNP genotype opkald til et regnearksprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arter identifikation:
Følgende 5 SNP'er sammen identificerer tre arter (A. arabiensis, A. coluzzii og A. gambiae) (tabel 4). Hvis en prøve ikke er en af de tre arter, de tre SNP'er (01073-213, 04679-157 og 10.313 -052) undlader at forstærke.
KDR genotype for udlede insekticidresistens:
Den 1014 th kodon i para spændingsstyret natriumkanal svarer til KDR. To SNP'er på 2. og 3. base af de 1.014 th codon bestemme de tre mulige aminosyrer. . De mulige kombinationer af genotyper er anført i tabel 5 Denne SNP virker for tre arter af afrikanske malaria vektorer A. arabiensis, A. coluzzii og A. gambiae. Disse SNP'er ikke amplificere i A. darlingi, en brasiliansk malaria vektor. Dette er ikkeoverraskende eftersom mitochondriegenom sekvenslighed mellem A. darlingi og A. gambiae er kun 88,9%, mens mitochondriegenom sekvenslighed mellem tre afrikanske malaria vektorer er over 98%. Andre arter er ikke blevet testet. Vi havde held med forstærkning fra prøver indsamlet i Mali, Cameroun, Tanzania og Zambia.
Plasmodium afsløring:
Hvis intakt Plasmodium DNA er til stede i myg væv, forventer vi at opdage P. falciparum eller P. vivax specifikt DNA blandt DNA-prøven ekstraheret fra myg. De artsspecifikke SNP'er blev identificeret fra sekvensopstilling af cytochrom b-sekvensen af 123 P. falciparum, 97 P. vivax, 11 s malariae og 18 s ovale isolere sekvenser fra Afrika tilgængelig på Genbank. Vi designede 6 SNPs der producerer unikke SNP genotyper at skelne P. falciparum eller P. VI VAX fra andre Plasmodium arter (tabel 6). Vi har testet denne analyse på myg indsamlet i Mali, Cameroun, Tanzania, Zambia og Brasilien og bekræftet, at dette bestemt sæt af markører fungerer uafhængigt af myg arter.
Blodmel afsløring PCR:
Cytochrom bs sekvenser fra 7 værtsart (menneskelige, kylling, ko, hund, ged, svin og får) blev indsamlet fra Genbank og konsensussekvenserne blev genereret. SNP'er informative for hver vært blev derefter udvalgt til genotypebestemmelse. Vi testede denne med blod kilder fra 7 forskellige dyr (tabel 7).
Fordi PCR-fragmenter er korte (80-120 bp), det virker på noget nedbrudt DNA eller på delvist fordøjet bloodmeals fra myg væv. Sandsynligheden for falske positive opkald er stærkt reduceret ved at have flere markører pr vært type.
s ">
Figur 1. Thermocycler program for SNP udvidelse trin. Amplifikationscyklen er alt 200 (5x40).
Figur 2. Masse-spektrogram for MDA. X-aksen er masse (Da) af SNP forlængelsesprodukter og Y-aksen er signalintensitet. De røde linjer angiver den forventede masse af personlige Extension primer, SNP allel 1 og allel 2 for den valgte markør. Grå linjer angiver forventede masse andre markører i MDA. Dette plot er genereret fra dataanalyse software (Typer Analyzer eller Typer Viewer) fra output datafilen efter trin 5. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
e = "altid"> 
Figur 3. Individuel SNP genotype klynge se X-aksen er arcus tangens værdi (mærket som "Angle") af signalintensiteter i SNP allel 1 og SNP allel 2. Y-aksen er størrelsen af genotype call signal. Dette plot er forudsat i dataanalyse software (Typer Analyzer eller Typer Viewer). Eventuelle særlige oplysninger kan vælges med et klik på en museknap og udvalgt stikprøve data er angivet med cirkel. Clustering analyse forudsat i den software klynger genotyper med en brugerdefineret varians tærskel og automatisk farver tre genotyper af en biallel SNP. Eksempel vist her indikerer homozygote T (TT) enkeltpersoner som blå trekanter, heterozygot (TA) som grønne pladser og homozygote A (AA) personer som orange omvendte trekanter. Røde cirkler repræsenterer Ingen opkald (ingen forstærkning).t = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Reagens | Koncentration i 5 pi | Volumen | Volumen |
| (1 rxn) | (96 rxns) | ||
| Vand (HPLC-kvalitet) | NA | 0,8 pi | 92.2 pi |
| 10x PCR buffer med 20 mM MgCl2 | 1x (2 mM MgCI2) | 0,5 pi | 57,6 pi |
| MgCl2 (25 mM) ** | 2 mM | 0,4 pi | 46.1 pi |
| dNTP-blanding (25 mM hver) *** | 500 um | 0,1 pi | 11.5 pi |
| Primer mix (500 nM hver) | 100 nM | 1,0 pi 115,2 pi | |
| PCR Enzyme (5 U / pl) | 1,0 U / rxn | 0,2 pi | 23.0 pi |
| Total Volume: | 3,0 pi | 345,6 pi |
Tabel 1. Multiplex PCR cocktail opskrift. Mængden af hvert reagens til PCR extension skridt for én reaktion og 96 reaktioner med en 20% udhæng.
| Reagens | Volumen (1 rxn) | Volumen (96 rxn) |
| Vand (HPLC-kvalitet) | 1,53 pi | 176,3 pi |
| SAP buffer (10x) | 0,17 pi | 19,6 pi |
| SAP-enzym (1,7 U / pl) | 0,30 pi | 34,6 pi | 2,00 pi | 230,4 pi |
Tabel 2. SAP enzymopløsning. Mængden af hvert reagens til Shrimp Alkaline Phosphatase behandling for en reaktion og 96 reaktioner med en 20% udhæng.
| Reagens | Conc. I 9 pi | Volumen (1rxn) | Volumen (96 rxns) |
| Vand (HPLC-kvalitet) | NA | 0,6190 pi | 71,3 pi |
| IPLEX Buffer Plus (10x) | 0.222x | 0,2000 pi | 23.0 pi |
| IPLEX Opsigelse mix | 1x | 0,2000 pi | 23.0 pi |
| Primerblanding | 0,9400 pi | 108.3 pi | |
| IPLEX enzym | 1x | 0,0410 pi | 4.7 pi |
| Total Volume | 2,0000 pi | 230,4 pi |
Tabel 3. SNP Extension cocktail Mængden af hvert reagens til SNP udvidelse skridt for én reaktion og 96 reaktioner med en 20% udhæng.
Tabel 4. SNP genotyper for hver art. 28S IGS-540, 28S IGS-649 og 01073-213 er placeret på X-kromosomet, 04679-157 er på kromosom 2 og 10313-052 er på kromosom 3. Hybrid genotype (heterozygot) er markeret med gult. Fast variant A. coluzzii er markeret med lyseblåt og fast variant i A. gambiae er markeret med mørkblå.
Tabel 5. SNP genotyper for KDR. To SNPs KDR # 1 og KDR nr.2 udgør en genotype for 1014 th codon af para-gen. Den første base er uforanderlig, så det ikke er inkluderet i assayet. Modtagelige homozygote genotyper er markeret med blåt. Den mest modstandsdygtige L1014F homozygot genotype er markeret med mørkeblåt. Gul farve indikerer heterozygot. Den L1014 S, intermediært resistent genotype, vises i orange.
Tabel 6. SNP genotyper for P. falciparum og P. vivax ong>. I alt 6 SNPs anvendes til at bestemme tilstedeværelsen af malariaparasitten. PL-0041, PL-1269 og PL-1549 indeholder P. falciparum specifikke alleler (G, T og T henholdsvis). Samtidig amplifikation af de tre alleler indikerer tilstedeværelsen af relativt intakt P. falciparum DNA i prøve-DNA. Forstærkning af alternative alleler (A til PL-0041 og PL-1269) indikerer tilstedeværelsen af andre Plasmodium arter (fx P. vivax, P. ovale eller P. malariae) i prøven. Pf-1549 ligger i områder med mange flere P. falciparum specifik flankerende regioner således denne SNP kun forstærket, når P. falciparum er til stede. PL-0071, PL-1245 og PL-0157 indeholder P. vivax specifikke alleler (G, G og T henholdsvis). Forstærkning af alternative alleler (A, A og C) indikerer tilstedeværelsen af andre Plasmodium DNA i prøven. Uinficerede myg vil ikke have nogen forstærkning på alle 6 markører. 
Tabel 7. SNP genotyper for 7 værter:. Menneske, kylling, ko, hund, ged, svin og får "NC" står for "Ingen opkald" (ingen forstærkning) i følgende tabel. Bemærk, at nogle ikke-specifik forstærkning kan forekomme på nogle loci, men ikke for alle de SNP'erne af en bestemt vært. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MDA er sammensat af fem store trin: PCR-amplifikation, rejer alkalisk phosphatase (SAP) reaktion, SNP udvidelse, udvidelse produkt condition, og matrix-assisteret laser desorption / ionisering - tid søgning (MALDI-TOF) massespektrometri 33-37. Det første PCR-amplifikation skridt forstærker DNA flankerer hver SNP så nok template DNA vil være tilgængelig på SNP udvidelse trin. SAP reaktion neutraliserer ubrugte dNTP'er, der kan interferere med den følgende SNP udvidelse trin. SNP udvidelse indebærer en enkelt udvidelse primer pr SNP locus og masse-modificerede terminator nukleotider. 3'-enden modificerede nukleotider forhindrer efterfølgende nukleotider i at blive indarbejdet i forlængelse primer. Således massen af enkelt base indikerer genotypen af det tilsvarende SNP.
Det mest kritiske skridt i at sikre succesen af denne tilgang er at have en god datasæt af eksisterende polymorfier i målorganismers. Vi brugte godt karakteriserede SNPs for arter identifikation (N> 900) 10,12,38-40 og KDR (N> 1.000) 15,18. De artsspecifikke SNPs for Plasmodium blev identificeret fra sekvensopstilling af cytochrom b-sekvenserne af 123 P. falciparum, 97 P. vivax, 11 s malariae og 18 s ovale isolere sekvenser fra Afrika, som var tilgængelige på Genbank. Cytochrom bs sekvenser fra 7 værtsart (menneskelige, kylling, ko, hund, ged, svin og får) blev indsamlet fra Genbank for host-specifikke SNP identifikation. Baseret på denne store mængde sekvensdata, kunne vi designe en robust diagnostisk assay ved anvendelse af et assay designer software.
Antallet af markører hver reaktion kan rumme bestemmes af den biokemiske forenelighed primerblanding givet en tolerance til primer dimer potentiale (0,9 0-1 skala). Forfattere bruges standardværdien (1; mest strenge) for forkerte priming potentiale. Relaxation af denne parameter kan potentielt øge antallet af SNP'er, som kan analyseres i en enkelt reaktion foruden SNPs inkluderet i denne undersøgelse.
PCR-amplifikationen trin er robust og typisk ikke kræve justering fra den oprindelige assay design. The SNP udvidelse mix (tabel 3), men muligvis ændringer i relative mængde af hver primer under anvendelse af massespektrometri til at sikre et tilstrækkeligt signal-støj-forhold er opnået for hver primer. Den SNP udvidelse primer opskrift er resultatet af disse justeringer. Kompatibilitet mellem extension primere kan begrænse det samlede antal SNP'er, der kan være multiplex i en enkelt reaktion. Da reaktionen volumen er lille (5-8 pi), skal være ordentligt forseglet for at hindre fordampning under amplifikationstrinnene prøvepladen.
Denne platform kan samtidig score op til 35 SNPs per reaktion, mens andre SNP genotype platforme kan accommodate over tusind SNPs per reaktion 41. Med fremskridt inden genomsekvensering teknologi, kan man erhverve millioner af SNPs hjælp af næste generation sekventering 29,42,43. Men teknikken anvendes her en ideel ansøgning om undersøgelser, der kræver genotypebestemmelse et relativt lille antal markører for mange (100s-1.000 s) individer. Yderligere diskussion af design begrænsninger i forskellige SNP genotypning platform er dækket i tidligere undersøgelser 41.
MDA er rettet mod at karakterisere epidemiologisk vigtige træk af malaria vektorer og giver en ideel protokol for mellemlange throughput SNP genotype analyser analysere tusindvis af myg indsamlet fra naturlige populationer. MDA præsenteres her giver (1) over en reduktion i arbejdstid 90%, (2) en reduktion på 60% i reagensomkostninger, og (3) reduktion i falske positive / negative ved at bruge flere markører. Den foreslåede assay kan forbedre epidemiologiske undersøgelser afi høj grad lette dataindsamlingen. Det kan også forbedre genom-dækkende associationsstudier ved karakterisere myg prøver med hensyn til befolkning oprindelse, insekticidresistens, parasit følsomhed og vært valg. Endelig kan denne MDA give inspiration og en skabelon til at designe andre multipleks analyser ved hjælp af en MALDI-TOF baseret SNP genotypning platform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Drs. Anthony Cornel og Laura Norris på UC Davis og Dr. Katharina Kreppel ved University of Glasgow for at give myg prøver fra Tanzania. Vi takker Ms Smita Das og Dr. Douglas Norris fra Johns Hopkins School of Public Health til deling myg prøver fra Zambia. Vi takker også Mr. Lee V. Millon på Veterinary Genetics Laboratory til uddannelse på assay design. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health indrømme R01AI 078.183 og R21AI062929.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
References
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
- Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
- Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
- Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
- Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
- Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
- White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
- Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
- Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
- Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
- Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
- Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
- Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
- Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
- Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
- Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
- Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
- Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
- Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
- Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
- Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
- Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
- Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
- Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
- Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
- Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
- Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
- Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
- Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
- Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
- Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
- Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
- Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
- Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
- Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
- Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).
