Abstract
De Anopheles gambiae soorten complex omvat de grootste malaria overbrengen van muggen in Afrika. Omdat deze soorten zijn van dergelijke medische belang, zijn verschillende karaktertrekken typisch gekenmerkt met behulp van moleculaire tests om te helpen bij epidemiologische studies. Deze eigenschappen zijn onder andere species identificatie, resistentie tegen insecticiden, parasitaire infectie-status, en gastheer voorkeur. Aangezien populaties van Anopheles gambiae complex morfologisch niet te onderscheiden, wordt een polymerase kettingreactie (PCR) traditioneel gebruikt om soorten te identificeren. Als de soort bekend is, worden meerdere downstream assays routinematig uitgevoerd om verdere kenmerken helderen. Zo mutaties bekend als KDR in een para-gen verlenen resistentie tegen DDT en pyrethroïde insecticiden. Daarnaast enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) of Plasmodium parasiet DNA detectie PCR assays worden gebruikt om parasieten in muggen weefsels te detecteren. Tot slot, een gecombinen PCR en restrictie-enzym digesties worden gebruikt om gastheer voorkeur (bijvoorbeeld humane versus dierlijke bloed) door screening van de mug bloedmeel voor host-specifieke DNA helderen. We hebben een multi-detectietest (MDA) dat alle voornoemde assays tegelijk combineren in één multiplex reactie genotypering 33SNPs 96 of 384 monsters ontwikkeld. Omdat de MDA bevat meerdere markers voor soorten, Plasmodium detectie, en gastheer bloed identificatie, wordt de kans op het genereren van valse positieven of negatieven sterk verminderd uit eerdere testen die slechts één marker per kenmerk bevatten. Deze robuuste en eenvoudige test kan deze belangrijke mug karaktertrekken kosten-effectief en in een fractie van de tijd van de bestaande tests detecteren.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii en Anopheles gambiae zijn de belangrijkste vectoren die verantwoordelijk is voor de overdracht van malaria in Afrika 1. Deze drie soorten zijn morfologisch onderscheiden 2 en kan slechts worden verkregen door moleculaire assays 3-9. Daarnaast zijn er vele stroomafwaarts assays routinematig uitgevoerd epidemiologische en populatiegenetica studies steun. Deze omvatten (1) een genotyperingstest voor speciatie eilanden 10-12, (2) een genotyperingstest erkenning van niet-synoniem SNPs in de 1014 ste aminozuur codon positie para-gen (de weerstand knock-down of KDR, SNP) 13 -18, (3) parasiet detectie PCR 19-23, en (4) het screenen op gastheer-specifieke DNA in muggen midguts 24,25.
We ontwikkelden een multi-detectietest (MDA) dat al deze assays in één multiplex reactie met het doel van een gecombineerdalyzing vanuit epidemiologisch oogpunt belangrijke kenmerken van malaria vectoren in Afrika. De MDA assay bevat meerdere merkers voor het detecteren (1) species (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii of andere (geen van de drie)), (2) insecticide resistentie vertegenwoordigd KDR SNPs (zowel L1014F en L1014S) (3) de aanwezigheid van twee belangrijke malaria parasieten Plasmodium falciparum en P. vivax, en (4) het bloed bron van de ene aviaire en zes zoogdiergastheren.
Traditioneel werden deze testen uitgevoerd in afzonderlijke polymerase kettingreacties. Wanneer deze testen worden uitgevoerd met een conventionele PCR platform, vereist het uitvoeren 8-10 PCR reactie assays en bijbehorende gelelektroforese stappen. Elke individuele PCR-reactie van voorbereiding tot het documenteren van de resultaten neemt 4-5 uur, terwijl de MDA hier gepresenteerde methode duurt ongeveer 5 uur in totaliteit. Dit komt overeen met een 90% besparing op arbeidskosten alleen. De MDA gepresenteerde hier kost $ 5per monster om alle 33 SNPs genotype. Dit is aanzienlijk goedkoper dan de single agarose gel gebaseerde testen die ongeveer $ 1,50 per monster kost. Assays detecteren alle kenmerken die onder de MDA zou minimaal 8-10 afzonderlijke agarose gel gebaseerde assays vereisen ten koste van $ 12-15 per monster. Bovendien, de MDA vermindert de kans op het genereren van een vals positief of negatief door gebruik ten minste drie markeringen per parasiet of hostbron detectie.
Het platform we gebruik is niet beperkt tot malariavectoren maar kunnen worden gebruikt in uiteenlopende toepassingen zoals geneeskunde, diergeneeskunde en de biologie 26-28. Diepgaande associatiestudies of populatiegenetica studies met een grote (in volgorde van 100s) aantal monsters vereisen kosteneffectieve screening assays voor meerdere markers simultaan. De meeste studies die twee of meer afzonderlijke PCR assays kunnen de MDA inrichting voor snellere resultaten tegen lagere kosten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCR amplificatie
- Meng alle PCR-primers (zie aanvullende tabel S1) in 1,5 ml microbuisjes. Elke SNP heeft twee primers (voorwaarts en achterwaarts). Zorg ervoor dat de voorraad concentratie van elke PCR-primer bij 100 uM wordt gehouden. Maak genoeg primer mix voor 500-1.000 reacties op pipetteren fouten en tijd op de bank te verminderen (zie aanvullende tabel S2). Desgewenst aliquots per 100-200 reacties per buisje en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid PCR cocktail zoals beschreven in protocol van de fabrikant (Tabel 1). Het volume voor 96 reacties omvat een overhang van 20%. Vortex de buis met de PCR cocktail licht en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 2000 x g.
- Verdeel 3 ui van de PCR cocktail in elk putje van een niet-begrenste plaat met 96 putjes. Een repeater pipet kan tijd besparen voor dit proces.
- Voeg 2 pl van de geschikte genomisch DNA muggen in elk putje.
OPMERKING: Proces verkrijgen genomisch DNA van m osquito weefsels (hoofd / thorax, buik of het gehele lichaam) wordt beschreven in andere literaturen 29-32. Kies een geschikte DNA-extractie protocol die met Plasmodium in het bloed (abdomen) van besmettelijk muggen differentiëren (Plasmodium in het hoofd / thorax). Wij gebruiken meestal de DNA geëxtraheerd uit lichaamsdelen (hoofd / thorax of abdomen) muggen, dus DNA-concentratie varieert van 0.05-2ng / ul. Hoewel het totale DNA input lager dan aanbevelingen van de fabrikant (5-10ng / rxn), we meestal krijgen robuust SNP oproepen van 98% van de DNA-monsters zonder gehele genoom amplificatie. - Verzegeling van de plaat, meng of vortex, en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 370 x g.
- Gebruik de volgende thermocycler protocol uitvoeren PCR-amplificatie: (1) 94 ° C gedurende 2 min, (2) 94 ° C gedurende 30 sec, (3) 56 ° C gedurende 30 sec, (4) 72 ° C gedurende 1 min (5) herhaal de stappen (2) - (4) gedurende 45 cycli (6) 72 ° C gedurende 1 min en 4 ° C hold.
- Bereid de SAP enzymoplossing in een plaat met 96 putjes (zie tabel 2). Verwerk 96 monsters in een plaat. Het volume voor 96 reacties omvat een overhang van 20%.
- Vortex de buis SAP enzymoplossing licht en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 2000 x g. Verdeel 2 pl van het SAP enzym oplossing in elk putje. Ook kan een repeater pipet tijd besparen voor dit proces.
- Verzegeling van de plaat, meng of vortex, en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 370 x g. Incubeer de plaat als volgt: (1) 37 ° C gedurende 40 min, (2) 85 ° C gedurende 5 minuten om het enzym te inactiveren, (3) 4 ° C hold. Na afronding van deze stap, slaan de plaat bij -20 ° C voordat u verder gaat. Verwerk de opgeslagen plaat binnen 2 weken.
3. SNP Extension
- Als het monster plaat na SAP behandeling is bevroren, laat het ontdooien om RT voordat u verder gaat.
- Bereid de extensie primer mix (Aanvullende Tabel S2). Elke SNP heeft een extension primer. Houd de voorraad concentratie van elke verlengingsprimer bij 500 uM. Eventueel aliquot van 100-200 reacties per buisje en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid verlenging mix zoals beschreven in Tabel 3. 96 reactievolume omvat een overhang van 20%.
- Vortex de buis uitbreiding cocktail licht en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 2000 x g. Doseer 2 pl van de uitbreiding cocktail in elk putje. Ook kan een repeater pipet tijd besparen voor dit proces.
- Verzegeling van de plaat, meng of vortex, en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 370 x g. Thermocyclus de plaat zoals weergegeven in figuur 1. Op dit punt verder naar massaspectrometrie of bewaar de plaat bij -20 ° C tot 2 weken.
4. Conditioning de SNP verlengingproduct aan massaspectrometrie Analyse Optimaliseer
- Als het monster plaat na SNP extensie is bevroren, laat het ontdooien om RT voordat u verder gaat.
- Transfer 15mg van hars van de contaIner op het kuiltje plaat met behulp van een langgerekte lepel. Gebruik de schraper om hars in de putjes van de plaat kuiltje verspreiden. Vegen de schraper van links naar rechts over het kuiltje plaat om de hars te verspreiden. Zorg ervoor dat er hars in elk putje.
- Schraap overtollige hars uit het kuiltje plaat met behulp van de schraper. Laat de hars staan in het kuiltje plaat gedurende tenminste 20 minuten. Terwijl het laten van de hars staan in het kuiltje plaat, voeg 41 ul van HPLC-kwaliteit water aan elk putje van het monster plaat.
- Plaats voorzichtig het monster plaat ondersteboven, op het kuiltje plaat. Zorg ervoor dat het monster plaat teruggezet tegen de kleine afgeronde post van het kuiltje plaat, die de putten uitgelijnd in het monster plaat met de putten in het kuiltje plaat.
- Houden van het monster plaat en het kuiltje plaat bij elkaar, voorzichtig omdraaien hen over, zodat de hars valt uit het kuiltje plaat in de putjes van het monster plaat. Tik op het kuiltje plaat zodat de hars valt uit in het monster plaat. Zorg ervoor dat al het hars in de dimple plaat valt uit in het monster putjes. Centrifugeer de plaat bij 3200 xg gedurende 30 sec.
- Draai de monsterplaat op een rotator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Rotator moet het monster plaat draaien 360 ° over de lange as.
- Centrifugeer het monster plaat bij 3200 xg gedurende 5 min. Na deze stap, slaan het monster plaat bij -20 ° C tot 2 weken voordat u verder gaat met de volgende stap.
5. MALDI-TOF-massaspectrometrie
- Breng de geconditioneerde SNP verlengingsproduct op een bioarray zoals SpectroCHIP volgens instructies van de fabrikant. Wij gebruiken MassArray Nanodispenser voor deze stap.
- Nadat de overdracht is voltooid, definiëren hoe assays en platen worden ingesteld in de assay database. De naam van de test en platen zodanig dat elke plaat heeft unieke identifier die links naar specifieke test design (Aanvullende Tabel S3).
- Na analyse en plaat gedefinieerd verkrijgen spectra met een massaspectrometer.
- Voeren data-analyse met behulp van een real-time PCR-analyse data interpretatie software zoals typer Analyzer of TyperViewer (Sequenom). Verkrijgen van gegevens in XML-formaat dat de steekproef layout, massa spectrogram voor elk putje bevat, de marker gegevens zoals naam, verwachte massa voor elke variant van de desbetreffende SNP, en eventuele fouten of waarschuwingen in verband met elke reactie. Zie figuur 2 voor de resulterende massa spectrogram.
- Voer SNP genotype clustering analyse door de detectiedrempel (magnitude of signaal-ruisverhouding) en tolerantie / variantie toegestaan voor elk genotype. Figuur 3 toont een voorbeeld van een 04707-KDR # 2 SNP genotype clusters.
- De resulterende SNP genotype gesprekken in een spreadsheet programma te exporteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identificatie van soorten:
De volgende 5 SNPs elkaar onderscheiden drie soorten (A. arabiensis, A. coluzzii en A. gambiae) (tabel 4). Als een monster is niet een van de drie soorten, de drie SNPs (01073-213, 04.679-157 en 10313 -052) niet te versterken.
KDR genotype voor het afleiden van resistentie tegen insecticiden:
De 1014 ste codon van de para voltage-gated natrium kanaal komt overeen met KDR. Twee SNPs op de 2 e en 3 e voet van de 1014 ste codon bepalen de drie mogelijke aminozuren. . De mogelijke combinaties van de genotypen zijn vermeld in Tabel 5 Deze SNP werkt voor drie soorten van de Afrikaanse malariavectoren: A. arabiensis, A. coluzzii en A. gambiae. Deze SNPs niet versterken in A. darlingi, een Braziliaanse malaria vector. Dit is nietverwonderlijk gezien het feit dat mitochondriaal genoom sequentie-overeenkomst tussen A. darlingi en A. gambiae is slechts 88,9% terwijl het mitochondriaal genoom sequentie-overeenkomst tussen de drie Afrikaanse malariavectoren zijn meer dan 98%. Andere soorten zijn niet getest. We waren succesvol in versterking van monsters in Mali, Kameroen, Tanzania en Zambia verzameld.
Plasmodium detectie:
Als intact Plasmodium DNA aanwezig in de mug weefsel is, verwachten we op te sporen P. falciparum of P. vivax specifieke DNA tussen de DNA monster geëxtraheerd uit de mug. De soort specifieke SNPs werden geïdentificeerd uit sequentieoplijning van het cytochroom b opeenvolging van 123 P. falciparum, 97, blz vivax, 11 blz malariae en 18 P. ovale isoleren sequenties uit Afrika op Genbank. We ontwierpen 6 SNPs die uniek SNP genotypen produceren P. onderscheiden falciparum of P. vi vax van andere Plasmodium soorten (Tabel 6). We hebben deze test op mosquito monsters in Mali, Kameroen, Tanzania, Zambia en Brazilië verzameld getest en bevestigd dat deze specifieke set van markers werkt onafhankelijk van muggensoorten.
Bloedmeel detectie PCR:
Cytochroom b sequenties uit 7 gastheerspecies (mens, kip, koe, hond, geit, varkens en schapen) werden verzameld van Genbank en consensus sequenties werden gegenereerd. SNPs informatief voor elke host werden vervolgens geselecteerd voor genotypering. We testten het bloed bronnen uit 7 dieren (Tabel 7).
Omdat PCR-fragmenten zijn kort (80-120 bp), dit werkt op een iets afgebroken DNA of gedeeltelijk verteerd bloodmeals van mosquito weefsel. De kans op vals-positieve gesprekken wordt sterk verminderd door het hebben van meerdere markers per soort gastheer.
s ">
Figuur 1. Thermocycler programma voor SNP extensie stap. De versterking cyclus is totaal van 200 (5x40).
Figuur 2. Mass-spectrogram voor de MDA. De X-as is de massa (DA) van SNP uitbreiding producten en de Y-as is het signaal intensiteit. De rode lijnen geven de verwachte massa van Niet opgenomen Uitbreiding primer, SNP allel 1 en allel 2 voor de geselecteerde marker. Grijze lijnen duiden verwachte massa van andere markers in het MDA. Dit perceel is gegenereerd op basis van data-analyse software (typer Analyzer of typer Viewer) van de uitgang databestand na Stap 5. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
e = "always"> 
Figuur 3. Individuele SNP genotype cluster view De X-as is de arctangens waarde (aangeduid als "Angle") van het signaal intensiteiten van SNP allel 1 en SNP allel 2. De Y-as is de grootte van genotype oproepsignaal. Dit perceel is voorzien in de data-analyse software (typer Analyzer of typer Viewer). Een bepaalde gegevens kunnen worden geselecteerd met een klik van de muis en de geselecteerde sample data wordt aangegeven door cirkel. Clustering analyse die in de software clusters genotypes met een door de gebruiker gedefinieerde variantie drempel en automatisch kleuren drie genotypen van een biallelisch SNP. Hier getoonde voorbeeld geeft homozygote T (TT) personen als blauwe driehoeken, heterozygoot (TA) als groene pleinen en homozygote A (AA) individuen als oranje omgekeerde driehoeken. Rode cirkels vertegenwoordigen Geen gesprek (geen versterking).t = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Reagens | Concentratie in 5 pi | Volume | Volume |
| (1 rxn) | (96 rxns) | ||
| Water (HPLC-kwaliteit) | NA | 0,8 pl | 92,2 pi |
| 10x PCR buffer met 20 mM MgCl2 | 1x (2 mM MgCl2) | 0,5 pl | 57,6 pi |
| MgCl2 (25 mM) ** | 2 mM | 0,4 pl | 46,1 pi |
| dNTP mix (25 mM elk) *** | 500 uM | 0,1 pl | 11.5 pi |
| Primer mix (500 nM elk) | 100 nM | 1,0 III 115,2 pi | |
| PCR Enzyme (5 U / pl) | 1.0 U / rxn | 0,2 pl | 23,0 pi |
| Totaal Volume: | 3,0 pl | 345,6 pi |
Tabel 1. Multiplex PCR cocktail recept. De omvang van elk reagens voor de PCR uitrekstap één reactie en 96 reacties met een 20% overhang.
| Reagens | Volume (1 rxn) | Volume (96 rxn) |
| Water (HPLC-kwaliteit) | 1.53 pi | 176,3 pi |
| SAP Buffer (10x) | 0,17 pi | 19,6 pi |
| SAP enzym (1,7 U / pl) | 0,30 pi | 34,6 pi | 2,00 pi | 230,4 pi |
Tabel 2. SAP enzymoplossing. De omvang van elk reagens voor de garnalen alkalische fosfatase behandeling van een reactiemengsel en 96 reacties met een 20% overhang.
| Reagens | Conc. In 9 pl | Volume (1rxn) | Volume (96 rxns) |
| Water (HPLC-kwaliteit) | NA | 0,6190 ul | 71,3 pi |
| Iplex Buffer Plus (10x) | 0.222x | 0,2000 ul | 23,0 pi |
| Iplex Beëindiging mix | 1x | 0,2000 ul | 23,0 pi |
| Extension Primer mix | 0,9400 ul | 108.3 ui | |
| Iplex enzym | 1x | 0,0410 ul | 4.7 ul |
| Totaal Volume | 2.0000 pl | 230,4 pi |
Tabel 3. SNP Extension cocktail De omvang van elk reagens voor de SNP uitrekstap één reactie en 96 reacties met een 20% overhang.
Tabel 4. SNP genotypen voor elke soort. 28S IGS-540, 28S IGS-649 en 01073-213 zijn op het X chromosoom, 04679-157 ligt op chromosoom 2 en 10313-052 is op chromosoom 3. Hybride genotype (heterozygoot) wordt geel gemarkeerd. Vaste variant A. coluzzii is gemarkeerd in lichtblauw en vaste variant A. gambiae is gemarkeerd in het donkerblauw.
Tabel 5. SNP genotypen voor KDR. Twee SNPs KDR # 1 en KDR # 2 vormen een genotype voor de 1014 ste codon van para-gen. De eerste basis is onveranderlijk dus niet bij de test. Gevoelig homozygote genotypen zijn blauw gemarkeerd. De meest resistente L1014F homozygote genotype is gemarkeerd in donkerblauw. Gele kleur geeft heterozygoot. De L1014 S, matig resistent genotype, wordt weergegeven in oranje.
Tabel 6. SNP genotypen voor P. falciparum en P. vivax ong>. Totaal 6 SNPs worden gebruikt om de aanwezigheid van de malariaparasiet bepalen. Pl-0041, Pl-1269 en Pl-1549 bevatten P. falciparum specifieke allelen (G, T en T respectievelijk). Gelijktijdige amplificatie van de drie allelen aangeeft aanwezigheid van relatief intact P. falciparum DNA in DNA-monster. Amplificatie van alternatieve allelen (A voor Pl-0041 en Pl-1269) geeft aanwezigheid van andere Plasmodium soorten (bijvoorbeeld P. vivax, P. ovale of P. malariae) in het monster. Pf-1549 is gelegen in regio's met veel meer P. falciparum specifieke flankerende gebieden waardoor deze SNP wordt alleen versterkt wanneer P. falciparum is aanwezig. Pl-0071, Pl-1245 en Pl-0157 bevatten P. vivax specifieke allelen (G, G en T respectievelijk). Amplificatie van alternatieve allelen (A, respectievelijk A en C) geeft aanwezigheid van andere Plasmodium DNA in het monster. Niet-geïnfecteerde muggen zullen geen versterking op alle 6 markers hebben. 
Tabel 7. SNP genotypen voor 7 hosts:. Mens, kip, koe, hond, geit, varkens en schapen "NC" staat voor "No Call" (zonder versterking) in de volgende tabel. Merk op dat sommige niet-specifieke amplificatie kan op sommige loci, maar niet voor alle SNPs van een bepaalde host. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De MDA bestaat uit vijf belangrijke stappen: PCR-amplificatie, garnaal alkalisch fosfatase (SAP) reactie, SNP uitbreiding, uitbreiding productconditionering en matrix-assisted laser desorptie / ionisatie - time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie 33-37. De eerste PCR-amplificatie stap versterkt DNA flankerende elke SNP zodat er voldoende template DNA beschikbaar zullen zijn bij de SNP extensie stap. De SAP reactie neutraliseert ongebruikte dNTPs die kunnen interfereren met de volgende SNP extensie stap. SNP uitbreiding gaat om een eenmalige verlenging primer per SNP locus en massa-gemodificeerde terminator nucleotiden. Het 3'-uiteinde gemodificeerde nucleotiden voorkomen in opeenvolgende nucleotiden van de primer extensie worden opgenomen. Dus de massa van de enkele base geeft het genotype van het corresponderende SNP.
De meest kritische stap voor het welslagen van deze aanpak is het hebben van een goede dataset van bestaande polymorfismen in doelorganismes. We gebruikten goed gekarakteriseerde SNPs voor identificatie soorten (N> 900) 10,12,38-40 en KDR (N> 1000) 15,18. De soort specifieke SNPs voor Plasmodium werden geïdentificeerd uit sequentieoplijning van het cytochroom b sequenties van 123 P. falciparum, 97, blz vivax, 11 blz malariae en 18 P. ovale isoleren sequenties van Afrika dat op Genbank beschikbaar zijn. Cytochroom b sequenties uit 7 gastheerspecies (mens, kip, koe, hond, geit, varkens en schapen) werden verzameld van Genbank voor host-specifieke SNP identificatie. Op basis van deze grote hoeveelheid sequentiegegevens, konden we een robuuste diagnostische assay gebruik van een test design software ontwerpen.
Het aantal markeringen elke reactie geschikt wordt bepaald door de biochemische compatibiliteit van de primer mix gegeven tolerantie dimeer potentieel (0.9 0-1 schaal) primer. Auteurs gebruikt de standaard waarde (1; meest strenge) voor valse priming potentieel. Relaxation van deze parameter kan mogelijk verhogen het aantal SNPs die kunnen worden getest in een enkele reactie naast de SNPs in dit onderzoek.
De PCR-amplificatie stappen zijn robuust en hebben meestal geen aanpassing van de initiële test ontwerp vereisen. De SNP extensie mengsel (tabel 3) kan echter modificatie relatieve hoeveelheid van elke primer met massaspectrometrie zou een voldoende signaal-ruisverhouding wordt bereikt voor elke primer waarborgen. De verstrekte SNP verlengingsprimer recept is het resultaat van deze aanpassingen. Verenigbaarheid tussen verlenging primers het totale aantal SNPs die multiplex kan in een enkele reactie te beperken. Aangezien het reactievolume klein (5-8 gl), de monsterplaat moet goed worden afgedicht om verdamping gedurende de amplificatie stappen voorkomen.
Dit platform kan gelijktijdig scoren tot 35 SNPs per reactie, terwijl andere SNP genotypering platforms kan accommodate meer dan duizend SNPs per reactie 41. Met de vooruitgang in het genoom sequencing technologie, kan men miljoenen SNPs gebruik van next-generation sequencing 29,42,43 verwerven. De hier gebruikte techniek is een ideale applicatie voor studies die vereisen genotyperen van een relatief klein aantal markers voor veel (100s-1.000 s) individuen. Aanvullende bespreking van het ontwerp beperkingen van verschillende SNP genotypering platform wordt behandeld in eerdere studies 41.
De MDA is gericht op het karakteriseren vanuit epidemiologisch oogpunt belangrijke eigenschappen van malaria vectoren en biedt een ideale protocol voor medium-throughput SNP genotypering assays analyseren van duizenden muggen verzameld van natuurlijke populaties. De MDA hier gepresenteerde biedt (1) over een vermindering van 90% in werktijd, (2) een 60% reductie in reagens kosten, en (3) vermindering van valse positieven / negatieven door gebruik te maken van meerdere markers. De voorgestelde test kan epidemiologische studies van verbeterenhet verzamelen van gegevens aanzienlijk vergemakkelijken. Ook kan het genoomwijde associatie studies te verbeteren door het karakteriseren van de mug monsters met betrekking tot de bevolking oorsprong, resistentie tegen insecticiden, parasiet gevoeligheid en gastheer keuze. Tenslotte kan dit MDA inspiratie en een sjabloon voor het ontwerpen van andere multiplex assays met een MALDI-TOF gebaseerde SNP genotypering platform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Anthony Cornel en Laura Norris aan UC Davis en Dr. Katharina Kreppel aan de Universiteit van Glasgow voor het verstrekken van mosquito exemplaren uit Tanzania. Wij danken mevrouw Smita Das en Dr. Douglas Norris van de Johns Hopkins School of Public Health voor het delen van mosquito monsters uit Zambia. We danken ook de heer Lee V. Millon bij het Veterinary Genetics Laboratory voor het trainen op assay ontwerp. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen R01AI 078.183 en R21AI062929.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
References
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
- Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
- Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
- Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
- Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
- Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
- White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
- Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
- Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
- Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
- Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
- Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
- Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
- Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
- Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
- Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
- Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
- Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
- Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
- Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
- Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
- Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
- Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
- Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
- Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
- Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
- Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
- Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
- Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
- Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
- Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
- Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
- Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
- Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
- Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
- Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).
