Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

Published: February 28, 2015 doi: 10.3791/52385
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Abstract

Anofel gambiae türleri kompleksi Afrika'da sivrisinek ileten önemli sıtma içerir. Bu tür, tıbbi önemi vardır, çünkü çok sayıda özellikleri tipik olarak epidemiyolojik çalışmalarda yardımcı olmak için moleküler tahliller kullanılarak karakterize edilir. Bu özellikler türler kimlik, insektisit direnci, parazit enfeksiyonu durumunu, ve ana tercihi vardır. Anopheles gambiae kompleksinin popülasyonları morfolojik olarak ayırt edilemez olduğundan, bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), geleneksel türleri tanımlamak için kullanılır. Türü bilinmektedir sonra, çok sayıda alt-deneyler, rutin daha özelliklerinin ortaya konması için uygulanır. Örneğin, bir para-geninde KDR olarak bilinen mutasyonlar DDT ve piretroid böcek karşı direnci tasdik etmektedirler. Buna ek olarak, enzime bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ya da Plasmodium paraziti DNA tespit PCR deneyleri, sivrisinek dokularda mevcut parazitlerin tespit etmek için kullanılır. Son olarak, bir combinatioPCR ve sınırlama enzim sindirimleri konakçı spesifik DNA sivrisinek bloodmeal tarama ile bir ev sahibi tercih (örneğin, hayvan, kan ile insan) aydınlatmak için kullanılır. Tek seferde 96 ya da 384 numune için tek bir çoklu reaksiyon genotipleme 33SNPs Yukarıda adı geçen bütün deneylerde bir araya getiren çoklu tespit deneyi (MDA) geliştirdik. MDA türleri Plasmodium algılama ve ana kan tanımlanmasına yönelik olarak çoklu işaretleri içerir için, yanlış pozitif ya da negatif üretme olasılığı önemli ölçüde özelliği başına sadece bir işaretçi de ihtiva önceki deneylere azaltılır. Bu sağlam ve basit tahlil maliyet-etkin ve mevcut tahlillerin zaman bir kısmını bu anahtar sivrisinek özellikleri algılayabilir.

Introduction

Anopheles arabiensis Anopheles coluzzii ve Anopheles gambiae Afrika 1 malarya iletilmesinden sorumlu başlıca vektörlerdir. Bu üç tür morfolojik 2 ayırt edilemez ve sadece moleküler deneyleri 3-9 ile ayırt edilebilir. Buna ek olarak, rutin epidemiyolojik ve nüfus genetiği çalışmaları yardım için yapılan birçok mansap tahliller vardır. Bu Türleşmenin adaları 10-12 (1), bir genotip analizi, (2) bir amino asit kodonu para geninin pozisyonda inci 1014 olmayan ayn SNP tanıyan bir genotipleme deneyi (knock-down direnç veya KDR SNP) 13 yer alır -18 (3), parazit tespiti, PCR 19-23 ve sivrisinek midguts 24,25 konak-spesifik DNA (4) taraması.

Biz amacı ile, tek bir çoklu tepkime Tüm bu deneyler birleştiren çok deteksiyon deneyi (MDA) geliştirmiştirAfrika'da sıtma vektörlerin epidemiyolojik önemli özelliklerini alyzing. MDA tahlili, çok sayıda (1) bir tür tespit edilmesi için markörler olarak kullanılmışlardır (A arabiensis, Anopheles gambiae, A. coluzzii veya üç) başka (yok) KDR SNP temsil, (2) bir insektisit direnci içerir (L1014F ve L1014S her ikisi de) iki ana sıtma parazitlerinin, (3) bulunması, Plasmodium falciparum ve P. Vivax, ve bir, kuş ve memeli altı konaklardan (4) kan kaynağı.

