Abstract
Den Anopheles gambiae arter Komplexet omfattar den stora malaria sänder mygg i Afrika. Eftersom dessa arter är av sådan medicinsk betydelse, finns flera drag vanligtvis karaktäriseras med molekylär analyser till stöd i epidemiologiska studier. Dessa egenskaper omfattar artbestämning, insektsresistens, parasitinfektion status, och värd önskemål. Eftersom populationer av Anopheles gambiae komplexet är morfologiskt oskiljbara, är en polymerase chain reaction (PCR) traditionellt används för att identifiera arter. När arten är känd, är flera nedströms analyser rutinmässigt för att belysa ytterligare egenskaper. Till exempel, mutationer kända som KDR i en para gen ger resistens mot DDT och pyretroidinsekticider. Dessutom är enzymkopplade immunsorbentanalyser (ELISA) eller Plasmodium parasit-DNA detektions PCR-analyser som används för att detektera parasiter som finns i mygga vävnader. Slutligen, en combination av PCR och restriktionsenzymdigereringar kan användas för att belysa värd preferens (t.ex., människa kontra djurblod) genom screening av mygga blodmjöl för värdspecifik DNA. Vi har utvecklat en multi-detekteringsanalys (MDA) som kombinerar alla av de ovannämnda analyserna i en enda multiplex reaktion genotypning 33SNPs för 96 eller 384 sampel i taget. Eftersom MDA innehåller flera markörer för arter, Plasmodium upptäckt, och värdblod identifiering, är sannolikheten för att generera falska positiva eller negativa kraftigt reducerad från tidigare analyser som inkluderar endast en markör per drag. Denna robusta och enkla analys kan upptäcka dessa nyckel mygga drag kostnadseffektivt och på en bråkdel av tiden av befintliga analyser.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii och Anopheles gambiae är de stora vektor ansvarar för malariatransporten i Afrika 1. Dessa tre arter är morfologiskt oskiljbara 2 och kan endast särskiljas genom molekylära analyser 3-9. Dessutom finns det många nedströms analyser rutinmässigt genomförda för att hjälpa epidemiologiska och populationsgenetiska studier. Dessa inkluderar (1) en genotypning analys för specieringsberäkningar öar 10-12, (2) en genotypning analys erkännande av icke-synonyma SNP i 1014: e aminosyran kodonposition av para-genen (knock-down motstånd eller KDR, SNP) 13 -18, (3) parasit detektering PCR 19-23, och (4) screening för värdspecifik DNA i mygga midguts 24,25.
Vi utvecklade en multi-detekteringsanalys (MDA) som kombinerar alla dessa analyser i en enda multiplex reaktion med målet av enalyzing epidemiologiskt viktiga egenskaper hos malaria vektorer i Afrika. I MDA-analysen innehåller flera markörer för att upptäcka (1) art (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii eller annan (ingen av de tre)), (2) insektsresistens representerade i KDR SNP (både L1014F och L1014S) , (3) närvaron av två stora malariaparasiter, Plasmodium falciparum och P. vivax, och (4) blodkälla från en höns och sex däggdjursvärdar.
Traditionellt har dessa analyser utfördes i separata polymeraskedjereaktioner. När alla dessa analyser görs med hjälp av en konventionell PCR-plattform, kräver det genomför 8-10 PCR-reaktionsanalyser och medföljande gelelektrofores steg. Varje enskild PCR-reaktion från förberedelser till dokumenterar resultaten tar 4-5 timmar, medan MDA metod som presenteras här tar ca 5 timmar i helhet. Detta motsvarar en 90% besparing i enbart arbetskostnader. MDA presenteras här kostar $ 5per prov till genotyp alla 33 SNP. Detta är betydligt billigare än de enskilda agarosgel baserade analyser, som kostar ca $ 1,50 per prov. Analyser som detekterar alla kännetecken som omfattas av MDA skulle kräva minst 8-10 separata agarosgel baserade analyser till en kostnad av $ 12-15 per prov. Dessutom MDA minskar avsevärt risken för att generera ett falskt positivt eller negativt genom att använda minst tre markörer för varje parasit eller värdkälla detektering.
Plattformen vi utnyttjade är inte begränsat till malaria vektorer men kan användas i en mängd olika tillämpningar som medicin, veterinärmedicin, och grundläggande biologi 26-28. Fördjupad associationsstudier eller populationsgenetik studier med en stor (i ordning efter 100s) antal prover kräver kostnadseffektiva analyser screening för flera markörer samtidigt. De flesta studier som använder två eller flera separata PCR-analyser kunde genomföra MDA för snabbare resultat till en lägre kostnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCR-amplifiering
- Blanda alla PCR-primers (se kompletterande tabell S1) i en 1,5 ml mikrorör. Varje SNP har två primers (framåt och bakåt). Se till att stamkoncentration av varje PCR-primer hålls vid 100 ^ M. Gör tillräckligt primer mix för 500-1000 reaktioner att minska pipettering fel och tid på bänken (se kompletterande tabell S2). Om så önskas, förbereda portioner för 100-200 reaktioner per rör och förvara vid -20 ° C.
- Bered PCR cocktail som beskrivs i tillverkarens protokoll (tabell 1). Volymen för 96 reaktioner inkluderar ett överhäng på 20%. Vortex röret innehållande PCR cocktail lätt och centrifugera i 30 sek vid 2000 x g.
- Dispensera 3 ul av PCR-cocktail i varje brunn i en icke-skirted 96 brunnars platta. En repeater pipett kan spara tid för denna process.
- Lägg 2 pl av den lämpliga genomiska DNA av myggor i varje brunn.
OBS: processen för att erhålla genomiskt DNA från m osquito vävnader (huvud / bröstkorg, buk eller hela kroppen) beskrivs i andra litteraturer 29-32. Välj en lämplig DNA-extraktion protokoll för att skilja dem med Plasmodium i blodet (buken) från infektiösa myggor (Plasmodium i huvudet / thorax). Vi använder vanligtvis DNA extraherat från kroppsdelar (huvud / thorax eller buk) av myggor, så DNA-koncentrationen varierar från 0.05-2ng / l. Även om den totala DNA-ingång är lägre än tillverkarens rekommendation (5-10ng / reaktion), får vi oftast robust SNP samtal från 98% av DNA-prover utan hela genomet förstärkning. - Förslut plattan, blanda försiktigt eller virvel, och centrifugera i 1 min vid 370 x g.
- Använd följande termocykelprotokoll att utföra PCR-amplifiering: (1) 94 ° C under 2 min, (2) 94 ° C under 30 sek, (3) 56 ° C under 30 sek, (4) 72 ° C under 1 minut , (5) upprepa steg (2) - (4) för 45 cykler, (6) 72 ° C under 1 min och 4 ° C hold.
- Förbered SAP enzymlösningen i en 96-brunnsplatta (se Tabell 2). Process 96 prover i en tallrik. Volymen för 96 reaktioner inkluderar ett överhäng på 20%.
- Vortex röret av SAP-enzymlösning lätt och centrifugera i 30 sek vid 2000 x g. Dispensera 2 ul av SAP-enzymlösning i varje brunn. Återigen kan en repeater pipett spara tid för denna process.
- Förslut plattan, blanda försiktigt eller virvel, och centrifugera i 1 min vid 370 x g. Inkubera plattan på följande sätt: (1) 37 ° C under 40 minuter, (2) 85 ° C under 5 min för att inaktivera enzymet, (3) 4 ° C hold. Vid avslutning av detta steg, förvara plattan vid -20 ° C innan det fortsätter. Bearbeta lagrade plattan inom 2 veckor.
3. SNP Extension
- Om provplattan är frusen efter SAP behandling, låt den tina till RT innan du fortsätter.
- Förbered förlängnings primerblandning (Supple Tabell S2). Varje SNP har en Technsion primer. Håll beståndet koncentrationen av varje förlängnings primer vid 500 ^ M. Eventuellt alikvot för 100-200 reaktioner per rör och förvara vid -20 ° C.
- Förbered förlängnings mix som beskrivs i tabell 3. 96 reaktionsvolymen omfattar ett överhäng på 20%.
- Vortex röret av förlängnings cocktail lätt och centrifugera i 30 sek vid 2000 x g. Dispensera 2 ul av förlängnings cocktail i varje brunn. Återigen kan en repeater pipett spara tid för denna process.
- Förslut plattan, blanda försiktigt eller virvel, och centrifugera i 1 min vid 370 x g. Thermocycle plattan som visas i figur 1. Vid denna punkt, fortsätt till masspektrometri eller förvara plattan vid -20 ° C upp till 2 veckor.
4. Konditione SNP Extension Produkt att optimera masspektrometri Analys
- Om provplattan är frusen efter SNP förlängning, låt den tina till RT innan du fortsätter.
- Överför 15 mg av hartset från dess contaIner på gropplattan med en långsträckt sked. Använd skrapan att sprida harts i brunnar i den grop plattan. Sweep skrapan från sida till sida tvärs över grop plattan för att sprida hartset. Se till att det finns harts i varje brunn.
- Skrapa överskott av harts från grop plattan med skrapan. Låt hartset stå i grop plattan under åtminstone 20 min. Medan låta hartset stå i dimple plattan, tillsätt 41 pl av HPLC-kvalitet vatten till varje brunn i provplattan.
- Placera försiktigt provplattan upp och ner, på den grop plattan. Se till att provplattåterställs mot den lilla rundade posten som grop plattan, som riktar brunnarna i provplattan med brunnarna i grop plattan.
- Håll provplattan och den dimple plattan tillsammans försiktigt knäppa dem så hartset faller ut ur den grop plåten i brunnarna i provplattan. Tryck på grop plattan så hartset faller ut i provplattan. Kontrollera att allt hartset i dimple plattan faller ut i provplattbrunnarna. Centrifugera plattan vid 3200 xg under 30 sek.
- Rotera provplattan på en rotator under 5 min vid RT. Rotator måste rotera provplattan 360 ° om den långa axeln.
- Centrifugera provplattan vid 3200 xg under 5 minuter. Efter detta steg, lagra provplattan vid -20 ° C upp till 2 veckor innan man går vidare till nästa steg.
5. MALDI-TOF-masspektometri
- Överför rade SNP förlängnings medlet på en bioarray som SpectroCHIP enligt tillverkarens anvisningar. Vi använder Massarray Nanodispenser för detta steg.
- När överföringen är klar, definiera hur analyser och plattor ska inrättas i analysdatabasen. Namnge analysen och plattor så att varje platta har en unik identifierare som länkar till specifika analys utformning (Supple Tabell S3).
- Efter analys och plattan har definierats, förvärva spektra med en masspektrometer.
- Utför dataanalys med hjälp av en realtids-PCR-analys tolkning av data program som Typer Analyzer eller TyperViewer (Sequenom). Skaffa data i xml-format som innehåller provlayout, masspektrogram för varje brunn, markeringsinformation inklusive namn, förväntad massa för varje variant av motsvarande SNP, och eventuella fel eller varningsmeddelanden i samband med varje reaktion. Se Figur 2 för den resulterande massan spektrogram.
- Utför SNP genotyp klustring analys genom att ställa in detektionströskeln (magnitud eller signal-brusförhållandet) och tolerans / varians tillåtna för varje genotyp. Figur 3 visar ett exempel på en 04707-KDR # 2 SNP genotyp kluster.
- Exportera resulte SNP genotyp samtalen till ett kalkylprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Artidentifiering:
Följande 5 SNP tillsammans identifierar tre arter (A. arabiensis, A. coluzzii och A. gambiae) (Tabell 4). Om ett prov inte är en av de tre arterna, de tre SNPs (01.073 till 213, från 04.679 till 157 och 10313 -052) misslyckas med att förstärka.
KDR genotyp för inferring insektsresistens:
Den 1014: e kodon av para spänningsstyrda natriumkanalen motsvarar KDR. Två SNP på 2: a och 3: e basen av 1014: e kodon bestämmer de tre möjliga aminosyror. . De möjliga kombinationer av genotyper listas i tabell 5 Detta SNP fungerar för tre arter av afrikanska malaria vektorer: A. arabiensis, A. coluzzii och A. gambiae. Dessa SNP misslyckas med att amplifiera i A. darlingi, en brasiliansk malaria vektor. Detta är inteförvånande med tanke på att mitokondriell genomet sekvenslikhet mellan A. darlingi och A. gambiae är endast 88,9%, medan mitokondrie genomet sekvenslikhet mellan tre afrikanska malaria vektorer är över 98%. Andra arter har inte testats. Vi var framgångsrika i förstärkning från prover som tagits i Mali, Kamerun, Tanzania och Zambia.
Plasmodium upptäckt:
Om intakt Plasmodium DNA finns i mygga vävnad, förväntar vi oss att upptäcka P. falciparum eller P. vivax specifik DNA bland DNA-provet extraheras från mygga. De artspecifika SNP identifierades från sekvensuppställning av cytokrom B-sekvensen av 123 P. falciparum, 97 P. vivax, 11 P. malariae och 18 P. ovale isolera sekvenser från Afrika tillgänglig på Genbank. Vi konstruerade 6 SNP som producerar unika SNP genotyper att skilja P. falciparum eller P. VI vax från andra Plasmodium arter (tabell 6). Vi har testat denna analys på mygg prover som tagits i Mali, Kamerun, Tanzania, Zambia och Brasilien och bekräftat att detta särskild uppsättning markörer fungerar oavsett myggarter.
Blodmjöl detekterings PCR:
Cytokrom b sekvenser från 7 värdarter (människa, kyckling, ko, hund, get, gris och får) samlades in från Genbank och konsensussekvenser genererades. SNP informativa för varje värd sedan ut för genotypning. Vi testade detta med blodkällor från 7 olika djur (Tabell 7).
Eftersom PCR-fragmenten är korta (80-120 bp), detta fungerar på något försämrad DNA eller på delvis smälta bloodmeals från mygga vävnad. Sannolikheten för falskt positiva samtal reduceras kraftigt genom att ha flera markörer per värdtyp.
s ">
Figur 1. Thermocycler program för SNP förlängningssteg. The amplifieringscykel totalt 200 (5x40).
Figur 2. Mäss-spektrogram för MDA. X-axeln är massan (Da) av SNP förlängningsprodukter och Y-axeln är signalintensitet. De röda linjerna visar den förväntade massan av Unincorporated Extension primer, SNP allel 1 och allel 2 för den valda markören. Grå linjerna indikerar förväntade massa andra markörer i MDA. Denna tomt genereras från dataanalys programvara (Typer Analyzer eller Typer Viewer) från utgångsdatafilen efter steg 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
e = "always"> 
Figur 3. Individuell SNP genotyp kluster visa X-axeln är arctan värdet (märkt som "Angle") av signalintensiteterna SNP allelen 1 och SNP allelen 2. Y-axeln är storleken av genotyp anropssignal. Denna tomt finns i dataanalysprogrammet (Typer Analyzer eller Typer Viewer). Några särskilda uppgifter kan väljas med ett klick på en musknapp och valt provuppgifter indikeras av cirkeln. Clustering analys som i programvarukluster genotyper med en användardefinierad varianströskel och automatiskt färgerna tre genotyper av en biallelisk SNP. Exempel visas här indikerar homozygota T (TT) individer som blå trianglar, heterozygot (TA) som gröna torg och homozygota A (AA) individer som apelsin inverterade trianglar. Röda cirklar representerar Inget samtal (ingen förstärkning).t = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Koncentration i 5 | il | Volym | Volym |
| (1 rxn) | (96 rxns) | ||
| Vatten (HPLC-kvalitet) | NA | 0,8 | il | 92,2 | il |
| 10x PCR-buffert med 20 mM MgCl2 | 1x (2 mM MgCl2) | 0,5 | il | 57,6 | il |
| MgCl2 (25 mM) ** | 2 mM | 0,4 | il | 46,1 | il |
| dNTP mix (25 mM vardera) *** | 500 pM | 0,1 | il | 11,5 | il |
| Primer mix (500 nM vardera) | 100 nM | 1,0 | il 115,2 | il | |
| PCR Enzym (5 U / ^ il) | 1,0 U / reaktion | 0,2 | il | 23,0 | il |
| Total volym: | 3,0 | il | 345,6 | il |
Tabell 1. Multiplex PCR cocktail recept. Volymen av varje reagens för PCR-förlängningssteg för en reaktion och 96 reaktioner med en 20% överhäng.
| Reagens | Volym (1 rxn) | Volym (96 rxn) |
| Vatten (HPLC-kvalitet) | 1,53 pl | 176,3 | il |
| SAP Buffer (10x) | 0,17 pl | 19,6 | il |
| SAP-enzym (1,7 U / | il) | 0,30 pl | 34,6 | il | 2,00 pl | 230,4 | il |
Tabell 2. SAP enzymlösning. Volymen av varje reagens för alkaliskt fosfatas från räka behandling för en reaktion och 96 reaktioner med en 20% överhäng.
| Reagens | Konc. I 9 pl | Volym (1rxn) | Volym (96 rxns) |
| Vatten (HPLC-kvalitet) | NA | 0,6190 il | 71.3 | il |
| IPLEX Buffer Plus (10x) | 0.222x | 0,2000 il | 23,0 | il |
| IPLEX termineringsblandning | 1x | 0,2000 il | 23,0 | il |
| Förlängning Primer mix | 0,9400 il | 108.3 il | |
| IPLEX enzym | 1x | 0,0410 il | 4,7 | il |
| Total volym | 2,0000 il | 230,4 | il |
Tabell 3. SNP Förlängning cocktail Volymen av varje reagens för SNP förlängningssteg för en reaktion och 96 reaktioner med en 20% överhäng.
Tabell 4. SNP genotyper för varje art. 28S IGS-540, 28S IGS-649 och 01.073 till 213 är belägen på X-kromosomen, från 04.679 till 157 är på kromosom 2 och 10.313 till 052 är på kromosom 3. Hybrid genotyp (heterozygot) är gulmarkerad. Fast varianten i A. coluzzii markeras i ljusblå och fast variant A. gambiae markeras i mörkblå.
Tabell 5. SNP genotyper för KDR. Två SNP KDR # 1 och KDR # 2 utgör en genotyp för 1014: e kodon av para-genen. Den första basen är oföränderlig så det inte ingår i analysen. Känsliga homozygota genotyper är markerade i blått. Den mest resistenta L1014F homozygot genotyp markeras i mörkblått. Gul färg anger heterozygot. Den L1014 S, intermediärt resistent genotyp, visas i orange.
Tabell 6. SNP genotyper för P. falciparum och P. vivax ong>. Totalt 6 SNP används för att bestämma förekomsten av malariaparasiten. Pl-0041, Pl-1269 och Pl-1549 innehåller P. falciparum specifika alleler (G, T och T respektive). Samtidig förstärkning av de tre alleler indikerar närvaro av relativt intakt P. falciparum DNA i prov-DNA. Förstärkning av alternativa alleler (A för Pl-0041 och Pl-1269) indikerar närvaron av andra Plasmodium arter (t.ex. P. vivax, P. ovale eller P. malariae) i provet. Pf-1549 ligger i områden med många fler P. falciparum specifika flankerande regioner alltså denna SNP bara förstärks när P. falciparum är närvarande. Pl-0071, Pl-1245 och Pl-0157 innehåller P. vivax specifika alleler (G, G och T respektive). Förstärkning av alternativa alleler (A, A och C respektive) indikerar förekomst av andra Plasmodium-DNA i provet. Oinfekterade myggor har ingen förstärkning på alla 6 markörer. 
Tabell 7. SNP genotyper för 7 värdar:. Människa, kyckling, ko, hund, get, gris och får "NC" står för "Nej Call" (ingen förstärkning) i följande tabell. Observera att vissa icke-specifik förstärkning kan inträffa vid något lokus, men inte för alla SNP i en viss värd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MDA består av fem viktiga steg: PCR amplifiering, räkor alkaliskt fosfatas (SAP) reaktion, SNP förlängning, förlängningsproduktkonditione, och matrisassisterad laserdesorption / jonisering - flygtiden (MALDI-TOF) masspektrometri 33-37. Den första PCR-amplifiering steg förstärker DNA som flankerar varje SNP så att tillräckligt mall-DNA kommer att finnas tillgängliga på SNP förlängningssteg. SAP reaktionen neutraliserar oanvända dNTP som kan störa den följande SNP förlängningssteget. SNP förlängning innebär en enda förlängnings primer per SNP locus och mass modifierad terminator nukleotider. 3'-änden modifierade nukleotider förhindrar efterföljande nukleotider från att införlivas i förlängningen primer. Således massa enda bas indikerar genotypen av motsvarande SNP.
Det mest kritiska steget i att säkerställa framgång för detta tillvägagångssätt är att ha en god datauppsättning av befintliga polymorfismer i målorganismens. Vi använde väl karakteriserade SNP för artbestämning (N> 900) 10,12,38-40 och KDR (N> 1000) 15,18. De artspecifika SNP för Plasmodium identifierades från sekvensuppställningen av cytokrom b sekvenser av 123 P. falciparum, 97 P. vivax, 11 P. malariae och 18 P. ovale isolera sekvenser från Afrika som var tillgängliga på Genbank. Cytokrom b sekvenser från 7 värdarter (människa, kyckling, ko, hund, get, gris och får) samlades in från Genbank värdspecifik SNP identifiering. Baserat på denna stora kropp sekvensdata, kunde vi utforma en robust diagnostisk analys med hjälp av en analys designer programvara.
Antalet markörer varje reaktion kan rymma bestäms av den biokemiska kompatibilitet av initialsprängämnesblandningen får en tolerans för primer-dimer potential (0,9 av 0-1 skala). Författare använde standardvärdet (1; mest strikta) för falska priming potential. Relaxation för denna parameter kan potentiellt öka antalet SNP som kan analyseras i ett enda reaktions förutom den SNP som ingår i denna studie.
PCR amplifieringsstegen är robusta och typiskt inte kräver justering från den initiala testutformning. SNP förlängnings mix (tabell 3), men kan behöva ändras i relativ mängd av varje primer använder masspektrometri för att säkerställa en tillräcklig signal-brusförhållande uppnås för varje primer. Den tillhandahålls SNP förlängning primer receptet är resultatet av dessa justeringar. Kompatibilitet mellan förlängnings primers kan begränsa det totala antalet av SNP som kan vara multiplex i en enda reaktion. Eftersom reaktionsvolymen är liten (5-8 | il), behöver provplattan vara ordentligt tätad för att förhindra avdunstning under amplifieringssteg.
Denna plattform kan samtidigt göra mål upp till 35 SNP per reaktion, medan andra SNP genotypning plattformar kan accommodate över tusen SNP per reaktion 41. Med framsteg inom genomet sekvenseringsteknologi, kan man få miljontals SNP som använder nästa generations sekvense 29,42,43. Men den teknik som används här är en idealisk ansökan om studier som kräver genotypning ett relativt litet antal markörer för många (100s-1.000) individer. Ytterligare diskussion om konstruktionskrav av olika SNP genotypning plattform är täckt i tidigare studier 41.
MDA syftar till att karakterisera epidemiologiskt viktiga drag av malaria vektorer och ger en idealisk protokoll för medel genomströmning SNP genotypning analyser analysera tusentals myggor samlats in från naturliga populationer. MDA presenteras här ger (1) över en minskning av arbetstiden 90%, (2) en minskning på 60% av reagenskostnader, och (3) minskning av falska positiva / negativa genom att använda multipla markörer. Den föreslagna analysen kan förbättra epidemiologiska studier avkraftigt underlättar datainsamling. Det kan också förbättra genomet hela associationsstudier genom att karaktärisera mygga proverna med avseende på befolknings ursprung, insektsresistens, parasit mottaglighet och värd val. Slutligen kan detta MDA ger inspiration och en mall för att utforma andra multiplex analyser med hjälp av en MALDI-TOF baserade SNP genotypning plattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Drs. Anthony Cornel och Laura Norris vid UC Davis och Dr. Katharina Kreppel vid University of Glasgow för att ge mygga prover från Tanzania. Vi tackar Ms Smita Das och Dr. Douglas Norris från Johns Hopkins School of Public Health för att dela mygga prov från Zambia. Vi tackar även Mr Lee V. Millon vid Veterinär Genetics Laboratory för träning på analys design. Detta arbete stöddes av National Institute of Health bevilja R01AI 078.183 och R21AI062929.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
References
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
- Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
- Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
- Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
- Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
- Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
- White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
- Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
- Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
- Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
- Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
- Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
- Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
- Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
- Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
- Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
- Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
- Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
- Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
- Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
- Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
- Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
- Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
- Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
- Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
- Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
- Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
- Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
- Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
- Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
- Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
- Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
- Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
- Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
- Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
- Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).
