Operanta förfaranden för att bedöma Behavioral Flexibilitet i råttor

Abstract

Exekutiva funktioner består av flera kognitiva processer på hög nivå som driver regel generering och beteende val. En emergent egenskap hos dessa processer är förmågan att anpassa beteendet som svar på förändringar i ens omgivning (dvs beteendeflexibilitet). Dessa processer är avgörande för normal mänskligt beteende, och kan störas i olika neuropsykiatriska tillstånd, inklusive schizofreni, alkoholism, depression, stroke och Alzheimers sjukdom. Förståelse för neurobiologi exekutiva funktioner har kraftigt fram av tillgången på djur uppgifter för att bedöma diskreta komponenter av beteende flexibilitet, särskilt strategi växling och återföring lärande. Medan flera typer av uppgifter har utvecklats, de flesta är icke-automatiserad, personalkrävande och tillåter testning av endast ett djur i taget. Den senaste tidens utveckling av automatiserade, operanta baserade uppgifter för att bedöma beteende flexibilitet effektiviserar testing, standardiserar stimulans presentation och dataregistrering, och dramatiskt förbättrar genomströmning. Här beskriver vi automatiserad strategi växling och återföring uppgifter, använder operant kamrar kontrolleras av anpassade skriftliga program. Med hjälp av dessa uppgifter, har vi visat att det mediala prefrontala cortex styr strategi växling men inte återföring lärande i råtta, liknande den dissociation observerats hos människa. Dessutom djur med en neonatal hippocampus lesion, en neuro modell av schizofreni, selektivt försämras om strategin växling uppgift men inte återföring uppgiften. Strategin skiftande uppdrag gör det också möjligt att identifiera enskilda typer av prestations fel, som alla är hänförliga till olika neurala substrat. Tillgången till dessa automatiska uppgifter och bevis som stöder de avskiljbara bidrag separata prefrontala områden, gör dem särskilt väl lämpade analyser för undersökning av grundläggande neurobiologiska processer samt drug upptäckt och screening i sjukdomsmodeller.

Introduction

Hög nivå kognitiva processer inklusive regel generation, beteende urval och utvärderingsstrategi är kollektivt som "exekutiva funktioner" eller "beteendeflexibilitet ^1." Sådana processer är avgörande för normal kognitiv funktion, och kan försämras i så skilda sjukdomar som schizofreni , alkoholism, depression, stroke och Alzheimers sjukdom ^2-7. Regleringen av exekutiva funktioner processer medieras huvudsakligen via områden i frontala cortex, inklusive dorsolaterala prefrontala cortex och orbitofrontal cortex hos människa ^8-10.

Utvecklingen av uppgifter för att bedöma verkställande funktion och / eller beteende flexibilitet i nonhuman djur, särskilt gnagare, har i hög grad ökat kunskapen om neurobiologi kognition ^11-14. Sådana uppgifter har gjort det möjligt att separat mäta distinkta komponenter av beteendeflexibilitet, inklusivestrategi växling och återföring lärande. Strategi växling avser förmågan att aktivt undertrycka en tidigare lärt åtgärdsstrategi samtidigt skaffa en ny, konkurrerande strategi, främst över stimulans mått (extradimensional shift) - t.ex., byta från att utföra en visuellt baserad diskriminering (röd vs grön, där rött är "rätt" och taktila stimuli är irrelevanta) att utföra en taktil diskriminering (jämna vs grov, där smidig är "rätt" och visuella stimuli är nu irrelevant). Å andra sidan, återföring lärande innebär också en förändring i svarsstrategi, men inom samma stimulans dimension - t.ex. i "röda vs. grönt" exempel, om rött var tidigare korrekt, en återföring skulle diktera att grönt är nu korrekt, medan taktila stimuli skulle förbli irrelevant.

Flera uppgifter har tagits fram för att undersöka beteende flexibilitet hos gnagare. Tvär maze uppgift kräver ett djur för att först lära antingen en riktning baserad regel (t.ex. "alltid sväng höger") eller en visuell baserad regel (t.ex. "alltid vända mot visuell") till en viss kriterium prestanda. Därefter djuret som krävs för att oväntat skifta antingen tvärs modalitet till den motsatta regeln (strategi växling, ursprungligen refererad till såsom en "nonreversal shift" ¹⁵⁾ eller skiftar inom modalitet till motsatt beredskaps (återföring lärande) ^13,14,16. Sådana uppgifter är känsliga för störningar i kortikala och subkortikala nätverk, som omfattar prefrontala cortex, thalamus och striatum ^{1,13,14,16-18.} En annan typ av uppmärksamhets set skiftande uppgift (ibland kallad grävuppgift) kräver utbildningsdjur för att skilja mellan två containrar som skiljer längs två eller tre stimulans dimensioner (gräva media, lukt och / eller extern konsistens). I likhet med den tvär labyrintUppgiften är djuren då skyldig att flytta antingen över dimensionerna (strategi förskjutning) eller inom samma dimension (återföring lärande), och dessa uppgifter är likaså känsliga för frontala cortex manipulationer ^11,19. En fördel med denna uppgift är att under den extra dimensionell strategi skift, är råttor presenteras med nya uppsättningar stimuli (förebilder), vilket säkerställer att prestationsnedsättningar under detta skede sannolikt hänföras till störningar i förmågan att skifta uppmärksamhets set till olika aspekter av sammansatta stimuli, snarare än en nedsatt förmåga att sluta närmar sig en viss stimulans tidigare förknippat med belöning. Dock gör denna funktion det också svårare att fastställa den särskilda karaktären hos ett underskott under en uppsättning skift.

Även de uppgifter som beskrivs ovan har dokumenterats väl i litteraturen, de båda lider av ett antal förfarande nackdelar, primärt den tid det tar att testa djur. I bådatvär labyrinten uppgift och gräv uppgiften, får endast ett djur testas vid en tidpunkt; Dessutom måste testa administreras i realtid av en särskild försöks, och kan ta upp till flera timmar per dag per djur. Dessutom är presentationen av stimuli och registrering av beteendereaktioner i båda typerna av uppgifter manuellt styrd av en försöks, och är därmed sårbara för mänskliga fel och subjektiv tolkning.

Här beskriver vi en automatiserad metod för att bedöma strategi växling och återföring lärande i råtta, med hjälp operanta procedurer som effektiviserar stimulans kontroll och presentation av data, och dramatiskt förbättra hastigheten för datainsamling och genomströmning ^20,21. De metoder som används för att forma och utbilda råttor beskrivs, liksom komponenterna i själva uppgiften och analysen av den resulterande data. Vi har funnit att i likhet med kors labyrint och gräv arbetsuppgifter, dessa automatiska uppgifter är känsliga för störningar i prefrontaloch subkortikala kretsar, liksom till en neuro manipulation som modeller schizofreni ^20-23.

Protocol

OBS: Alla förfaranden som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) på St Marys College of Maryland, eller den kanadensiska rådet om Djurvård vid University of British Columbia.

1. Djur

1. Använd vuxen Sprague-Dawley eller vuxna manliga Lång-Evans råttor.
   OBS: Även om skillnader i resultat mellan dessa båda stammar inte formellt har testats, Long-Evans-råttor tenderar att förvärva en visuell diskriminering (beskriven nedan) något snabbare än Sprague-Dawley-råttor (Floresco, opublicerade observationer).
2. Vid ankomsten i kolonin, hus vuxna råttor enstaka eller i grupper, beroende på behoven av experimentet och begränsningarna av anläggningen. Använd samma hölje för experiment där djur är mat-begränsade, för att ge bättre kontroll av födointag. Låt djuren acklimatisera till kolonin (utan hantering eller begränsning mat) under minst 3 dagar efterankomst.
   OBS: En färsk rapport har föreslagit att försöks kön kan påverka åtgärder av smärta och ångest beteende ^24, fynd som kan sträcka sig till andra stresskänsliga beteenden inklusive kognition. Över våra studier har vi inte observerat några uppenbara prestandaskillnader råttor utbildats av manliga kontra kvinnliga hanterare, även om vi inte har formellt bedömt detta.
3. Handtag djur dagligen under cirka 3-5 minuter vardera, under minst 3 dagar innan beteendetester. På den första dagen av hantering, erhålla en fri-matningsvikten för varje råtta. Målvikten för mat begränsning, om de används, kommer att vara 85 till 90% av denna fria vikt. Notera detta målvikt, t ex i ett labb anteckningsbok eller på djurets bur kort. I vissa fall kan begränsningen livsmedel inte krävas om förstärkare som används är mycket välsmakande (t.ex. sötad mjölk), även om djuren kan bli mätta för snabbt med användningen av sådana förstärkare.
4. På each av hanterings dagarna, eftersom varje djur hantering är klar, placera cirka 10-20 belönings pellets inuti djurets buren för att acklimatisera råttor (som är typiskt neophobic) till förstärkning som kommer att användas i arbetet (se avsnitt 2.1.3 nedan).
5. Under de tre dagarna av hantering, gradvis minska djurens dagliga födointaget att föra dem till deras målgrupper vikter. Var noga med att ange på buren kort eller annan dokumentation som djuren nu på en begränsad kost.
   OBS: Livsmedels begränsning särskilt krävs biträde av den institutionella IACUC eller annan tillsynsmyndighet innan några rutiner kan börja. De allmänna förfarandena nedan godkändes av författarnas respektive institutionella organ; se till att rådfråga lämpliga lokala och / eller nationella riktlinjer för ytterligare krav på enskilda institutioner.
6. Väg djuren minst två gånger i veckan för att övervaka hälsan och se till att djuren inte tappar väsentligt below målvikten. Se till att vattnet är fritt tillgänglig hela tiden.

2. Utrustning och programvara

1. Använd operant kamrar utrustade med (minst) två infällbara spakar, två stimulans lampor, en houselight och en förstärkning dispenser för dessa uppgifter.
   1. Placera spakarna på vardera sidan av ett centralt förstärkningsleveransområde med en stimulus placerad ovanför varje spak.
   2. Se till att houselight lyser hela kammaren utan att störa detektion av stimulans lampor, t.ex. placera houselight på väggen mittemot spakarna och stimulans lampor.
   3. Använd välsmakande mat (t.ex. sackaros pellets ^20,21 eller sackaroslösningar ²⁵⁾ för armering. Varhelst det anges att "förstärka djuret" nedan, leverera en 45 mg sackaros pellet eller en föreskriven mängd sackaros lösning.
2. Kontroll stimulans presentation, spak operatipå, och datainsamling via ett gränssnitt med en dator. Kontakta författarna för specifik information om uppgifts program skrivna med MED-PC-program, ett program speciellt för beteende testning och datainsamling.
   OBS: En viktig egenskap hos de program som används för beteende testning är inspelningen av viktiga variabler på ett trial-genom försök, bland annat läget på kö ljuset, spaken vald av djuret, om djuret gjort en korrekt, felaktig eller inget svar (utelämnande) och latensen att göra ett val. Dessa data är kritiska för bedömning av specifika typer av fel som gjorts under olika delar av val-sekvensen, såsom kommer att beskrivas nedan.
3. I början av förberedande utbildning, tilldela varje djur till en operant kammare där det kommer att testas varje dag under hela experimentet. Försöksdjur på ungefär samma tid på dagen under hela experimentet.
4. Ren operant kammare regelbundet (minst en gång i veckan) med soap och vatten och / eller en antimikrobiell lösning.

3. förträning

OBS: När djuren har nått sitt mål mat begränsade vikt, kan de börja forma i operant kamrarna. Förträning förfaranden tar normalt ca 10-20 dagar, med betydande variation mellan råttor. Se figur 1C för en översikt över förfarandena.

1. Shape djur till spaken press.
   1. Tåg djur under en fast ratio (FR) -1 schema för förstärkning, dvs, är en förstärkning levereras för varje spak press. Shaping kan administreras antingen med båda spakarna förlängt (en tryckning på antingen förstärks), eller på en spak i taget (t.ex. en spak per dag) med beställningen (vänster / höger) uppvägs över djur och / eller experimentella förhållanden.
      1. För att forma med båda spakarna utsträckta, fortsätter forma sessioner (en 30-minuters session per dag) tills djuren uppfyller minst krav på minst 50-60 pressar per session för två dagar i följd. Detta tar normalt ca 3-6 dagar.
      2. För att forma på varje spak för sig, fortsätter sessioner på första spaken tills djuren reagerar minst 50-60 gånger på den första spaken presenteras. Efterföljande formning sessioner bör använda det motsatta spaken tills råttan uppnår igen detta kriterium. Normalt är detta andra kriterium snabbt förvärvat efter råttor har lärt sig att trycka den första spaken.
         OBS: Forma på en spak i taget kommer att ta längre (djuret måste uppfylla kriteriet två gånger, en gång för varje spak), men kommer att se till att djuren får erfarenhet svara på och växlar mellan de två spakarna, en kritisk komponent i de uppgifter som beskrivs nedan .
2. Ge djuren infällbara spaken träningspass för att bekanta sig med förlängning och indragning av spakarna, och att se till att råttor gör relativt få försummelser (typiskt <5) när de går vidare tillhuvudsakliga testfaser i uppgiften.
   1. På varje försök, avgöra vilka spaken för att förlänga. Alternativa spak anknytningar i en pseudoslump ordning så att det finns 45 vänster spak prövningar och 45 höger spak prövningar, men inte mer än två försök i rad förlänga samma spak.
   2. Förläng vald spak. Förstärk djuret under en tryckning på denna spak inom 10 sek, varefter spaken dras tillbaka.
   3. Om djuret inte svarar inom 10 sekunder, dra i spaken och spela in ett utelämnande.
   4. Börja prövningar var 20 sekund under hela sessionen.
      OBS: Under infällbar spak utbildning, pre-exponering för stimulans lampor (belysning av både vänster- och högerstimulans lampor vid varje spak förlängning) kan användas för att minska nyhet och framträdande av lamporna, och därmed öka svårigheten att den efterföljande set-skiftande uppdrag ^20. Med hjälp av detta förfarande kommer markant öka antalet prövningar som krävs för att uppnå kriteriet performance på visuell diskriminering som beskrivs nedan, och djur kan kräva flera dagar för att lära denna regel under dessa förhållanden.
   5. Fortsätt infällbara spaken träningspass (en 30-minuters session per dag) för ett fast antal dagar, eller tills djuren uppfyller minst kriterium fem eller färre utelämnanden under två dagar i följd. Detta tar normalt ca 5-10 dagar.
      1. För studier med akuta manipulationer (t.ex. drogtester), använd ett fast antal dagar (t.ex., 5 dagar) för att säkerställa att alla råttor får liknande exponering spakarna.
3. Bedöm djur för sidopreferens.
   1. Uppförandesidopreferens testa direkt efter det senaste mötet i infällbar spak träning (på samma dag, se figur 1C). Sidopreferens Uppgiften består av sju försök, som var och en består av mellan två och åtta under prövningar åtskilda av en fast 20-sek intertrial intervall (ITI).
   2. Påvarje under rättegång, förlänga båda spakarna i kammaren i 10 sek eller tills en hävstång presssvar görs. Inte belysa stimulans lampor under denna fas av utbildningen.
   3. Förstärka ett svar på någon spak på första under rättegången mot varje försök, och spela in det som "första svar."
      1. Inte förstärker svar på samma spak på efterföljande under prövningar inom samma rättegång. Tillåt upp till sex efterföljande svar på samma spak med en rättegång, efter som ger en påtvingad under rättegång. Ett forcerat under prövning består av endast den motsatta spaken utvidgats till 10 sek eller tills ett svar görs.
   4. Efter den första svar på varje försök, förstärker det första svaret på den motsatta spaken och avsluta den rättegången. Således, inom varje prov (innehållande upp till åtta sub-försöken), är ett djur som krävs för att reagera åtminstone en gång på varje hävarm.
   5. Definiera varje djurets sida preferens som den sida på vilken den majority inledande svar ägde rum (minst fyra av sju studier).
   6. Emellertid, om ett djur reagerar oproportionerligt till en spak genom hela sessionen (definierad som större än en 2: 1-förhållande), spela in den sida som djurets preferens.
   7. Börja testa på nästa dagen i rad efter att sidopreferens testet.
      OBS: I våra erfarenheter, de flesta djur inte visa en stark sida preferens. För dem som gör det, kräver att de trycker på spaken motsatt deras fördomar under träning diskriminering respons gör att de lär de specifika svar-belöning utsedda förknippade med denna spak, snarare än att bara svara på en föredragen spak.

4. Provning

OBS: Djur kan testas i en av tre sekvenser, vilka var och en involverar två olika uppgifter. Strategi växling bedöms med hjälp av (1) Set-Shifting från Cue till Response och / eller (2) Set-Shifting från Response till Cue; reversal lärande bedöms med hjälp av (3) Åter Response. (En fjärde möjlig sekvens, Återföring av Cue, rekommenderas inte av skäl som diskuteras nedan.)

1. Allmän information om uppgifter och sekvenser.
   1. Genomför varje sekvens på varandra följande dagar. Varje sekvens kommer att ta minst två dagar (inlärning initiala diskriminering och sedan flytta eller återföring).
   2. Använd maximalt mellan 150 och 200 försök i en enda uppgift, beroende på naturen av experimentet. (Observera att du använder högre siffror försök nödvändigtvis kommer att öka den totala sessionstiden till 60 minuter eller mer, vilket kan vara en faktor att beakta för farmakologiska tester med föreningar med kortare löptider handling.)
   3. För varje sekvens, försöksdjur i en uppgift ("Set") följt av en andra uppgift ("Shift" eller "Reversal"). Försöksdjur för högst 3 dagar (dvs 450-600 försök) på varje uppgift, för högst 6 dagar totalt.
      1. Ta bortdjur som inte når kriteriet inom 3 dagar på den första uppgiften ("Set") från experimentet.
      2. För djur som inte når kriteriet inom 3 dagar på den andra uppgiften ("Shift" eller "Reversal"), tilldela en maximal poäng för försök till kriterium som representerar antalet försök upplevt (dvs. 450 prövningar för 3 dagar av 150 försök vardera).
      3. Om uppgiftsparametrar har modifierats så att kontrolldjur kan uppnå kriteriet prestanda på en enda dag, sedan ändra uppgiften så att alla råttor ges endast en testsession, och ge dem som inte når kriterium inom den tilldelade antalet försök på maximal poäng (150-200 prövningar, beroende på hur uppgiften har konfigurerats).
      4. Under skiftet eller återföring uppgift, ha djuren antingen starta en session med att utföra den nya regeln omedelbart, eller ge dem 20 "påminnelse" prövningar där de utför uppgiftenanvända regeln lärt sig under den första fasen av utbildningen, och sedan regeln växlar under sessionen ^22.
         OBS: Denna sistnämnda förfarande är särskilt användbart för experiment bedömer potentiella pro-kognitiva föreningar som kan förbättra flexibiliteten, eftersom det kan användas för att klargöra om bättre prestanda under ett skift / återföring beror specifikt till ökad flexibilitet eller nedsatt hämtning av den tidigare regeln om att kan underlätta inlärningen av ett nytt under skiftet.
2. Set-shifting: Cue Uppgift till Response Uppgift.
   1. Börja testa djur på Cue uppgiften (se figur 1A), vilket förstärker djur för att svara på spaken under belysta stimulans ljus (cue). Den Cue uppgiften är "Set" uppgift i denna sekvens.
      1. Börja varje prövning med båda spakarna indragna.
      2. Illuminate antingen vänster eller höger stimulans ljus i 3 sek; sedan förlänga båda spakarna i kammaren för 10sek eller tills ett svar inträffar.
      3. Förstärka bara ett korrekt svar på signalerade spaken. Vid ett svar på någon spak, dra spakarna.
      4. Börja prövningar var 20 sekund under hela sessionen. Pseudo bestämma ordningen på prövningar så att inte mer än två försök i rad uppträder med samma stimulans ljus (vänster eller höger) lyser.
      5. Fortsätt prövningar tills ett djur har nått kriterium (genomfört 10 korrekta svar i följd) och har genomfört minst 30 försök, eller tills 150-200 prövningar är klara utan att nå kriterium.
      6. Om kriteriet inte nås på den första dagen, testa djuret på Cue uppgiften igen på den andra dagen, men ta bort kravet på att fylla minst 30 försök. Om kriteriet inte nås på den andra dagen, testa djur på den tredje dagen efter samma procedur.
   2. Nästa dag efter att ha nått kriterium på Cue uppgiften, flytta djuren till figur 1B), vilket förstärker djur för att svara på spaken motsatt sin sida föredrar, oavsett stimulans ljus (cue) belysning. Den Response uppgiften är "Shift" uppgift i denna sekvens.
      1. Börja varje prövning med båda spakarna indragna.
      2. Illuminate antingen vänster eller höger stimulans ljus i 3 sek; sedan förlänga båda spakarna i kammaren i 10 sek eller tills ett svar inträffar. (Notera att positionen för stimulans ljuset är irrelevant för denna uppgift.)
      3. Förstärka bara ett svar på rätt position spaken (vänster eller höger, motsatsen till djurets sida preferens). Vid ett svar på någon spak, dra spakarna.
      4. Börja prövningar var 20 sekund under hela sessionen. Pseudo bestämma ordningen på prövningar så att inte mer än två försök i rad uppträder med samma stimulans ljus (vänster eller höger) lyser.
      5. Fortsätt prövningar tills ett djur har nåttkriterium (genomfört 10 korrekta svar i följd) eller tills 150 prövningar är klara utan att nå kriterium.
      6. Om kriteriet inte nås på den första dagen, testa djuret på Response uppgiften igen på den andra dagen. Om kriteriet inte nås på den andra dagen, testa djur på den tredje dagen efter samma procedur.

. Figur 1: uppgifter diskriminering Används i Set-Shifting sekvens visar denna siffra de uppgifter som utförs i Cue-till-Response-sekvens; Observera att uppgifterna är desamma, bara i motsatt ordning, i Response-till-Cue sekvensen. (A) Under inlärning visuell-cue diskriminering djuren förstärks på ett svar på spaken under belysta stimulans ljus. (B) Under inlärningssvars diskriminering, enDJUR är förstärkta för att svara på en spak (antingen vänster eller höger), oavsett position stimulans ljus. (C) Flödesschema som visar sekvensen av utbildningsfaser för en typisk strategi skiftande experiment från förträning till testning. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

3. Set-shifting: Svar på Cue.
   OBS: Denna sekvens är den som tjänar mest av tillsättningen av den visuella-cue ljus förexponering villkor för förträning ^20,21 (se steg 3.2.4 ovan). Tidigare studier har visat att förexponering råttor till lamporna under infällbar spak träning gör svaret till cue skift svårare och beroende av den mediala prefrontala cortex. Omvänt behöver prefrontala inaktive inte försämra den här typen av skift om dessa förträning förfaranden inte är anställda ^20.
   <li> Börja djurens tester på Response uppgiften, vilket förstärker djur för att svara på spaken motsatt sin sida föredrar, oavsett stimulans ljus (cue) belysning. Den Response uppgiften är "Set" uppgift i denna sekvens.
   1. Fortsätt med testning som beskrivs i steg 4.2.2 (Response uppgift) ovan.
   2. Har djuren fylla minst 30 försök på denna uppgift, eftersom det är "Set" uppgift.
   1. Nästa dag efter att ha nått kriterium på Response uppgiften, flytta djuren till Cue uppgiften, vilket förstärker djur för att svara på spaken under belysta stimulans ljus (cue). Den Cue uppgiften är "Shift" uppgift i denna sekvens.
      1. Fortsätt med testning som beskrivs i steg 4.2.1 (Cue uppgift) ovan. Behövs inte minst 30 försök avslutade när denna uppgift är "Shift" uppgift.
4. Återföring av Response.
   1. Begin djurenstesta på Response uppgiften, vilket förstärker djur för att svara på spaken motsatt sin sida föredrar, oavsett stimulans ljus (cue) belysning. Den Response uppgiften är "Set" uppgift i denna sekvens.
      1. Fortsätt med testning beskrivs i steg 4.2.2 (Response uppgift) ovan.
      2. Har djuren fylla minst 30 försök på denna uppgift, eftersom det är "Set" uppgift.
   2. Nästa dag efter att ha nått kriterium på Response uppgiften, försöksdjur på en omkastning av Response uppgiften, vilket förstärker djur för att svara på den motsatta spaken som på den första uppgiften, dvs den hävarm som motsvarar deras ursprungliga sidopreferens. Denna nya Response uppgift är "Omkastning" uppgift i denna sekvens.
      1. Fortsätt med testning som beskrivs i steg 4.2.2 ovan, med undantaget att den förstärkta spaken position är nu lika med djurets ursprungliga sidopreferens.

5. Beteende åtgärder

1. Spela försöken kriterium på både "Set" uppgiften och "Shift" uppgift. Trials till kriteriet är det viktigaste måttet på exakthet, definierad som antalet prövningar som krävs för att fylla 10 på varandra följande försök, inklusive de 10 studier. Observera att antalet utelämnanden bör vägas av denna åtgärd (t.ex. om en råtta kräver 100 prövningar för att kriteriet och gör 10 utelämnanden, är den verkliga prövningarna till kriterium 90).
2. Räkna antalet fel som görs innan kriteriet nåddes om både "Set" uppgiften och "Shift" uppgift. Fel på Criterion är ett kompletterande mått på noggrannhet som kan vara mer känsliga än Trials kriterium och påverkas inte av ökade utelämnande hastigheter.
3. För typer skift fel, ytterligare analysera de fel som gjorts på "Shift" uppgift av en uppsättning skiftande sekvens.
   1. Räkna ett fel som"Perseverative / regressiva typen" när ett djur reagerar felaktigt på "Shift" uppgift enligt regeln som var rätt på föregående dags "Set" uppgift. Använd sedan följande riktlinjer för att dela fel av denna typ i perseverative och regressiv, respektive.
      1. Dela upp "Shift" session i block om 16 konsekutiva fullständiga prövningar (inkluderar inte utelämnade prövningar). Inom varje block, identifiera vilka fel passa definitionen av denna typ, det vill säga, råttan gjort ett felaktigt svar som motsvarar den "Set" uppgift regeln. Det kommer att finnas högst 8 möjliga fel av denna typ i varje block på 16 försök.
      2. Score identifierade fel som perseverative tills mindre än sex av dem är gjorda inom ett block.
      3. Från och med nästa block och fortsätter till slutet av uppgiften, poäng fel av denna typ som regressiva.
      4. Om djuret testades i "ShIFT "uppgift på mer än en dag, fortsätter poäng fel som om blocken var sammanhängande.
   2. Räkna ett fel som "aldrig förstärkt" när ett djur reagerar felaktigt på "Shift" uppgift med ett svar som inte var korrekt på antingen "Set" eller "Shift" uppgift.
4. För typer återföring fel, ytterligare analysera de fel som gjorts på "Återföring" uppgift återföring lärande sekvens. Återföring fel bryts ner längs två dimensioner: (1) i perseverative och regressiva fel, och (2) i riktning mot-distraktor och borta-från-distraktor fel.
   1. Dividera den totala fel till perseverative och regressiva.
      1. Dela upp "Återföring" session i block om 16 konsekutiva avslutade studier. Räkna felen i varje block (maximalt 16 fel är möjligt).
      2. Betyg fel som perseverative tills färre än 10 av dem är gjorda inom ett block. </ Li>
      3. Från och med nästa block och fortsätter till slutet av uppgiften, poäng fel som regressiva.
      4. Om djuret testades i "Återföring" uppgift på mer än en dag, fortsätter scoring fel som om blocken var sammanhängande.
   2. Dividera totala fel i mot-distraktor (stimulans ljus belystes ovanför felaktiga, pressade spaken) och away-from-distraktor (stimulans ljus belystes ovan rätt, opressad spaken).
5. Registrera antalet utelämnade försök att ge en bred mått på djurets motivation nivå.
   1. Undersök utelämnande poäng efter varje daglig testsession för att utesluta tekniskt fel, vilket kan indikeras av höga utelämnande poäng.
   2. I avsaknad av felaktig utrustning, utesluter utelämnande från djur med onormalt höga antal försummelser (generellt, ≥3 standardavvikelser över medelvärdet) på vardera uppgift.
6. Rekord respons latenser genom att mäta den tid som förflutit mellan spaken förlängning och ett svar. Latenser ger ett grovt mått på motorns funktion och / eller hastighet bearbetning.

Representative Results

Akut, reversibel inaktivering av prefrontala cortex kan åstadkommas genom infusion av lokalanestetika bupivacain hydroklorid (0,75%, 0,5 l) i prelimbic regionen via en inopererad infusionskanyl ²⁰ ca 10 min före testning. Vidare kan effekterna av inaktive under antingen den första uppgiften ("Set") eller den andra uppgiften ("Shift" eller "Reversal") bedömas för att undersöka eventuella generella effekter på inlärning. Figur 2 visar resultaten av sådana inaktive på djur utför Cue-till-Response strategi skiftande sekvens. Prefrontala inaktive den första dagen, den Cue / "Set" uppgift, inte försämra prestandan (Figur 2A), vilket tyder på att den mediala prefrontala cortex är inte nödvändigt för lärande initial diskriminering. Men prefrontala inaktive på den andra dagen, Response / "Shift" uppgift, Significantly försämrad prestanda i att djur krävs en väsentligt större antal försök att nå kriteriet prestanda (Figur 2B). När prefrontala cortex inaktiverades, gjorde djuren fler perseverative liknande fel än aldrig-förstärkta fel på Skift uppgift (figur 2C). Dessa fynd replikera tidigare uppgifter om betydelsen av det mediala prefrontala cortex för strategi växling och, i synnerhet, undertrycka en tidigare lärt strategi ^13,20.

Omvänt hade djuren utbildats i Återföring av Response sekvensen inte visa denna prefrontala beroende. Djur som får inaktivering av prefrontala cortex på "Återföring" dag skilde sig inte från saltlösning infunderas djur på antingen den initiala diskriminering svar (Figur 3A) eller den efterföljande återföring (Figur 3B) ²⁰ .Dessa resultat överensstämmer med tidigare forskning som visar att the orbitofrontal cortex, inte den mediala prefrontala cortex, reglerar återföring lärande på en mängd olika uppgifter ^12,19,26, bland annat en operant uppgift liknande den som beskrivs här ^27.

Figur 2. Inaktivering av prefrontala cortex försämrar Strategi Växling. A, Trials kriterium på den ursprungliga Cue diskrimineringsuppgift ("Set") av råttor som fick infusioner av saltlösning eller bupivakain (Bupi) i mediala prefrontala cortex på uppsättningen dagen. Prefrontala inaktive hade ingen effekt på ursprungliga förvärvet. B, Trials kriterium på övergången till Response uppgiften ("Shift") efter mediala prefrontala infusioner av antingen saltlösning eller bupivakain på växel dagen. Inaktivering av prefrontala cortex nedsatt strategiskiftet till svarsuppgift.C, Olika typer av fel som begåtts av djur på skift dagen. Prefrontala inaktive före skift uppgiften ("sal-Bupi" -grupp) ledde till en ökning av perseverative liknande fel. *, P <.05 kontra koksalt-saltlösning. Denna siffra har modifierats Floresco et al. ²⁰ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Inaktivering av prefrontala cortex Lämnar Återföring Lära intakt. A, försök kriterium under grundutbildning diskriminering respons från råttor som senare skulle få infusioner av saltlösning eller bupivakain (Bupi) i mediala prefrontala cortex före återföring utbildning. Inga skillnader sågs. B, Försök kriterium under återföring av diskriminering svar efter mediala prefrontala infusioner av antingen saltlösning eller bupivakain. Prefrontala inaktive försämrade inte återföring lärande. Denna siffra har modifierats Floresco et al. ²⁰

Data som presenteras i Figur 4 ger ett exempel på hur krav råttor att utföra "påminnelse" försök med den gamla regeln innan en strategi skifte kan stöd i tolkning av data. I denna studie (Enomotor och Floresco, opublicerade observationer), råttor matchas för prestanda på att förvärva en visuell regel på dag 1 (Figur 4A). Dag 2, erhöll råttorna fordon eller 0,2 mg / kg haloperidol. I början av dagen 2 testsession, fick de 20 studier där de har fått besvara med hjälp av visuell regeln förvärvats på dag 1, varefter regeln bytte mitten session till en diskriminering svar. Såsom visas i fig 4B, denna behandling nedsatt hämtning av visuell regeln under de första 20 påminnelse prövningar av sessionen. Därefter haloperidolbehandlade råttor krävs färre prövningar för att kriteriet (Figur 4C) och gjorde färre perseverative fel (Figur 4D) om strategin skift. Observera att vi inte hade använt de påminnelse prövningar före skiftet, kan dessa data har tolkats som en förbättring i set växling av haloperidol. Dock tyder nedskrivningen under regeln hämtning fasen att dessa effekter är bättre förstås som osäkra minne för tidigare förvärvade regeln, vilket kan ha lett till sämre respons konflikt när råttorna var skyldiga att lära sig en ny regel och därmed snabbare växling.

Figur 4. Nedsatt Regel Retrieval och förenklad Set-Shifting inducerad av Haloperidol Treatment. A, Trials kriterium på visuell diskriminering från råttor som skulle ta emot fordon (saltlösning) eller dopamin D2 antagonisten haloperidol (0,2 mg / kg) innan den strategi flytta sekvensen följande dag. Djur i båda grupperna visade jämförbar pre-drogprestanda. B, I början av testning på dag 2, erhöll råttorna 20 påminnelseförsök där de krävs för att fortsätta att svara med hjälp av visuell regel från dag 1. Behandling med haloperidol minskade signifikant noggrannhet Under dessa påminnelse prövningar. C, Efter 20 påminnelse prövningar, rätts skiftade mitten session till en diskriminering svar. Haloperidol råttor krävs färre prövningar för att kriteriet under skiftet. D. Haloperidol behandling minskade också perseverative fel. Även om dessa uppgifter skulle kunna föreslå förbättrade prestanda, nedskrivning i regeln hämtning display i B Enomoto och Floresco, opublicerade observationer. *, p <.05 vs fordon.

Den neonatala ventrala hippocampus lesion (NVHL) manipulation har använts för att modellera vissa aspekter av schizofreni hos råttor ^28, särskilt kognitiva funktionshinder ^29,30. I korthet är en excitotoxisk skada administreras till hippocampus av 7 dagar gamla råttor, och testning sker hos vuxna (60 + dagar efter födseln). . Detta modeller hypotetiska utvecklings banan för schizofreni ²⁸ Figur 5 visar prestanda för NVHL och kontrollråttor på förexponerades version av Set-Shifting: Svar på Cue sekvens NVHL råttor oförbrukade på att lära den första regeln (Response / "Set. ", Figur 5A), men är dramatiskt försämrad vid växling till den nya regeln (Cue / "Shift") som visas av ökningen av antalet prövningar som krävs för att nå kriteriet (Figur 5B). Dessutom detta underskott berodde främst på en ökning av perseverative fel, som visas i figur 5C, vilket tyder prefrontala avvikelser ^20,21. Dessa resultat bekräftar tidigare fynd av nedsatt strategi skiftande i NVHL djur med hjälp av kors labyrinten uppgiften ^29.

I likhet med data från prefrontally-inaktive djur som anges ovan, var NVHL djuren inte försämras vid återföring lärande (Figur 6A, B), även om de var långsammare att svara (Figur 6C, D). Denna negativa fynd innebär att den observerade strategin skiftande underskotten inte kan hänföras till en enkel oförmåga att växla mellan stimuli ^21.

es.jpg "/>
Figur 5. Nedsatt Set-Shifting i NVHL Modell av schizofreni. Performance på förhand utsatta versionen av areal skiftande sekvens (Response-till-Cue) i NVHL och simulerade kontrolldjur. A, var NVHL djuren oförbrukade på Response ("Set") uppgift. B, men NVHL djur krävs betydligt fler prövningar än Shams att nå kriteriet på Visual Cue ("Shift") uppgift. C, fel på "Shift" dag. NVHL djur görs mer perseverative fel än simulerade djur, men skilde sig inte på regressiva eller aldrig-förstärkta fel. *, P <.05 vs bluff. Denna siffra har modifierats Placek et al., ²¹

Figur 6. Brist på NVHL Nedskrivning på Återföring lärande. C, D, NVHL djur var långsammare än Shams att svara på både "Set" och "Återföring" uppgifter. Denna siffra har modifierats Placek et al., ²¹

Slutligen har pilotförsök visade att djuren är praktiskt taget inte kan lära sig en omkastning av Cue uppgiften, dvs att trycka på spaken motsatt belysta stimulans ljus. Fem av sex testade djur avslutade 450 återföring prövningar (3 dagar) utan att nå kriterium, och den sjätte djuret krävs 418 försök (Brady, opublicerade observationer, data visas ej). Detta är sannolikt eftersom stimulans lampor är mycket framträdande och attraktiva ledtrådar som gör det mycket svårt för råttor att rikta svara ifrån dem. Således är inte reco denna testsekvensmmended.

Discussion

Utvecklingen av beteende uppgifter för att mäta högre ordningens kognitiva konstruktioner hos gnagare är viktigt att främja kunskapen om neurobiologi kognition. Med välbyggda och validerade uppgifter, kan gnagare bedömas på uppdrag av komplexitet i klass med primater eller även människor. Här har vi visat hur två aspekter av exekutiva funktioner, strategi växling och återföring lärande, kan undersökas på gnagare med hjälp av automatiserade operanta tekniker. Med hjälp av dessa automatiska uppgifter, har vi replike tidigare resultat inom tvär labyrinten och gräva uppgifter angående de neurala substrat av set-växling och återföring lära ^{11,13,18-21,27,29,} vilket tyder på att de operant uppgifterna är giltiga bedömningar av dessa konstruktioner.

Dessa automatiska uppgifter har ett antal fördelar och fördelar jämfört existerande icke-automatiserad kors labyrint och grävning arbetsuppgifter. Mest övertygande är den överlägsna takten datainsamling i automatiserad operant versionen. Varjedags träning eller testning tar bara 30-60 minuter, och är helt datorstyrd kräver minimal tillsyn av försöks. Dessutom kan flera djur testas samtidigt med ett flerkammar operant setup. Varje uppgift serien, från att forma till slutprovning, kan fyllas i cirka 2-3 veckor. En annan viktig fördel med de automatiska uppgifter är exakt kontroll av stimulans presentation, vilket minimerar risken för försöksfelet. Till exempel är den ordningsföljd som i kö plats på varje försök randomiserad och kontrollerad av datorn, snarare än av en försöks manuellt hört en trial-by-rättegången listan. Tidpunkten mellan försöken är exakt uppmätt och konsekvent, och är inte förvirrad av den tid det tar en försöksledaren att, till exempel, ta bort en råtta från kors labyrinten eller ordna om gräv behållarna. Förstärkning leveransen är automatisk och är inte föremål för försöks fel (t.ex. att glömma betekorrekta arm av en tvär labyrint). Datainsamling är likaledes förbättras, med automatisk inspelning av svarsmönster inklusive mätning av exakta svars latenser. I avsaknad av andra motoriska avvikelser, kan förändringar i svars latenser användas för att dra slutsatser bevis på förändrad processorhastighet och / eller för att bedöma graden av kognitiv komplexitet en uppgift ^21,22.

De automatiska uppgifter behåller också en viktig fördel med de kors labyrint uppgifter: förmågan att genomföra en detaljerad analys av de fel som gjorts på skift eller återföring dag. Skilja mellan set-shifting fel som replikerar den föregående dagens strategi (perseverative eller regressiva fel) och fel som representerar tidigare oprövade strategier (aldrig-förstärkta fel) kan hjälpa till att karakterisera särskilda underskott i beteendeflexibilitet. I synnerhet perseverative fel inträffar tidigt i test avspeglar ett djur oförmåga att överge den tidigare strategy, medan senare förekommande regressiva fel speglar ett djurs oförmåga att upprätthålla den nya strategin när persevera har upphört ^20. Aldrig-förstärkta fel kan indikera ett misslyckande att förvärva den nya strategin, eller en oförmåga att reagera systematiskt enligt en regel ^20. Tidigare fynd ^16,17,20 demonstrerar dissocierbara neuroanatomiska baser av dessa typer av fel är också värdefullt att tolka resultaten av dessa uppgifter.

Våra rutiner har utvecklats och optimerats för användning med råttor. Detta sagt, andra grupper har använt liknande förfaranden för att testa som skiftande förmågor hos möss ^31. Men vissa ändringar behöver anställas med möss att rymma för skillnader arter. Dessa inkluderar längre presentation av visuell ljus före spak förlängning, utbildning över flera dagar med 30 försök / dag och inkorporering av en time-out straff efter felaktiga val. Although dessa modifieringar gör denna analys mindre mottaglig för användning med farmakologiska utmaningar, kan det visa sig användbart för att bedöma kognitiv flexibilitet i genetiskt förändrade möss (även om det är oklart om dessa ändringar skulle bevara den frontala cortex känslighet uppgiften).

Naturligtvis finns det även begränsningar för dessa uppgifter. Vissa av dessa begränsningar uppstå genom automatiserad uppgiftens art, medan andra hänför sig till parametrarna för uppgiften själv. När det gäller det sistnämnda, det beskrivs här uppsättningen skiftande uppgift (liksom tvär labyrinten inställd skiftande uppgift ²⁶⁾ utnyttjar en begränsad uppsättning stimuli och reaktioner. Till skillnad från den gräva uppgiften, där nya förebilder (t.ex. obekanta dofter eller gräva media) kan användas för att bygga nya uppmärksamhets uppsättningar i varje steg ^11,19, den operanta set skiftande uppgift kräver nödvändigtvis välja mellan två stimuli som är bekanta med djur - antingen vänster vs.höger cue ljus, eller vänster kontra högerläge. Detta innebär att operanta och kors labyrint set-shifting arbetsuppgifter involverar svars konflikter samt strategi växling, även om begreppet flytta en strategi att en ny, tidigare irrelevant stimulans dimensionen bevaras ^20,23. I en liknande anteckning, set-växling och återföring operanta uppgifter som beskrivs här tillåter inte en tredje stimulans dimension, som i gräv uppgift som kan inkludera gräva media, lukt och konsistens ^11,19. Men anser vi inte att detta är en olycklig brist, eftersom den operanta set skiftande uppgift kräver fortfarande djuret för att undertrycka den tidigare relevanta strategin diskriminering och sköta ett tidigare ignorerat stimulans dimension. Dessutom verkar det tänkbart att ändringar av parametrarna utrustning och uppgift kan stödja tillägget av en tredje stimulus dimension, såsom auditiva ledtrådar eller lukt, även om dessa tillägg skulle sannolikt göra lärandet svårare och mindre ameNable att enda dag farmakologiska tester.

Slutligen är en potentiell begränsning av någon operant baserade uppgift förlusten av direkta uppgifter om råttbeteende - dvs, är försöks inte längre titta på råttan. Vi anser att de fördelar i objektivitet och datainsamling hastighet som följer av automatisering mer än kompensera för denna förlust, och kameror monterade i operant kamrarna är ett relativt enkelt sätt att återställa enskilda visuell tillgång om så önskas.

Det finns ett antal åtgärder som kan vidtas för att maximera framgång med hjälp av dessa operanta uppgifter. Först, det är viktigt att hantera djuren innan träning börjar kan inte överskattas; som med alla beteende uppgift, väl hanterade djur är lättare att arbeta med, är mindre stressade, och tenderar att producera mindre variabeldata. För det andra kan en del pilotförsök vara nödvändigt att bestämma den bästa tiden på dagen att utföra testning; vi testar under den ljusa cykeln, och upptäcker att performance är optimal när djur testas i slutet av denna cykel (t.ex. ca 16:00 för en lätt cykel slutar vid 07:00). Tredje, omsorg bör vidtas för att bekräfta att stabila prestanda etableras vid varje förträning stadium innan ett djur är avancerat till nästa steg. Till exempel, är konsekvent och robust prestanda vid infällbara spaken träningsstadiet en utmärkt prediktor för skickliga prestationer på "set" diskriminering uppgift. När det gäller utrustning, även om alla steg är automatiserade, förblir nödvändigt försöks ingripande för att bekräfta att alla komponenter är i funktionsdugligt skick. Till exempel bör en kontroll utrustning köras dagligen (eller mer än en gång per dag, om stort antal djur testas) för att se till att alla lampor, spakar och belöning leveranssystem är i drift. I synnerhet kan felfunktioner i belöning leveranssystem (särskilt pellets automater) drastiskt påverka prestanda. Ett ovanligt högt antal försummelser påen viss dag kan indikera ett problem med belöning leveransutrustning, och därmed bör kontrolleras datautgång varje dag av en försöks förtrogen med uppgiften och förväntade prestanda. I avsaknad av en felaktig utrustning, kan ett stort antal försummelser indikera andra problem med motivation eller djurs hälsa. Om ett djur är i övrigt frisk, kan mat begränsning ökas för att ta djuret till 80-85% av den fria-matningsvikten för en kort tid tills prestanda återhämtar sig.

Dessa set-skiftande och återföring uppgifter kan användas i en mängd olika experimentella paradigm. Till exempel kan effekterna av manipulationer såsom lesioner, utvecklings behandlingar, kost manipulationer, långtids farmakologisk behandling, eller genetiska modifieringar undersökas. Medan effekten av en behandling på set-växling eller återföring stadiet kan vara av primärt intresse, notera att eftersom sådana kroniska eller permanenta behandlingar nödvändigtvis måste administreras före training börjar, effekter på flera stadier av prestanda (särskilt på den initiala diskriminering eller "set") måste också undersökas ^21. Användningen av akuta manipulationer, såsom farmakologiska behandlingar eller tillfälliga neuroanatomiska inaktive, är särskilt väl lämpad för dessa uppgifter. I sådana fall är tillsatsen av en tredje grupp (såsom illustreras i figur 2) som är användbara; alltså, får den primära försöksgruppen manipulation av intresse på dagen för skift eller återföring, medan en kontrollgrupp får manipulation på dagen för inledande diskriminering eller "set" för att testa för breda effekter på lärande, och en andra kontrollgrupp erhåller inga manipulationer (eller falska behandlingar) på båda dagarna ^20,22. Notera att för sådana akuta manipulation studier, är det lämpligt att matcha råttor för prestanda under inlärningen av den ursprungliga uppsättningen och fördela dem till försöksgruppen och (andra) kontrollgrupp därefter. Denna minimizes möjligheten att behandlingsutlöst skillnader i prestanda kan förväxlas med individuella variationer i hur lätt råttor lär sig att skilja mellan stimuli. Dessutom, om ett experiment kräver testning av multipla kohorter under veckor eller månader, bör varje kohort inkluderar djur från alla försöksgrupper. Till exempel kan en studie testa effekterna av akuta farmakologiska manipulationer under ett skift kräver 48 råttor totalt 3 experimentella grupper, som testas i tre kohorter av 16 djur vardera. I detta fall bör varje kohort innehålla 5-6 råttor i varje experimentgrupp. Helst ska de statistiska analyserna omfatta en faktor som bekräftar det inte fanns några skillnader i prestanda över varje kohort av råttor. Slutligen kan dessa operant uppgifter vara särskilt användbart för att tillämpa in vivo inspelningsteknik, inklusive mikrodialys, voltametri, och elektrofysiologi, på grund av komponenter såsom kontrollerad miljö, exakta tidpunkten för stimulans Presentationshanterarenjon och svar och begränsade förflyttningar av djuren som inte är tillgängliga eller praktiskt i tvär labyrinten eller gräva arbetsuppgifter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Behavioral Chamber Package with Retractable Levers	Med Associates, Inc.	MED-008-B2	Required components include two retractable levers, two stimulus lights, houselight, and reinforcement delivery system
MED-PC software	Med Associates, Inc.	SOF-735
MPC2XL software	Med Associates, Inc.	SOF-731	Data transfer utility for importing raw data into Excel format
Dustless precision pellets, 45 mg, sugar	Bio-Serv	F0042