Geleneksel olarak, bu deneyler, farklı polimeraz zincir reaksiyonları yapılmıştır. Tüm bu deneyler geleneksel PCR platformu kullanılarak yapılır, 8-10 PCR reaksiyon deneyleri yürüten ve jel elektroforezi adımlarını eşlik gerektirir. Burada sunulan MDA yöntemi bütününde yaklaşık 5 saat sürer iken belgeleyen sonuçlarına hazırlık Her birey PCR reaksiyonu, 4-5 saat sürer. Bu, tek başına işgücü maliyetlerinde% 90 tasarruf eşdeğerdir. MDA Burada sunulan 5 $ maliyetinumune başına 33 SNP genotiplemesi için. Bu önemli ölçüde daha az pahalı bir numune başına yaklaşık 1,50 $ maliyeti tek agaroz jel bazlı tahlillerde daha azdır. MDA kapsamındaki tüm özelliklerini tespit Tahliller numune başına $ 12-15 bir maliyetle 8-10 ayrı agaroz jel bazlı testlerin en az gerektirecektir. Dahası, MDA ölçüde her parazit veya ana bilgisayar kaynak tespiti için en az üç işaretçileri kullanarak bir yanlış pozitif veya negatif üretme şansını azaltır.

Kullandığımız bir platform sıtma vektörleri ile sınırlı değildir, ancak bu tıp, veterinerlik ve temel biyoloji 26-28 gibi çok geniş bir uygulama çeşitli kullanılabilir. Derinlemesine örneklerinin büyük (100s sırasına göre) numarası içeren dernek çalışmaları veya popülasyon genetiği çalışmaları aynı anda birden fazla belirteçler için maliyet-etkin testler tarama gerektirir. Iki veya daha fazla ayrı PCR deneyleri kullanan çalışmaların çoğu düşük maliyetle daha hızlı sonuçlar için MDA uygulamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PCR Amplifikasyonu

  1. Bir 1.5ml mikrotüp tüm PCR primerleri (ek Tablo S1 bakınız) karıştırın. Her bir SNP iki primer (ileri ve geri) sahiptir. Her bir PCR primeri stok konsantrasyonu, 100 uM muhafaza emin olun. (Ek Tablo S2 bakınız) tezgah hata ve süresini azaltmak için pipetle 500-1.000 reaksiyonlar için yeterli primer karışımı olun. Arzu edildiği takdirde, -20 ° C'de tüp ve mağaza 100-200 reaksiyonlar için alikotları hazırlamak.
  2. Üreticinin protokolü (Tablo 1) 'de tarif edildiği gibi PCR kokteyli hazırlanır. 96 reaksiyonlar için hacim üzerinden% 20 bir çıkıntı içerir. Vorteks 2000 x g'de 30 saniye için PCR hafifçe kokteyl ve santrifüj içeren tüp.
  3. Bir her kuyuya, PCR kokteyli 3 ul koyun 96 plaka olmayan etekli. Bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz.
  4. Her bir çukura sivrisinek uygun genomik DNA, 2 ul ekle.
    Not: m genomik DNA elde Süreci osquito dokular (baş / göğüs, karın veya tüm vücut) Diğer edebiyatlarında 29-32 açıklanmıştır. (Baş / göğüs içinde Plasmodium) enfektif sivrisinek kan (karın) içinde Plasmodium olanlar ayırt etmek için uygun bir DNA ekstraksiyon protokolünü seçin. Biz genellikle sivrisinekler vücut parçaları (baş / göğüs veya karın) çıkarılan DNA kullanmak, yani DNA konsantrasyonu 0.05-2ng / ul değişir. Toplam DNA giriş üreticinin tavsiyesine (5-10ng / rxn) daha düşük olsa da, biz genellikle sağlam SNP tüm genom amplifikasyon olmadan DNA örneklerinin% 98 çağrıları olsun.
  5. 370 x g'de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım.
  6. PCR amplifikasyonunun yapılması için aşağıdaki PCR protokolü kullanarak: (1) 94 ° C sıcaklıkta 2 dk için, (2) 94 ° C'de 30 saniye, (3) 1 dakika 30 saniye için 56 ° C, (4) 72 ° C (5) tekrar aşama (2) - (4) 45 çevrim için, (6), 1 dakika ve 4 ° C'de beklemeye için 72 ° C.
Yurt "> 2. SAP Tedavi

  1. 96 oyuklu bir plaka içerisinde, SAP enzim çözeltisi hazırlayın (Tablo 2). Bir plaka 96 örnekleri işleyin. 96 reaksiyonlar için hacim üzerinden% 20 bir çıkıntı içerir.
  2. Vorteks 2000 x g'de 30 saniye için SAP enzim hafifçe çözeltisi ve santrifüj tüpü. Her kuyuya, SAP enzim solüsyonu 2 ul koyun. Yine, bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz.
  3. 370 x g'de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım. 40 dakika boyunca (1), 37 ° C, (2) 85 ° C, 5 dakika için enzimler inaktive edildi (3) 4 ° C'de tutun, aşağıdaki gibidir: plaka inkübe edin. Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, işleme devam etmeden önce -20 ° C'de plaka saklayın. 2 hafta içinde saklanan plaka işleyin.

3. SNP Uzatma

  1. Numune levhası, SAP, muameleden sonra dondurulur, bu devam etmeden önce, oda sıcaklığına kadar çözünmesine izin.
  2. Uzatma primer karışımı (Ek Tablo S2) hazırlayın. Her SNP bir EXTE vardırnsion astar. 500 mcM her uzatma astar stok konsantrasyonunu tutun. İsteğe bağlı olarak, -20 ° C de tüp ve mağaza 100-200 reaksiyonlar için kısım.
  3. 96 reaksiyon hacmi% 20 bir çıkıntı içerir, Tablo 3'de tarif edildiği gibi uzatma karışımı hazırlayın.
  4. Vorteks 2000 x g'de 30 saniye boyunca hafifçe uzantısı kokteyl ve santrifüj tüpü. Her kuyuya uzatma kokteyli 2 ul koyun. Yine, bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz.
  5. 370 x g'de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, levha Thermocycle. Bu noktada, kütle spektrometrisi devam ya da 2 haftaya kadar -20 ° C de plaka saklayın.

4. Klima SNP Uzatma Ürün Kütle Spektrometre Analiz Optimize

  1. Örnek plakası SNP uzantısı sonra donmuş ise, devam etmeden önce oda sıcaklığına çözülme sağlar.
  2. Bunu conta reçinenin, 15 mg transferuzatılmış kaşık kullanarak gamze plaka üzerine INER. Gamze plaka kuyu içine reçine yaymak için kazıyıcı kullanın. Reçine yaymak için gamze plaka üzerinde yan yana gelen kazıyıcı Sweep. Reçine, her kuyuda olduğundan emin olun.
  3. Kazıyıcı kullanarak gamze plaka kapalı aşırı reçine kazıyın. Reçine en az 20 dakika gamze plakasında bekletin. Reçine, gamze plaka standı örnek plakasının her bir kuyunun HPLC dereceli su 41 ul ekleyin icar ederken.
  4. Yavaşça gamze plaka üzerine örnek plaka ters, yerleştirin. Gamze plaka kuyulardan numune plaka kuyular hizalar gamze plaka küçük yuvarlak yazı, karşı örnek plaka sıfırlar emin olun.
  5. Reçine örnek plaka kuyu içine gamze plaka düşer, böylece birlikte numune plaka ve gamze plaka Holding, onları hafifçe çevirin. Reçine numune plaka içine düşer, böylece gamze plaka dokunun. Di emin tüm reçine olunmple plaka örnek plaka kuyu içine düşer. 30 saniye boyunca 3.200 xg'de plaka santrifüjleyin.
  6. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, bir döndürücü üzerinde örnek plaka döndürün. Rotator örnek plakası uzun ekseni etrafında 360 ° döndürmek gerekir.
  7. 5 dakika boyunca 3.200 xg'de örnek plaka santrifüjleyin. Bu adımdan sonra, bir sonraki adıma geçmeden önce 2 hafta -20 ° C'de örnek plaka saklayın.

5. MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi

  1. Üreticinin talimatlarına göre gibi SpectroCHIP gibi bir bioarray üzerine klimalı SNP uzatma ürünü aktarın. Bu aşama için MassARRAY Nanodispenser kullanın.
  2. Transfer tamamlandığında, tahliller ve plakalar tahlil veritabanında kurulacak nasıl tanımlar. Her plaka özel tahlil tasarımı (Ek Tablo S3) bağlanan benzersiz bir kimliğe sahiptir, öyle ki tahlil ve plakaları adlandırın.
  3. Deney ve plaka tanımlandıktan sonra, bir kütle spektrometresi kullanılarak spektrumları kazanır.

