Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

Published: February 28, 2015 doi: 10.3791/52385
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Abstract

מתחם מיני אנופלס gambiae כולל המלריה העיקרית העברת יתושים באפריקה. כי מינים אלה הם בעלי חשיבות רפואית כגון, כמה תכונות הן בדרך כלל מאופיינות באמצעות מבחני מולקולריים לסיוע במחקרים אפידמיולוגיים. תכונות אלה כוללות זיהוי מינים, התנגדות חרקים, מצב זיהום טפיל, והעדפת מארח. מאז אוכלוסיות של מתחם אנופלס gambiae הן מורפולוגית נבדלו, תגובת שרשרת של פולימראז (PCR) משמשת באופן מסורתי לזיהוי מינים. ברגע שהמינים ידוע, כמה מבחני במורד הזרם מבוצעים באופן שיגרתי על מנת להבהיר מאפיינים נוספים. למשל, מוטציות הידועות כKDR בגן para להקנות עמידות נגד DDT וחומרי הדברה pyrethroid. בנוסף, מבחני צמודי אנזים immunosorbent (ELISAs) או מבחני PCR לגילוי DNA הטפיל Plasmodium המשמשים לאיתור טפילים הנמצאים ברקמות יתושים. לבסוף, combination של PCR ומעכל אנזים הגבלה ניתן להשתמש כדי להבהיר העדפת מארח (למשל, אדם לעומת דם בעלי חיים) על ידי הקרנת bloodmeal היתושים לDNA מארח ספציפי. פיתחנו assay רב-זיהוי (מד"א) שמשלב את כל מבחני הנ"ל ל33SNPs genotyping התגובה זמנית יחיד עבור 96 או 384 דגימות בכל פעם. בגלל מד"א כולל סמנים מרובים עבור מינים, זיהוי Plasmodium, וזיהוי דם מארח, הסבירות ליצירת תוצאות חיוביות או שליליים שגויות מופחתת במידה ניכרת ממבחנים קודמים הכוללים סמן אחת בלבד לכל תכונה. assay חזק וזה פשוט יכול לזהות תכונות יתוש מפתח אלה חסכוניים ובשבריר של הזמן של מבחני קיימים.

Introduction

arabiensis אנופלס, coluzzii אנופלס ואנופלס gambiae הם הווקטורים העיקריים האחראים להעברת מלריה באפריקה 1. שלושת מינים אלה הם מורפולוגית נבדלו 2 וניתן להבחין רק במבחנים מולקולריים 3-9. בנוסף, יש מבחני במורד הזרם רבים שנערכו באופן שגרתי כדי לסייע מחקרים אפידמיולוגיים וגנטיקת אוכלוסייה. אלה כוללים (1) assay genotyping לאיי התפצלות 10-12, (2) assay genotyping הכרת SNPs שאינו שם נרדף ב1,014 ה עמדת חומצת אמינו קודון של גן para (ההתנגדות לדפוק למטה, או kdr, SNP) 13 -18, (3) גילוי טפיל PCR 19-23, ו- (4) להקרנת DNA מארח ספציפי בmidguts יתוש 24,25.

פיתחנו assay רב-זיהוי (מד"א) שמשלב את כל מבחני הללו לתגובה זמנית בודדת במטרהalyzing מאפיינים חשובים אפידמיולוגיה של מלריה באפריקה. Assay מד"א כולל סמנים מרובים לאיתור (1) מין (arabiensis א, א gambiae, coluzzii א, או אחר (אף אחד משלוש)), (2) התנגדות החרקים המיוצגות בkdr SNPs (שני L1014F וL1014S) , (3) נוכחות של שני טפילי מלריה עיקריים, Plasmodium falciparum וP. vivax, ו- (4) מקור דם מעופות אחד ושישה מארחי יונקים.

באופן מסורתי, אלה מבחני נערכו בתגובות נפרדות שרשרת של פולימראז. כאשר כל אלה מבחני נעשים באמצעות פלטפורמת PCR קונבנציונלית, זה מחייב ביצוע 8-10 מבחני תגובת PCR ומלווה את צעדי ג'ל אלקטרופורזה. כל תגובת PCR בודדת מהכנה לתוצאות תיעוד לוקחת 4-5 שעות, ואילו שיטת מד"א שהוצגה כאן לוקחת בערך 5 שעות במכלול. זה שווה חיסכון של 90% בעלויות עבודה לבד. מד"א שהוצג כאן עולה 5 $לדגימה לגנוטיפ כל 33 SNPs. זה הרבה פחות יקר מאשר מבחני בודדים agarose מבוסס ג'ל, שעולים כ $ 1.50 לכל מדגם. מבחני איתור כל המאפיינים מכוסים על ידי מד"א ידרשו מינימום של 8-10 מבחני מבוססי ג'ל agarose נפרדים במחיר של 12-15 דולרים למדגם. יתר על כן, מד"א מקטין באופן משמעותי את הסיכוי ליצירת שקר חיובי או שלילי על ידי שימוש בלפחות שלושה סמנים לכל גילוי טפיל או מקור מארח.

הפלטפורמה שנוצלנו אינה מוגבלת למלריה, אבל ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים, כגון רפואה, רפואת וטרינרית, וביולוגיה בסיסית 26-28. במחקרים מעמיקים עמותה או גנטיקה של אוכלוסיות המחקרים שכללו מספר רב (לפי סדר 100s) של דגימות דורשים הקרנת מבחני עלות-תועלת לסמנים מרובים בו זמנית. רוב המחקרים שעושים שימוש בשניים או יותר מבחני PCR נפרדים יכולים ליישם את מד"א לתוצאות מהר יותר בעלות נמוכה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PCR הגברה

  1. מערבבים את כל צבעי יסוד PCR (ראה טבלת S1 המשלים) בmicrotube 1.5ml. לכל אחד יש שני SNP פריימרים (קדימה ואחורה). ודא שהמניה הריכוז של כל צבע יסוד PCR נשמר ב 100 מיקרומטר. לעשות מספיק תערובת פריימר ל500-1,000 תגובות להפחית pipetting שגיאה וזמן על הספסל (ראה טבלת S2 המשלים). אם תרצה, להכין aliquots ל100-200 תגובות לכל צינור ולאחסן ב -20 ° C.
  2. הכן קוקטייל PCR, כמתואר בפרוטוקול של היצרן (טבלת 1). הנפח 96 תגובות כולל הסככה של 20%. מערבולת הצינור המכיל קוקטייל PCR קל ו צנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x.
  3. לוותר 3 μl של קוקטייל PCR לבאר כל הלא עקף 96 צלחת גם. פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה.
  4. הוסף 2 μl של הדנ"א הגנומי המתאים של יתושים בכל טוב.
    הערה: תהליך קבלת הדנ"א הגנומי ממ ' רקמות osquito (ראש / חזה, בטן או כל גוף) מתוארות בספרויות אחרות 29-32. בחר פרוטוקול מיצוי DNA מתאים כדי לבדל את אלה עם Plasmodium בדם (הבטן) מיתושים מזהמים (Plasmodium בראש / החזה). אנחנו בדרך כלל להשתמש ב- DNA שחולץ מחלקי גוף (ראש / חזה או בבטן) של יתושים, כך ריכוז ה- DNA משתנה מ0.05-2ng / μl. למרות שסכתי תשומת DNA היא נמוכה מהמלצת היצרן (5-10ng / rxn), אנחנו בדרך כלל מקבלים SNP חזק קורא מ -98% מהדגימות DNA בלי ההגברה הגנום כולו.
  5. חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם.
  6. משתמש בפרוטוקול thermocycler הבא כדי לבצע PCR הגברה: (1) 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, (2) 94 ° C למשך 30 שניות, (3) 56 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, (4) 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 , (5) חזרו על שלב (2) - (4) במשך 45 מחזורים, (6) 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, ו -4 אחיזת מעלות צלזיוס.
_title "> 2. SAP טיפול

  1. הכן את פתרון אנזים SAP בצלחת גם 96 (ראה טבלה 2). לעבד 96 דגימות בצלחת. הנפח 96 תגובות כולל הסככה של 20%.
  2. מערבולת הצינור של פתרון SAP אנזים קל ו צנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x. לוותר על 2 μl של פתרון אנזים SAP לכל אחד. שוב, פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה.
  3. חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם. דגירה את הצלחת באופן הבא: (1) 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות, (2) 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית את האנזים, (3) אחיזת C 4 מעלות. בסיום שלב זה, לאחסן את הצלחת ב -20 ° C לפני שתמשיך. לעבד את הצלחת מאוחסנת בתוך 2 שבועות.

3. SNP Extension

  1. אם צלחת המדגם היא קפוא לאחר טיפול SAP, לאפשר לו להפשיר לRT לפני שנמשיך.
  2. מכין את תערובת פריימר הארכה (נוסף הטבלה S2). לכל אחד יש SNP exte אחדפריימר nsion. שמור את מניית הריכוז של כל צבע יסוד הארכה ב -500 מיקרומטר. לחלופין, aliquot ל100-200 תגובות לכל צינור ולאחסן ב -20 ° C.
  3. הכן תערובת הארכה כמפורט בטבלה 3. 96 תגובת כרך כולל הסככה של 20%.
  4. מערבולת הצינור של קוקטייל סיומת קלה וצנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x. לוותר על 2 μl של קוקטייל הארכה לכל אחד. שוב, פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה.
  5. חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם. Thermocycle הצלחת כפי שמוצג באיור 1. בשלב זה, להמשיך לספקטרומטר מסה או לאחסן את הצלחת ב -20 ° C עד 2 שבועות.

4. אוויר המוצרים הרחבה SNP לייעל ניתוח ספקטרומטריית המסה

  1. אם צלחת המדגם היא קפוא לאחר הארכה SNP, לאפשר לו להפשיר לRT לפני שנמשיך.
  2. העבר את 15mg של שרף מcontainer לצלחת הגומה באמצעות כף מוארכת. השתמש במגרד להפיץ שרף לתוך הבארות של צלחת הגומה. לטאטא את המגרד מצד לצד פני צלחת הגומה כדי להפיץ את השרף. ודא שיש שרף בכל טוב.
  3. לגרד שרף עודף מצלחת הגומה באמצעות המגרד. בואו השרף עומד בצלחת הגומה לפחות 20 דקות. בעת נותנת השרף עומד בצלחת הגומה, להוסיף 41 μl מים כיתה HPLC היטב בכל צלחת המדגם.
  4. מניח בעדינות את צלחת מדגם הפוכה, לצלחת הגומה. ודא המדגם מתאפס צלחת נגד הפוסט הקטן המעוגל של צלחת הגומה, שמיישר את הבארות בצלחת המדגם עם הבארות בצלחת הגומה.
  5. מחזיק צלחת המדגם וצלחת הגומה יחד, בעדינות להעיף אותם מעל כל כך השרף נופל מצלחת הגומה לתוך הבארות של צלחת המדגם. הקש על צלחת הגומה כך השרף נופל לתוך צלחת המדגם. ודא שכל השרף בdi צלחת mple נופלת לתוך בארות צלחת מדגם. צנטריפוגה את הצלחת ב3,200 XG למשך 30 שניות.
  6. סובב את צלחת המדגם על הכתף במשך 5 דקות בRT. Rotator חייב לסובב את צלחת המדגם של 360 מעלות על ציר הזמן.
  7. צנטריפוגה צלחת המדגם ב3,200 XG במשך 5 דקות. לאחר שלב זה, לאחסן את צלחת המדגם ב -20 ° C עד 2 שבועות לפני שתמשיך לשלב הבא.

5. MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

  1. העבר את מוצר הארכת SNP המותנה על bioarray כגון SpectroCHIP לפי הוראות יצרן. אנו משתמשים בMassArray Nanodispenser לצעד זה.
  2. ברגע שההעברה תסתיים, להגדיר כיצד מבחני וצלחות שיוקמו באתר assay. שם assay וצלחות כאלה שיש לכל צלחת מזהה ייחודי שמקשר לעיצוב assay הספציפי (משלימה לוח S3).
  3. לאחר assay והצלחת הוגדרו, לרכוש ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מסה.

s = "jove_title"> 6. ניתוח נתונים

  1. לבצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת פרשנות נתונים בזמן אמת ניתוח PCR כמו Typer Analyzer או TyperViewer (Sequenom). לקבל נתונים ב.xml פורמט המכיל את פריסת המדגם, ספקטרוגרמה המונית לכל טוב, מידע הסמן כוללים שם, המוני צפוי לכל גרסה של SNP המקביל, וכל טעות או הודעות אזהרה הקשורים לכל תגובה. ראה איור 2 לספקטרוגרמה מסה וכתוצאה מכך.
  2. לבצע ניתוח אשכולות גנוטיפ SNP על ידי קביעת סף הגילוי (גודל או יחס אות לרעש) וסובלנות / שונות אפשר לכל גנוטיפ. איור 3 מציג דוגמא של 04,707 #-KDR 2 אשכולות גנוטיפ SNP.
  3. לייצא את שיחות גנוטיפ SNP וכתוצאה מכך לתכנית גיליון אלקטרוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זיהוי מינים:

5 SNPs הבא ביחד לזהות שלושה מינים (arabiensis א, א coluzzii וא gambiae) (לוח 4). אם מדגם הוא לא אחד משלושת המינים, שלושה SNPs (01,073-213, 04,679-157 ו10313 -052) לא מצליחים להגביר.

גנוטיפ kdr כדי להסיק מסקנת התנגדות קוטל חרקים:

קודון 1,014 ה של ערוץ נתרן מגודר מתח סעיף מתאים לkdr. שני SNPs על בסיס 2 nd ו-3 בקודון ה 1,014 לקבוע שלוש חומצות אמינו אפשריות. . הצירופים האפשריים של גנוטיפים מפורטים בטבלה 5 זה SNP עובד לשלושה מינים של מלריה באפריקה: א arabiensis, coluzzii א וא ' gambiae. SNPs אלה ייכשל כדי להגביר בא darlingi, וקטור מלריה ברזילאי. זה לאניתנו מפתיע שדמיון רצף הגנום המיטוכונדריאלי בין א ' darlingi וא ' gambiae הוא רק 88.9% ואילו דמיון רצף הגנום המיטוכונדריאלי בין שלושה וקטורי מלריה באפריקה הוא מעל 98%. מינים אחרים לא נבדקו. היינו מוצלחים בהגברה מהדגימות שנאספו במאליי, קמרון, טנזניה וזמביה.

זיהוי Plasmodium:

אם Plasmodium שלם DNA נמצא ברקמת היתושים, אנו מצפים לגילוי P. falciparum או פ DNA הספציפי vivax בין דגימת DNA שחולצה מהיתוש. SNPs הספציפי המינים זוהו מיישור רצף של רצף ציטוכרום ב 123 P. falciparum, 97 P. vivax, 11 P. malariae ו -18 P. לבודד רצפים מאפריקה נגיש בGenBank ovale. עיצבנו 6 SNPs אשר מייצר גנוטיפים SNP ייחודיים להבחין P. falciparum או פ vi VAX ממיני Plasmodium אחרים (לוח 6). בדקנו assay זה על דגימות שנאספו נגד יתושים במאליי, קמרון, טנזניה, זמביה וברזיל ואישרתי כי קבוצה מסוימת של סמנים עובדת ללא קשר למין יתוש.

PCR זיהוי Bloodmeal:

רצפים ב ציטוכרום מ 7 מיני מארח (אדם, עוף, פרה, כלב, עז, חזירים וכבשים) נאספו מGenBank ורצפי קונסנסוס היו שנוצרו. SNPs אינפורמטיבי לכל מארח לאחר מכן נבחרו לגנוטיפ. בדקנו את זה עם מקורות דם מבעלי חיים שונים 7 (לוח 7).

בגלל שברי PCR הם קצרים (80-120 נ"ב), זה עובד על DNA המושפל במידה מסוימת או bloodmeals על מעוכל חלקית מרקמת יתושים. ההסתברות של שיחות חיוביות כוזבות מופחתת במידה ניכרת על ידי בעל סמנים מרובים לכל סוג מארח.

s "> איור 1
איור 1. תכנית thermocycler לצעד הארכת SNP. מחזור ההגברה כוללת של 200 (5x40).

איור 2
איור 2. Mass-ספקטרוגרמה למד"א. ציר X היא מסה (Da) של מוצרי ההמשך הSNP וציר Y הוא עוצמת אות. הקווים אדומים מציינים את המסה הצפויה של פריימר שאינו המאוגד Extension, אלל SNP 1 ואלל 2 לסמן הנבחר. קווים אפורים מציינים צפויים המוני של סמנים אחרים במד"א. עלילה זו נוצרה מתוכנה ניתוח נתונים (Typer Analyzer או Typer Viewer) מתוך קובץ נתוני פלט אחרי שלב 5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

e = "תמיד"> איור 3
3. אשכול גנוטיפ איור הפרט SNP להציג ציר X הוא ערך arctangent (שכותרתו "זווית") של עוצמות האות של אלל SNP 1 ואלל SNP 2. ציר Y הוא בסדר הגודל של שיחת גנוטיפ אות. עלילה זה מסופקת בתוכנת ניתוח נתונים (Typer Analyzer או Typer Viewer). ניתן לבחור כל נתונים מסוימים בלחיצה על לחצן עכבר ונתוני מדגם שנבחרו הוא הצביעו על ידי המעגל. ניתוח אשכולות הניתנים באשכולות תוכנת גנוטיפים עם סף שונות המוגדר על ידי משתמש ואופן אוטומטי צבעים שלושה גנוטיפים של SNP biallelic. דוגמא המוצגת כאן מציינת אנשים הומוזיגוטים T (TT) כמשולשים כחולים, heterozygote (ת"א) כריבועים ירוקים ואנשים הומוזיגוטים (AA) כמשולשים כתומים הפוך. עיגולים אדומים מייצגים לא שיחה (לא הגברה).t = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מֵגִיב ריכוז ב5 μl נפח נפח
(Rxn 1) (96 rxns)
מים (כיתה HPLC) NA 0.8 μl 92.2 μl
10x PCR הצפת עם 20 מ"מ MgCl2 1x (2 מ"מ MgCl2) 0.5 μl 57.6 μl
MgCl2 (25 מ"מ) ** 2 מ"מ 0.4 μl 46.1 μl
תמהיל dNTP (25 מ"מ כל אחד) *** 500 מיקרומטר 0.1 μl 11.5 μl
תערובת פריימר (500 ננומטר כל אחד) 100 ננומטר 1.0 מיקרוליטר 115.2 μl
PCR אנזים (5 U / μl) 1.0 U / rxn 0.2 μl 23.0 μl
נפח כולל: 3.0 μl 345.6 μl

טבלת 1. מתכון קוקטייל Multiplex PCR. היקפה של כל מגיב לצעד הארכת PCR לתגובה אחת ו 96 תגובות עם הסככה 20%.

נפח כולל
מֵגִיב נפח (rxn 1) נפח (96 rxn)
מים (כיתה HPLC) 1.53 μl 176.3 μl
SAP הצפת (10x) 0.17 μl 19.6 μl
אנזים SAP (1.7 U / μl) 0.30 μl 34.6 μl
2.00 μl 230.4 μl

פתרון טבלה 2. SAP אנזים. היקפה של כל מגיב לטיפול אלקליין phosphatase שרימפס לתגובה אחת ו 96 תגובות עם הסככה 20%.

מֵגִיב קונצרט כלשהו. ב9 μl נפח (1rxn) נפח (96 rxns)
מים (כיתה HPLC) NA .6190 Μl 71.3 μl
iPLEX המאגר פלוס (10x) 0.222x .2000 Μl 23.0 μl
תמהיל סיום iPLEX 1x .2000 Μl 23.0 μl
תמהיל ההארכה פריימר .9400 Μl 108.3 μl
אנזים iPLEX 1x .0410 Μl 4.7 μl
נפח כולל 2.0000 μl 230.4 μl

טבלה 3. קוקטייל SNP הארכת עוצמת הקול של כל מגיב לצעד הארכת SNP לתגובה אחת ו 96 תגובות עם הסככה 20%.

לוח 4
לוח 4. גנוטיפים SNP לכל מין. 28S IGS-540, 28S IGS-649 ו01,073-213 ממוקמים על כרומוזום X, 04,679-157 הוא על כרומוזום 2 ו10,313-052 הוא ב3. גנוטיפ ההיברידי כרומוזום (heterozygote) מודגש בצהוב. גרסה קבועה בא coluzzii מסומן בגרסה כחולה וקבועה באור א ' gambiae מסומן בחושךכחול.

לוח 5
לוח 5. גנוטיפים SNP לkdr. שני SNPs KDR # 1 ומס '2 KDR מהווים גנוטיפ לקודון 1,014 ה של גן para. הבסיס הראשון הוא בלתי משתנה, כך שהוא אינו כלול בassay. גנוטיפים הומוזיגוטים רגישים מסומנים בכחול. גנוטיפ homozygote L1014F העמידים ביותר מסומן בכחול כהה. צהוב צבע מציין heterozygote. L1014 S, intermediately גנוטיפ עמיד, מוצג בצבע כתום.

לוח 6
לוח 6. גנוטיפים SNP לפ falciparum וP. vivax אונג>. סה"כ 6 SNPs משמש כדי לקבוע את נוכחותו של טפיל מלריה. Pl-0041, Pl-1,269 וPl-1,549 להכיל P. אללים falciparum ספציפיים (G, T ו- T בהתאמה). הגברה בו זמנית של שלושה אללים מציינת נוכחות של פ יחסית ללא פגע DNA falciparum בדגימת DNA. הגברה של אללים חלופיים (לPl-0041 וPl-1,269) מצביעה על נוכחותם של מינים אחרים Plasmodium (למשל, פ vivax, P. ovale או פ malariae) במדגם. PF-1,549 ממוקם באזורים עם הרבה יותר P. ספציפי falciparum איגוף אזורים ובכך SNP זה מוגבר רק כאשר P. falciparum הוא הווה. Pl-0071, Pl-1,245 וPl-0157 מכילים P. אללים vivax ספציפיים (G, G ו- T בהתאמה). הגברה של אללים חלופיים (, A ו- C, בהתאמה) מצביעה על נוכחות של Plasmodium DNA האחר במדגם. יתושים נגוע לא יהיו הגברה בכל 6 הסמנים. לוח 7
לוח 7 גנוטיפים SNP למארחי 7:. אדם, עוף, פרה, כלב, עז, חזירים וכבשים "NC" הם הקיצור של "לא התקשר" (אין הגברה) בטבלה הבאה. שים לב שחלק ההגברה שאינה ספציפית עלולה להתרחש בכמה לוקוסים, אבל לא לכל SNPs של מארח מסוים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מד"א מורכב מחמישה שלבים עיקריים: הגברה PCR, תגובת phosphatase אלקליין השרימפס (SAP), הארכת SNP, מוצר הארכת אוויר, וdesorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס - זמן טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסת 33-37. צעד ההגברה PCR הראשון מגביר DNA איגוף כל SNP כך שתבנית ה- DNA מספיק יהיה זמין בשלב הארכת SNP. תגובת SAP מנטרלת dNTPs שאינו בשימוש אשר יכול להפריע לצעד הארכת SNP הבא. הארכת SNP כרוכה פריימר ארכה אחת למוקד SNP ונוקלאוטידים שליחות קטלנית-שונה המוניות. נוקלאוטידים שונה 3'-end למנוע נוקלאוטידים הבאים מלהיות משולב בפריימר הארכה. כך המסה של הבסיס הבודד מציינת גנוטיפ של SNP המקביל.

השלב הקריטי ביותר בהבטחת ההצלחה של גישה זו הוא שיש בסיס הנתונים טוב של פולימורפיזם קיים באורגניזם היעדs. אנחנו השתמשנו SNPs המאופיין היטב לזיהוי מינים (N> 900) 10,12,38-40 וkdr (N> 1000) 15,18. SNPs הספציפי המינים לPlasmodium זוהו מיישור רצף של רצפי ציטוכרום ב 123 P. falciparum, 97 P. vivax, 11 P. malariae ו -18 P. ovale לבודד רצפים מאפריקה שהיו נגיש בGenBank. רצפים ב ציטוכרום מ 7 מיני מארח (אדם, עוף, פרה, כלב, עז, חזירים וכבשים) נאספו מGenBank לזיהוי SNP מארח ספציפי. בהתבסס על הגוף הגדול הזה של נתונים רצף, היינו יכול לעצב assay אבחון חזק באמצעות תוכנת מעצב assay.

מספר הסמנים כל תגובה יכולה להכיל נקבע על ידי התאימות ביוכימיים של תמהיל פריימר נתון סובלנות לפריימר פוטנציאל דימר (0.9 של 0-1 קנה מידה). חוקרים השתמשו בערך ברירת המחדל (1; המחמיר ביותר) לפוטנציאל תחול שווא. Relaxation של פרמטר זה עלול להגדיל את מספר SNPs שניתן assayed בתגובה אחת בנוסף לSNPs שנכלל במחקר זה.

צעדי ההגברה PCR הם חזקים ובדרך כלל אינו דורשים התאמה מעיצוב assay הראשוני. תמהיל הארכת SNP (לוח 3), עם זאת, ייתכן שיהיה צורך שינוי בכמות היחסית של כל צבע יסוד באמצעות ספקטרומטר מסה כדי להבטיח אות מספיק יחס רעש מושגת עבור כל צבע יסוד. מתכון פריימר הארכת SNP סיפק הוא התוצאה של התאמות אלה. תאימות בין פריימרים הארכה עלולה להגביל את המספר הכולל של SNPs שיכול להיות זמנית בתגובה אחת. מאז תגובת הנפח קטן (5-8 μl), צלחת המדגם צריכה להיות אטומה כמו שצריך כדי למנוע אידוי במהלך שלבי הגברה.

פלטפורמה זו יכולה בו זמנית לצבור עד 35 SNPs לכל תגובה, ואילו פלטפורמות genotyping SNP אחרות יכולות accommodatדואר למעלה מאלף SNPs לכל תגובה 41. עם ההתקדמות טכנולוגית רצף הגנום, ניתן לרכוש מיליונים SNPs באמצעות 29,42,43 רצף של הדור הבא. עם זאת, הטכניקה המשמשת כאן מספקת יישום אידיאלי ללימודים שדורשים genotyping מספר קטן יחסית של סמנים ל( 100s-1,000s) אנשים רבים. דיון נוסף באילוצי העיצוב של פלטפורמת genotyping SNP שונה מכוסה במחקרים קודמים 41.

מד"א שנועד לאפיין תכונות חשובות אפידמיולוגיה של מלריה ומספק פרוטוקול אידיאלי עבור מבחני genotyping SNP בינוני תפוקת ניתוח אלפי יתושים שנאספו מאוכלוסיות טבעיות. מד"א שהוצג כאן מספק (1) על ירידה של 90% בזמן עבודה, (2) הפחתה של 60% בעלויות מגיב, ו- (3) ירידה בתוצאות חיוביות / שליליות שגויים על ידי ניצול סמנים מרובים. Assay המוצע יכול לשפר מחקרים אפידמיולוגיים על ידימאוד להקל על איסוף הנתונים. כמו כן, זה יכול לשפר את לימודי עמותת הגנום על ידי אפיון דגימות יתושים ביחס למוצא אוכלוסייה, התנגדות חרקים, רגישות טפיל ובחירת מארח. לבסוף, מד"א זו עשויה לספק השראה ותבנית לעיצוב מבחני זמנית אחרים באמצעות פלטפורמת genotyping SNP מבוסס MALDI-TOF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים בני הזוג. אנתוני קורנל ולורה נוריס בUC Davis וד"ר Katharina Kreppel באוניברסיטת גלזגו למתן דגימות יתושים מטנזניה. אנו מודים לגב 'Smita Das וד"ר דאגלס נוריס מבית הספר לג'ונס הופקינס לבריאות הציבור לשיתוף דגימות יתושים מזמביה. כמו כן, אנו מודים למר לי V. millon במעבדה לגנטיקה וטרינריים להכשרה בעיצוב assay. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק R01AI 078,183 וR21AI062929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
  31. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  32. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  33. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  34. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  35. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  36. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  37. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  39. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  40. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  41. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  42. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  43. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Tags

מחלות זיהומיות גיליון 96 כילה נגד גנוטיפ SNP assay זמנית iPLEX MALDI-TOF התנגדות חרקים איי התפצלות אבחון מינים גילוי טפיל זיהוי מקור דם העדפת מארח מצב זיהום
Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C.… More

Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter