Abstract
Комплекс Anopheles gambiae видов включает в себя основную малярии комарами в Африке. Поскольку эти виды такого медицинское значение, несколько черт, как правило, характеризуется использованием молекулярных анализов, чтобы помочь в эпидемиологических исследованиях. Эти черты включают определение видов, стойкости к инсектицидам, состояние паразитарная инфекция, и предпочтение хозяина. Поскольку население комплекса Anopheles gambiae морфологически неразличимы, полимеразная цепная реакция (ПЦР) традиционно используются для идентификации видов. После того, как вид известен, регулярно проводится несколько ниже по течению анализы, чтобы выяснить дальнейшие характеристики. Например, мутации, известные как KDR в гене пара придает устойчивость к ДДТ и пиретроидов инсектицидов. Кроме того, фермент-иммуноферментный анализ (ИФА) или Plasmodium паразита обнаружения ДНК ПЦР используются для обнаружения паразитов, присутствующих в тканях комаров. Наконец, combinatioп ПЦР и рестриктаз дайджесты могут быть использованы для выяснения предпочтений хозяина (например, человеческая против крови животных) путем скрининга комаров bloodmeal для принимающей конкретных ДНК. Мы разработали анализ с несколькими обнаружения (MDA), который сочетает в себе все вышеперечисленные анализы в единый мультиплекс реакция генотипирования 33SNPs для 96 или 384 образцов одновременно. Потому что MDA включает в себя несколько маркеров для видов, выявление Plasmodium и принимающей идентификации крови, вероятность генерации ложных срабатываний или негативов значительно снижается по сравнению с предыдущими анализами, которые включают только один маркер за чертой. Этот надежный и простой анализ может обнаружить эти ключевые комаров черты экономически эффективно и в доли время существующие анализов.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii и Anopheles gambiae являются основными векторами, ответственные за передачу малярии в Африке 1. Эти три вида морфологически неотличимы 2 и может быть выделен только молекулярного анализа 3-9. Кроме того, есть много вниз по течению анализы регулярно проводимые чтобы помочь эпидемиологические и популяционные генетики исследований. Они включают в себя (1) определяют генотип анализ для видообразования островов 10-12 (2) генотипирование анализа признания, не синонимичные ОНП в 1014-м аминокислоты кодона положение гена пара (сопротивление нокдаун, или KDR, SNP) 13 -18 (3) обнаружения паразита ПЦР 19-23, и (4) Скрининг на хост-специфической ДНК в популяции комаров midguts 24,25.
Мы разработали анализ с несколькими обнаружения (MDA), который сочетает в себе все эти анализы в одном мультиплексной реакции с цельюalyzing эпидемиологически важных характеристик переносчиками малярии в Африке. MDA анализ включает в себя несколько маркеров для выявления (1) видов (A. arabiensis, А. gambiae, А. coluzzii, или другая информация (ни один из трех)), (2) устойчивости к инсектицидам, представленных в КДР ОНП (как L1014F и L1014S) (3) Наличие двух крупных малярийных паразитов, Plasmodium тропической и П. трехдневной, и (4) Источник крови одного птичьего гриппа и шесть хозяев млекопитающих.
Традиционно эти анализы были проведены в отдельных полимеразной цепной реакции. Когда все эти анализы сделаны с использованием обычной платформы ПЦР, что требует проведения реакции ПЦР 8-10 анализов и сопровождающих гель электрофореза шаги. Каждый человек ПЦР от подготовки к документированию результатов занимает 4-5 ч, в то время как метод MDA, представленные здесь занимает около 5 ч в совокупности. Это эквивалентно 90% экономии затрат на оплату труда в одиночку. MDA, представленные здесь стоит $ 5по образцу генотип все 33 ОНП. Это значительно дешевле, чем одиночных геля агарозы на основе анализа, который стоит около $ 1,50 за образец. Анализы выявления всех особенностей, охватываемые MDA потребует минимум 8-10 отдельных геля агарозы на основе анализов по цене $ 12-15 за образец. Кроме того, MDA значительно снижает вероятность получения ложно положительный или отрицательный, используя, по крайней мере три маркера для каждого паразита или источника Обнаружение хоста.
Платформа мы использовали не ограничивается переносчиков малярии, но может быть использован в широком спектре приложений, таких как медицине, ветеринарии, а также основной биологии 26-28. Углубленные исследования Ассоциации или популяционной генетики исследования с привлечением большого (в порядке 100s) число образцов требуют экономически эффективных анализов скрининга для одновременного нескольких маркеров. Большинство исследований, которые используют два или более отдельных ПЦР могли бы реализовать MDA для более быстрых результатов при меньших затратах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ПЦР-амплификация
- Смешайте все ПЦР-праймеров (см дополнительный таблице S1) в 1,5 мл микропробирок. Каждый SNP имеет два праймера (вперед и назад). Убедитесь, что концентрация запас каждого ПЦР-праймера выдерживают при 100 мкМ. Оставьте достаточно смесь праймеров для 500-1000 реакций, чтобы уменьшить пипетки ошибок и сокращает время на скамейке (см дополнительный Таблица S2). При желании приготовить аликвоты для 100-200 реакций в трубке и хранить при -20 ° С.
- Подготовка ПЦР коктейль, как описано в протоколе производителя (таблица 1). Объем для 96 реакций включает выступ 20%. Vortex пробирку, содержащую коктейль ПЦР легко и центрифуги в течение 30 сек при 2000 х г.
- Отказаться от 3 мкл коктейля ПЦР в каждую лунку не обогнул 96-луночного планшета. Пипетка ретранслятор может сэкономить время для этого процесса.
- Добавить 2 мкл соответствующей геномной ДНК комаров в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс получения геномной ДНК из м osquito ткани (головка / грудной клетки, живота или всего тела) описана в других литературах 29-32. Выберите соответствующий протокол экстракции ДНК, чтобы дифференцировать пациентов с Plasmodium в крови (брюшной полости) от инфекционных комаров (Plasmodium в голове / грудной клетки). Обычно мы используем ДНК, выделенной из частей тела (голова / грудной клетки или брюшной полости) москитов, так концентрацию ДНК варьирует от 0.05-2ng / мкл. Хотя общая потребляемая ДНК ниже, чем рекомендации производителя (5-10ng / Rxn), мы, как правило, получить надежный SNP звонки с 98% образцов ДНК без всей усиления генома. - Уплотнение пластину, осторожно перемешать и вихревые, и центрифуги в течение 1 мин при 370 х г.
- Используйте следующий протокол Термоциклер проводить ПЦР-амплификации: (1) 94 ° С в течение 2 мин, (2) 94 ° С в течение 30 сек, (3) 56 ° С в течение 30 сек, (4) 72 ° С в течение 1 мин , (5) Повторите шаг (2) - (4) в течение 45 циклов, (6) 72 ° С в течение 1 мин, и 4 ° C удержание.
- Подготовка СПД раствора фермента в 96-луночный планшет (таблица 2). Процесс 96 образцов в тарелку. Объем для 96 реакций включает выступ 20%.
- Vortex трубка раствора фермента SAP легко и центрифуги в течение 30 сек при 2000 х г. Отказаться от 2 мкл SAP ферментного раствора в каждую лунку. Опять же, пипетки ретранслятор может сэкономить время этого процесса.
- Уплотнение пластину, осторожно перемешать и вихревые, и центрифуги в течение 1 мин при 370 х г. Инкубируйте планшет следующим образом: (1) 37 ° С в течение 40 мин, (2) 85 ° C в течение 5 мин, чтобы инактивировать фермент, (3) 4 ° C удержания. По завершении этой стадии, хранить пластины при температуре -20 ° С, прежде чем продолжить. Обрабатывать сохраненные пластинку в пределах 2 недель.
3. SNP Расширение
- Если образец пластина заморожены после лечения SAP, позволяют ему оттаять до комнатной температуры, прежде чем продолжить.
- Подготовьте смесь удлинения праймера (Справочная таблица S2). Каждый SNP имеет один EXTEnsion грунт. Держите концентрацию акций каждого удлинения праймера на 500 мкм. При желании, аликвоту 100-200 реакций в трубке и хранить при -20 ° С.
- Подготовка расширение смеси, как описано в таблице 3. 96 объем реакционной смеси включает в себя выступ 20%.
- Vortex трубка расширения коктейль легко и центрифуги в течение 30 сек при 2000 х г. Отказаться от 2 мкл расширения коктейль в каждую лунку. Опять же, пипетки ретранслятор может сэкономить время этого процесса.
- Уплотнение пластину, осторожно перемешать и вихревые, и центрифуги в течение 1 мин при 370 х г. Термоцикла пластины, как показано на фиг.1. В этот момент приступить к масс-спектрометрии, или хранить пластины при температуре -20 ° С до 2 недель.
4. Кондиционер SNP расширения продукта для оптимизации анализа масс-спектрометрии
- Если образец пластина заморожена после расширения SNP, дайте ей оттаять до комнатной температуры, прежде чем продолжить.
- Трансфер 15 мг смолы из его КонтаИнер на углубления, пластину с использованием удлиненного ложку. Используйте скребок, чтобы распространить смолы в лунки углубления, пластины. Перемещайте скребок из стороны в сторону по ямочка пластины для распространения смолы. Убедитесь, что смола в каждую лунку.
- Очистите излишки смолы от лунки планшета с использованием скребка. Пусть смола стоять в углублении пластины, по крайней мере, 20 мин. В то время как позволяя смола стоять в углублении пластины, добавить 41 мкл воды ВЭЖХ в каждую лунку для образца пластины.
- Аккуратно поместите образец планшет вверх-вниз, на ямочка пластины. Убедитесь, что образец стекла сбрасывается против мелких округлых пост углубления, плиты, который совмещает скважин в образце пластины с скважин в углублении пластины.
- Проведение пробы пластину и углубления пластину вместе, аккуратно переверните их на так смола выпадает из лунки пластины в лунки для образца пластины. Нажмите углубления пластину так, смолы выпадает в образец пластины. Убедитесь, что все смолы в диmple пластина выпадает в образец планшета. Центрифуга пластины при 3200 х г в течение 30 сек.
- Поверните образец стекла на ротатор в течение 5 мин при комнатной температуре. Rotator должен вращаться образец стекла на 360 ° относительно продольной оси.
- Центрифуга образца пластину на 3200 мкг в течение 5 мин. После этого шага, хранить образец пластины при температуре -20 ° C до 2 недель, прежде чем перейти к следующему шагу.
5. MALDI-TOF масс-спектрометрии
- Передача кондиционером SNP продукт удлинения на bioarray таких как SpectroCHIP в соответствии с инструкциями изготовителя. Мы используем MassARRAY Nanodispenser для этого шага.
- После завершения передачи, определяют, как анализы и пластины должны быть установлены в базе данных для анализа. Имя проведением анализа и пластины таким образом, что каждая пластина имеет уникальный идентификатор, что ссылки на конкретные конструкции анализа (Справочная таблица S3).
- После анализа и пластины были определены, получают спектры с помощью масс-спектрометра.
- Выполнить анализ данных с помощью анализа в реальном времени ПЦР интерпретации данных программного обеспечения, таких как Typer Analyzer или TyperViewer (Sequenom). Получение данных в XML-формате, содержит разметку образца, масс-спектр для каждого хорошо, информация маркер в том числе имя, ожидаемая масса для каждого варианта соответствующего SNP, и любая ошибка или предупреждения, связанные с каждой реакции. На рисунке 2 в результате массового спектрограммы.
- Провести анализ SNP генотипа кластеризации, установив порог обнаружения (величины или сигнала к шуму) и толерантности / дисперсии позволило для каждого генотипа. Рисунок 3 показывает пример из 04707-KDR # 2 SNP генотипа кластеров.
- Экспорт в результате SNP генотипа вызовов в программе электронных таблиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Идентификация видов:
Следующие 5 ОНП вместе выделить три вида (А. arabiensis, А. coluzzii и А. gambiae) (таблица 4). Если образец не является одним из трех видов, три ОНП (01073-213, 04679-157 и 10313 -052) не усиливаются.
KDR генотип выведение резистентность к воздействию инсектицидов:
1014-й кодон пункт потенциалзависимыми натриевого канала соответствует KDR. Два ОНП на 2-й и 3-й базе 1014-го кодона определить три возможных аминокислот. . Возможные комбинации генотипов, перечислены в таблице 5 Этот SNP работает в течение трех видов африканских переносчиков малярии: А. arabiensis, А. coluzzii и А. gambiae. Эти ОНП не усиливать в А. darlingi, бразильский переносчиками малярии. Это неудивительно, учитывая, что сходство митохондрий последовательность генома между А. darlingi и А. gambiae только 88,9%, а сходство митохондрий последовательность генома среди трех африканских переносчиков малярии являются более 98%. Другие виды не были проверены. Нам удалось усиления из образцов, собранных в Мали, Камеруна, Танзании и Замбии.
Обнаружение Plasmodium:
Если нетронутыми Plasmodium ДНК присутствует в организме комара ткани, мы ожидаем обнаружить P. тропической или P. трехдневной специфической ДНК среди образцов ДНК, извлеченной из комара. Конкретные виды ОНП были определены из выравнивания последовательностей цитохрома б последовательности 123 P. тропической, 97 П. трехдневной, 11 П. malariae и 18 P. овального выделения последовательности из Африки доступно на Генбанку. Мы разработали 6 ОНП, которые производят уникальные генотипы SNP отличить P. тропической или P. VI VAX от других видов Plasmodium (Таблица 6). Мы протестировали этого анализа на образцах комаров, собранных в Мали, Камеруна, Танзании, Замбии и Бразилии, и подтвердил, что это определенный набор маркеров работает независимо от комаров вида.
Bloodmeal ПЦР обнаружения:
Цитохрома Ь последовательности из 7 видов хозяев (человек, курица, корова, собака, козы, свиньи и овцы) были собраны из Genbank и консенсусные последовательности были получены. ОНП информативные для каждого хозяина, то были выбраны для генотипирования. Мы проверили это с источниками крови от 7 различных животных (таблица 7).
Потому что ПЦР-фрагменты короткие (80-120 б.п.), это работает на несколько деградированных ДНК или на частично переваренные bloodmeals из москитной ткани. Вероятность ложных положительных звонков значительно снижается при наличии нескольких маркеров каждого типа узла.
с ">
Рисунок программа 1. Термоциклеры для SNP расширения шагу. Цикл усиление общей сложности 200 (5x40).
Рисунок 2. Массовая-спектрограммы для MDA. Ось Х масса (Да) из SNP продуктов удлинения и ось Y является интенсивность сигнала. Красные линии показывают ожидаемое массу ПБОЮЛ удлинения праймера, SNP аллелей 1 и аллель 2 для выбранного маркера. Серые линии показывают ожидаемая масса других маркеров в MDA. Этот участок формируется из программного обеспечения для анализа данных (типизатор анализатора или типизатор просмотра) из файла выходных данных после шага 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Е = "всегда"> 
Рисунок 3. Индивидуальный SNP генотипа кластер смотреть Ось Х арктангенс значение (помечены как "угол") интенсивностей сигнальных SNP аллеля 1 и SNP аллеля 2. ось Y является величина сигнала генотип вызова. Этот участок в программном обеспечении для анализа данных (типизатор анализатора или типизатор просмотра). Любые конкретные данные могут быть выбраны щелчком кнопки мыши и выбранные данные выборки обозначается круг. Кластерного анализа представлены в кластерах программного обеспечения генотипов с определенной пользователем дисперсии порога и автоматически цветов три генотипов биаллельной SNP. Пример показан здесь указывает гомозиготных T (TT) физических лиц, как синие треугольники, гетерозиготы (TA) в виде зеленых квадратов и гомозиготных (АА) физических лиц, как апельсин перевернутые треугольники. Красные круги представляют собой не вызов (без усиления).т = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Реагент | Концентрация в 5 мкл | Объем | Объем |
| (1 RXN) | (96 rxns) | ||
| Вода (ВЭЖХ) | Не Доступно | 0,8 мкл | 92,2 мкл |
| 10x ПЦР буфер 20 мМ MgCl2 | 1x (2 мМ MgCl2) | 0,5 мкл | 57,6 мкл |
| MgCl2 (25 мМ) ** | 2 мм | 0,4 мкл | 46,1 мкл |
| дНТФ смеси (25 мМ каждый) *** | 500 мкМ | 0,1 мкл | 11,5 мкл |
| Грунтовка смесь (500 нМ каждого) | 100 нМ | 1,0 мкл 115,2 мкл | |
| ПЦР фермент (5 ед / мкл) | 1,0 U / RXN | 0,2 мкл | 23,0 мкл |
| Общий объем: | 3,0 мкл | 345,6 мкл |
Таблица 1. множественной ПЦР коктейль Рецепт. Объем каждого реагента на стадии расширения ПЦР для одной реакции и реакции с 96 20% навеса.
| Реагент | Объем (1 RXN) | Объем (96 RXN) |
| Вода (ВЭЖХ) | 1,53 мкл | 176.3 мкл |
| SAP буфера (10x) | 0,17 мкл | 19,6 мкл |
| SAP фермента (1,7 U / мкл) | 0,30 мкл | 34,6 мкл | 2,00 мкл | 230,4 мкл |
Таблица раствор фермента 2. SAP. Объем каждого реагента для креветок щелочной фосфатазы лечения одной реакции и 96 реакций с 20% навеса.
| Реагент | Конц. В 9 мкл | Объем (1rxn) | Объем (96 rxns) |
| Вода (ВЭЖХ) | Не Доступно | 0,6190 мкл | 71,3 мкл |
| Iplex буфера Plus (10x) | 0.222x | 0,2000 мкл | 23,0 мкл |
| Iplex смесь Прекращение | 1x | 0,2000 мкл | 23,0 мкл |
| Удлинения праймера смесь | 0,9400 мкл | 108.3 мкл | |
| Iplex фермент | 1x | 0,0410 мкл | 4,7 мкл |
| Общий объем | 2,0000 мкл | 230,4 мкл |
Таблица 3. SNP расширение коктейль Объем каждого реагента на стадии расширения SNP для одной реакции и реакции с 96 20% навеса.
Таблица 4. SNP генотипов для каждого вида. 28S IGS-540, 28S IGS-649 и 01073-213 расположены на Х-хромосоме, 04679-157 на хромосоме 2, а 10313-052 на хромосоме 3. Гибридный генотипа (гетерозиготы) будет выделен желтым цветом. Исправлена вариант в A. coluzzii отмечается в светло-голубой и фиксированной вариант в A. gambiae отмечается в темно-синий.
Таблица 5. SNP генотипов для KDR. Два ОНП KDR # 1 и KDR # 2 представляют собой генотип для 1014-го кодона гена п. Первая базовая неизменна, так что не входит в анализе. Чувствительные гомозиготные генотипы отмечены синим цветом. Наиболее устойчивы L1014F гомозиготы генотип отмечается в темно-синего цвета. Желтый цвет указывает Гетерозигота. L1014 S, промежуточно устойчивый генотип, показано в оранжевый цвет.
Таблица 6. SNP генотипов для P. тропической и П. трехдневной Ong>. Всего 6 SNP, используются для определения присутствия малярийного паразита. Pl-0041, Pl-1269 и Pl-1549 содержит P. Falciparum специфических аллелей (G, T и T соответственно). Одновременное усиление трех аллелей указывает на наличие относительно неповрежденного P. тропической ДНК в образце ДНК. Усиление альтернативных аллелей (А для PL-0041 и PL-1269) указывает на наличие других видов Plasmodium (например, P. трехдневной П. овального или P. malariae) в образце. PF-1549 находится в регионах со многими другими P. тропической конкретных фланговые регионов, таким образом, этот SNP только усиливается, когда П. тропической присутствует. Pl-0071, Pl-1245 и Pl-0157 содержит P. трехдневной специфических аллелей (G, G и T соответственно). Усиление альтернативных аллелей (А, А и С соответственно) указывает на наличие другой Plasmodium ДНК в образце. Неинфицированные комары не будет иметь никакого усиления по всем 6 маркеров. 
Таблица 7. SNP генотипов для 7 хозяев:. Человека, курица, корова, собака, козы, свиньи и овцы "NC" означает "не называю" (без усиления) в следующей таблице. Обратите внимание, что некоторые неспецифические усиление может происходить в некоторых локусах, но не для всех ОНП конкретного хозяина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MDA состоит из пяти основных этапов: ПЦР-амплификации, креветки щелочной фосфатазы (SAP) реакции, расширения SNP, кондиционирования расширение продукт, и матрица-активированная лазерная десорбция / ионизации - времени пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии 33-37. Первый усиления стадия ПЦР усиливает ДНК фланговый каждый SNP, так что достаточно матричной ДНК будут доступны на расширение шаг SNP. Реакция SAP нейтрализует неиспользуемые дНТФ, которые могут помешать следующей SNP этапе расширения. Расширение SNP включает в себя одну удлинения праймера за SNP локуса и массовых модифицированный терминатора нуклеотидов. 3'-конце модифицированные нуклеотиды предотвратить последующие нуклеотиды от быть включены в удлинения праймера. Таким образом, масса одного основания указывает на генотип соответствующего SNP.
Наиболее важным шагом в обеспечении успеха такого подхода является наличие хорошей набора данных существующих полиморфизмов в пораженном организмес. Мы использовали хорошо характеризует ОНП для идентификации видов (N> 900) 10,12,38-40 и KDR (N> 1000) 15,18. Конкретные виды ОНП для Plasmodium были идентифицированы выравнивания последовательностей цитохрома Ь последовательностей 123 P. тропической, 97 П. трехдневной, 11 П. malariae и 18 P. овального выделения последовательностей из Африки, которые были доступны на Генбанку. Цитохрома Ь последовательности из 7 видов хозяев (человек, курица, корова, собака, козы, свиньи и овцы) были собраны из Genbank для хоста идентификации конкретного SNP. На основе этого большого объема данных о последовательностях, мы смогли разработать надежную диагностического теста с использованием анализа разработки программного обеспечения.
Количество маркеров друг реакции может вместить определяется биохимической совместимости смеси праймеров данного толерантность к праймерного димера потенциал (+0,9 0-1 шкале). Авторы использовали значение по умолчанию (1, большинство строгий) для ложного потенциала грунтовки. Relaxation этого параметра может потенциально увеличить количество полиморфизмов, которые могут быть проанализированы в одной реакции в дополнение к ОНП включены в данное исследование.
Шаги ПЦР-амплификации являются надежными и, как правило, не требует регулировки от первоначального замысла анализа. SNP расширение смеси (таблица 3), однако, может потребоваться изменение в относительной количества каждого праймера с использованием масс-спектрометрии, чтобы обеспечить достаточное отношение сигнал-шум достигается для каждого праймера. При условии, SNP удлинения праймера рецепт Результатом этих изменений. Совместимость между расширения праймеров может ограничить общее количество полиморфизмов, которые могут быть мультиплексирования в одном реакции. Поскольку реакционный объем мал (5-8 мкл), образец пластина должна быть надлежащим образом герметизированы для предотвращения испарения во стадий амплификации.
Эта платформа может одновременно забить до 35 ОНП на реакцию, в то время как другие генотипирования платформы SNP может accommodatе более тысячи ОНП на реакцию 41. С достижениями в геноме технологии секвенирования, можно приобрести миллионы SNP, используя следующего поколения секвенирования 29,42,43. Тем не менее, метод, используемый здесь, представляет собой идеальное применение для исследований, требующих генотипирования относительно небольшое количество маркеров для многих (100С-1.000 S) физических лиц. Дополнительное обсуждение конструктивных ограничений различного SNP генотипирования платформы покрыта в предыдущих исследованиях 41.
MDA направлена на характеризующая эпидемиологически важных черт переносчиков малярии и обеспечивает идеальную протокол для среднего пропускная SNP генотипирования анализа, анализирующих тысячи комаров, собранных из природных популяций. МДА, представленные здесь обеспечивает (1) по уменьшению рабочего времени на 90%, (2) снижение на 60% расходов реагентов, и (3) снижение ложных срабатываний / негативов с использованием нескольких маркеров. Предложил анализ может повысить эпидемиологических исследований отсущественно облегчает сбор данных. Кроме того, это может улучшить генома исследования ассоциации, характеризуя образцы комаров по отношению к численности населения происхождения, стойкости к инсектицидам, паразитов восприимчивости и принимающей выбору. Наконец, это MDA может предоставить вдохновения и шаблон для создания других мультиплексов анализов с использованием на основе MALDI-TOF SNP генотипирования платформы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора. Энтони Корнел и Лора Норрис Калифорнийского университета в Дэвисе и доктора Катарина Kreppel в университете Глазго для обеспечения комаров образцы из Танзании. Мы благодарим г-жу Смита Дас и д-р Дуглас Норрис из школы Джона Хопкинса здравоохранения для обмена образцы комаров из Замбии. Мы также благодарим г-н Ли В. Millon в лаборатории генетики ветеринарной для обучения по дизайну анализа. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья грант R01AI 078183 и R21AI062929.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
References
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
- Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
- Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
- Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
- Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
- Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
- White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
- Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
- Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
- Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
- Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
- Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
- Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
- Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
- Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
- Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
- Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
- Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
- Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
- Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
- Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
- Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
- Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
- Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
- Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
- Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
- Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
- Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
- Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
- Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
- Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
- Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
- Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
- Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
- Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
- Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).