  1. Böyle Typer Analyzer veya TyperViewer (Sequenom) gibi gerçek zamanlı PCR analizi veri yorumlama yazılımı kullanarak veri analizi yapın. Her iyi örnek düzeni, kitle spektrogram içeren .xml formatında veri elde, adı da dahil olmak işaretleyici bilgileri, ilgili SNP her varyant için beklenen kütle ve herhangi bir hata veya her reaksiyon ile ilişkili uyarı mesajları. Elde edilen kütle Spektrogram'ın için Şekil 2 bakınız.
  2. . Ve her genotip için izin tolerans / Varyans (gürültü oranı büyüklüğü veya sinyali) algılama eşiği ayarlayarak SNP genotip kümeleme analizi yürütmek 3 04.707-KDR 2. SNP genotip kümeleri bir örneğini göstermektedir.
  3. Bir elektronik tablo programı içine çıkan SNP genotip aramaları verin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Türler tanımlama:

Bir örnek, üç türün biri değilse aşağıdaki 5 SNP birlikte. Üç SNP (01073-213, 04679-157 ve 10.313 üç tür (A. arabiensis, A. ve A. coluzzii gambiae) (Tablo 4) tespit -052) yükseltmek için başarısız.

insektisit direnci çıkarım için kdr genotipi:

Para voltaj-kapılı sodyum kanalının 1014 inci kodon kdr karşılık gelir. 1014 inci kodonu 2. ve 3. bazında iki SNP üç olası amino asitleri belirler. . genotiplerin olası kombinasyonları Tablo 5'te listelenen bu SNP Afrika sıtma vektörler üç türler için geçerlidir: A arabiensis A. coluzzii ve A. gambiae. Bu SNP A. yükseltmek için başarısız darlingi, bir Brezilyalı sıtma vektörü. Bu değilşaşırtıcı verilen A arasında mitokondriyal genom dizi benzerliği darlingi ve A. Üç Afrikalı sıtma vektörleri arasındaki mitokondriyal genom dizisi benzerlik% 98 üzerinde ise gambiae sadece 88,9% 'dir. Diğer türler test edilmemiştir. Biz Mali, Kamerun, Tanzanya ve Zambiya toplanan numunelerden amplifikasyon başarılı olmuştur.

Plasmodium algılama:

Sağlam Plasmodium DNA sivrisinek dokusunda varsa, biz P tespit bekliyoruz falciparum ya da P. Sivrisinek çıkarılan DNA örneği arasında Vivax spesifik DNA. türe özgü SNP 123 P. sitokrom b dizisi dizi hizalama tanımlandı falsiparum, 97 S. Vivax, 11 P. malariae 18 S. ovale Genbank'da Afrika'dan dizileri mevcut izole. Biz P ayırt benzersiz SNP genotip üreten 6 SNP tasarlanmış falciparum ya da P. vi VAX diğer Plasmodium türleri seçilmiştir (Tablo 6). Biz Mali, Kamerun, Tanzanya, Zambiya ve Brezilya'da toplanan sivrisinek örnekleri üzerinde bu testte test ve belirteçlerin bu özel seti olursa olsun sivrisinek türlerinin çalıştığını doğruladı.

Bloodmeal algılama PCR:

7 bir ev sahibi türünden (insan, tavuk, inek, köpek, keçi, domuz ve koyun) sitokrom b dizileri Gen bankasında toplanmış ve konsensüs dizileri elde edilmiştir. Her konak için bilgilendirici SNP sonra genotipleme için seçilmiştir. Biz 7 farklı hayvan (Tablo 7) kan kaynakları ile test edilmiştir.

PCR fragmanları (80-120 bp) kısa olduğundan, bu biraz bozulmuş DNA veya sivrisinek dokusu itibaren kısmen sindirilmiş bloodmeals çalışır. yanlış pozitif aramaların olasılığı önemli ölçüde ana türü için, birden fazla belirteci ile azaltılmıştır.

s "> Şekil 1,
SNP uzatma adımı için Şekil 1. Termosikler programı. Amplifikasyon döngüsü 200 (5x40) toplamıdır.

Şekil 2,
MDA için Şekil 2. Kütle-spektrogram. X ekseni SNP uzatma ürünlerin seri (Da) ve Y ekseni sinyal yoğunluğunu. Kırmızı çizgiler seçilen işaretleyici için beklenen Adi Uzatma astar kütlesini, SNP alel 1 ve alel 2 göstermektedir. Gri çizgiler MDA diğer belirteçlerin kitle beklenen göstermektedir. Bu arsa Adım 5 sonra çıktı veri dosyasından veri analiz yazılımı (Typer Analyzer veya Typer Görüntüleyici) oluşturulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

e = "always"> Şekil 3,
Şekil 3. Bireysel SNP genotip küme X ekseni Y ekseni genotip çağrı sinyalinin büyüklüğüdür SNP alel 1 ve SNP alel 2. sinyal yoğunluklarının ("Açı" olarak etiketlenen) arktanjant değer olduğunu görmek. Bu arsa veri analiz yazılımı (Typer Analyzer veya Typer Görüntüleyici) sağlanır. Herhangi bir belirli verileri fare tuşa bir tıklama ile seçilebilir ve seçilen örnek veri daire ile gösterilir. Yazılım kümeleri sağlanan kümeleme analizi kullanıcı tanımlı varyans eşik ve otomatik renk bir bialelik SNP üç genotipleri ile genotip. Burada gösterilen örnek mavi üçgen, yeşil kareler ve turuncu ters üçgen gibi homozigot A (AA) bireyler olarak heterozigotlarda (TA) olarak homozigot T (TT) bireyler gösterir. Kırmızı çevreler yok çağrı (yok büyütme) temsil eder.t = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Reaktif 5 ul konsantrasyon Hacim Hacim
(1 rxn) (96 rxns)
Su (HPLC derece) NA 0.8 ul 92.2 ul
20 mM MgCI2 ile 10x PCR Tampon 1x (2 mM MgCI2) 0.5 ul 57.6 ul
MgCl2 (25mM) ** 2 mM 0.4 ul 46.1 ul
dNTP karışımı (25 mM her) *** 500 uM 0.1 ul 11.5 ul
Primer karışımı (500 nM herbir) 100 nM 1.0 ul 115.2 ul
PCR, Enzim (5 U / ul) 1.0 U / rxn 0.2 ul 23.0 ul
Toplam Hacim: 3,0 ul 345,6 ul

Tablo 1. Multipleks PCR kokteyli tarifi., Bir reaksiyon ve% 20 çıkıntı 96 reaksiyonlar için PCR uzatma basamağı için her reaktif maddenin hacmi.

Toplam Hacim
Reaktif Cilt (1 rxn) Hacim (96 rxn)
Su (HPLC derece) 1.53 ul 176.3 ul
SAP Tampon (10x) 0.17 ul 19.6 ul
SAP enzimi (1.7 U / ul) 0.30 ul 34.6 ul
2.00 ul 230,4 ul

Tablo 2. SAP enzim çözeltisi. Bir reaksiyon ve% 20 çıkıntı 96 reaksiyonlar için karides alkalin fosfataz tedavisi için her bir reaktif hacmi.

Reaktif Kons. 9 ul Hacim (1rxn) Hacim (96 rxns)
Su (HPLC derece) NA 0,6190 ul 71.3 ul
iPLEX tamponu artı (10x) 0.222x 0,2000 ul 23.0 ul
iPLEX Fesih karışımı 1x 0,2000 ul 23.0 ul
Yayılma primer karışımı 0,9400 ul 108.3 ul
iPLEX enzimi 1x 0,0410 ul 4.7 ul
Toplam Hacim 2.0000 ul 230,4 ul

Tablo 3. SNP Uzatma kokteyl bir reaksiyon ve% 20 çıkıntı 96 reaksiyonlar için SNP uzatma aşaması için her reaktif maddenin hacmi.

Tablo 4
Her numune için Tablo 4. SNP genotip. 28S IGS-540, 28S IGS-649 ve 01073-213 X kromozomunda bulunan, 04679-157 kromozom 2 üzerinde ve 10313-052 kromozom 3. Karma genotipine olan (heterozigot) sarı vurgulanır. A. Sabit varyantı coluzzii A. açık mavi ve sabit varyantta işaretlenmiş gambiae karanlıkta işaretlenirmavi.

Tablo 5
Tablo 5. SNP KDR için genotip. İki SNP KDR 1. ve KDR 2. para geninin 1014 inci kodon için bir genotipi oluşturmaktadır. Bu deneyde dahil değildir, böylece birinci baz değişmez. Duyarlı homozigot genotip mavi işaretlenmiştir. en dirençli L1014F homozigot genotip koyu mavi işaretlenir. Sarı renk heterozigot gösterir. Orta derecede dayanıklı genotip Lynds 1014 S, turuncu gösterilmiştir.

Tablo 6
P. Tablo 6. SNP genotipleri falsiparum ve P. Vivax ong>. Toplam 6 SNP sıtma parazitinin varlığını belirlemek için kullanılır. Pl-0041, Pl-1269 ve PI-1549 P içeren falsiparum özel allel (sırasıyla, G, T ve T). Üç allel aynı anda amplifikasyon nispeten sağlam P. varlığını belirtir Örnek DNA falsiparum DNA. Alternatif alel (Pl-0041 ve PI-1269 için) amplifikasyonu örnek içindeki diğer Plasmodium türleri (örneğin, P. Vivax, P. ovale ya da P. malariae) varlığını gösterir. Pf-1549 daha birçok P. bölgelerde bulunan Bu şekilde, bu SNP yandan kuşatma bölgeleri falsiparum spesifik sadece P. yükseltilir Falciparum mevcut. Pl-0071, Pl-1245 ve PI-0157 P içeren Vivax özel allel (sırasıyla, G, G ve T). Alternatif alel (A, sırasıyla A ve C) amplifikasyonu örnek içindeki diğer Plasmodium DNA'nın varlığını gösterir. Bulaşmamış sivrisinekler 6 belirteçleri üzerine hiçbir amplifikasyon olacaktır. Tablo 7
. 7 bilgisayarlar için Tablo 7. SNP genotipleri: İnsan, tavuk, inek, köpek, keçi, domuz ve koyun "NC" aşağıdaki tabloda "Hayır Çağrı" (yok büyütme) anlamına gelir. Ancak belirli bir konağın tüm SNP için, bazı non-spesifik amplifikasyon bazı loci oluşabilir unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

- Uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometrisi 33-37 zaman PCR amplifikasyonu, karides alkalin fosfatazı (SAP) Reaksiyon SNP uzantısı, uzatma şartlandırma ve matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma MDA beş ana adımdan oluşur. İlk PCR amplifikasyon adımı yeterli şablon DNA SNP uzatma aşamasında sunulacak böylece her SNP yan DNA güçlendirir. SAP reaksiyonu aşağıdaki SNP uzatma adımı engelleyebilir kullanılmayan dNTPs nötralize eder. SNP uzatma SNP lokusu ve kitle-modifiye terminatör nükleotidler başına tek bir uzantısı astar içerir. 3'-ucu değiştirilmiş nükleotidler uzantısı primerin içerisine dahil edilmesini takip eden nükleotidini engeller. Böylece tek baz kütlesi gelen SNP genotipi gösterir.

Bu yaklaşımın başarıya ulaşmasındaki en önemli adım, hedef organizma mevcut polimorfizmlerinin iyi bir veri kümesi yaşıyors. Biz türlerin tanımlanması (N> 900) 10,12,38-40 ve kdr (N> 1.000) 15,18 için iyi karakterize SNP kullanılır. Plasmodium için türe özgü SNP 123 P. sitokrom b dizilerinin dizi hizalama tanımlandı falsiparum, 97 S. Vivax, 11 P. malariae 18 S. ovale Genbank'da kullanılabilir Afrika dizileri izole. 7 bir ev sahibi türünden (insan, tavuk, inek, köpek, keçi, domuz ve koyun) sitokrom b dizilerinin, host özgü SNP tespiti için Genbank toplanmıştır. Dizi veri bu büyük vücudunda dayanarak, biz bir deney tasarımcı yazılımını kullanarak sağlam bir tanı tahlil tasarımı başardık.

Her reaksiyon için uygun olabilir işaretlerinin sayısını dimeri potansiyeli (0-1 ölçek 0.9) primer bir tolerans verilen primer karışımının biyokimyasal uyumluluğu ile belirlenir. Yanlış hazırlama potansiyeli; Yazarlar varsayılan değer (en sıkı 1) kullanılır. RBu parametrenin elaxation potansiyel SNP çalışmaya dahil ek olarak, tek bir reaksiyonda analiz edilebilir SNP sayısını artırabilir.

PCR amplifikasyon adımları sağlam ve tipik olarak, ilk deney tasarımı ayarlama gerektirmez. SNP uzatma karışımı (Tablo 3), bununla birlikte, her bir primer için elde edilir gürültü oranı için yeterli bir sinyal sağlamak için kütle spektrometresi ile her astar nispi miktar değişiklik gerekebilir. sağlanan SNP yayılma primer tarifi bu ayarlamaların sonucudur. Uzatma primerler arasında uyumluluk, tek bir reaksiyonda multipleks olabilir SNP toplam sayısını sınırlandırabilir. Reaksiyon hacmi (5-8 ul) küçük olduğu için, numune plakası düzgün amplifikasyonu adımları sırasında buharlaşmasını önlemek için kapalı olması gerekir.

Diğer SNP genotipleme platformları accommodat olurken Bu platform, aynı anda, reaksiyon başına 35 SNP kadar puanıreaksiyonu 41 başına e binden fazla SNP. Genom dizileme teknolojisindeki gelişmeler sayesinde, bir sonraki nesil dizileme 29,42,43 kullanarak SNP milyonlarca edinebilirler. Bununla birlikte, burada kullanılan teknik, pek çok (100s-1,000) için bireyler belirteçlerin nispeten az sayıda genotipleme gerekli çalışmalar için ideal bir uygulama sağlar. Farklı SNP genotipleme platformunun tasarım kısıtlamaları Ek tartışma önceki çalışmalarda 41 kaplıdır.

MDA sıtma vektörlerin epidemiyolojik önemli özelliklerini karakterize amaçlayan ve doğal nüfus toplanan sivrisineklerin binlerce analiz orta çıktı SNP genotipleme deneyleri için ideal bir protokol sağlar. MDA reaktif maliyetlerini (2)% 60 azalma ve birden fazla belirteci kullanılarak yanlış pozitif / negatif olarak (3) azalma, çalışma zaman içinde bir% 90 azalma burada sunulan (1) içerir. Önerilen tahlil tarafından epidemiyolojik çalışmalar artırabilirsinizbüyük ölçüde veri toplama kolaylaştırılması. Ayrıca, bu nüfus kökenli açısından, insektisit direnci, parazit duyarlılık ve ev sahibi seçimi ile sivrisinek örnekleri karakterize ederek genom dernek çalışmaları artırabilir. Son olarak, bu MDA ilham ve MALDI-TOF bazlı SNP genotipleme platformu kullanan diğer multipleks tahliller tasarımı için bir şablon sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz Dr teşekkür ederim. Tanzanya'dan sivrisinek örnekleri sağlamak için Glasgow Üniversitesi UC Davis ve Dr. Katharina Kreppel Anthony Cornel ve Laura Norris. Biz Zambiya sivrisinek örnekleri paylaşmak için Halk Sağlığı Johns Hopkins School Bayan Smita Das Dr. Douglas Norris teşekkür ederim. Biz de tahlil tasarımı eğitimi için Veteriner Genetik Laboratuvarı'nda Bay Lee V. Millon teşekkür ederim. Bu çalışma R01AI 078.183 ve R21AI062929 hibe Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
  31. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  32. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  33. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  34. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  35. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  36. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  37. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  39. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  40. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  41. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  42. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  43. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Tags

Bulaşıcı Hastalıklar Sayı 96 Sivrisinek SNP genotipleme multipleks tahlil iPLEX MALDI-TOF insektisit direnci türleşme adalar türlerin tanı parazit tespiti kan kaynak tespiti ev sahibi tercihi enfeksiyon durumu
Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C.… More

Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter