Abstract
בשל הרמה הגבוהה של הטרוגניות ומוטציות הגלומות בסרטן בבני אדם, טיפולי סוכן יחידים, או משטרי שילוב הממקדים את אותו המסלול, צפויים להיכשל. דגש צריך להיות ממוקם על העיכוב של מסלולים כי הם אחראים להתנגדות פנימית ו / או להתאמה לטיפול. שדה פעיל של החקירה הוא הפיתוח והבדיקה של מעכבי תיקון דנ"א המקדמים את הפעולה של, ולמנוע התנגדות ל, נפוץ כימותרפיה והקרנות. אנחנו השתמשנו בפרוטוקול רומן כדי להעריך את היעילות של עיכוב BRCA2 כאמצעי לרגישות תאים סרטניים לציספלטין התרופה המזיק DNA. חילוף חומרים בתא גידול (החמצה ונשימה) היה פיקוח בזמן אמת, לתקופה של 72 שעות כדי להתוות את יעילות טיפול בדקה אחרת דקת בסיס. בשילוב, ביצענו הערכה של תדירות גרורתי באמצעות קרום עובר עוף chorioallantoic (רמ"א) מודל של extravasation ופלישה. זהפרוטוקול כמה כתובות של החולשות של שימוש נפוץ במבחנה ובשיטות vivo להעריך משטרי טיפול בסרטן רומן. ניתן להשתמש בו, בנוסף לשיטות נפוצות כגון מבחני שגשוג תאים, מבחני מוות של תאים, ובמחקרי xenograft עכבריים vivo, להפלות באופן הדוק יותר בין יעדי מועמד וסוכנים, ובחר את המועמדים המבטיחים ביותר רק להמשך פיתוח.
Introduction
רכש התנגדות לממוקדת ו / או טיפול בסרטן ציטוטוקסיות היא בעיה קלינית חשובה שיכול להוביל לכישלון טיפול, התקפים, והגדיל את תמותת חולה 1. על רקע הרמה הגבוהה של ההטרוגניות ברוב הגידולים, זה ודאות מתמטית שגידול של מספר תאים גבוה מספיק יכיל תת-קבוצה של תאים עמידים לטיפולים בודדים או בשילוב מיקוד מסלולים מולקולריים שבו תאים אלה תלויים להישרדות 2,3. תאי גידול מסוג זה יכול להיות שנבחר באופן חיובי לטיפול ב, שמוביל להישנות מחלה. פיתוח של טיפולים חדשניים שבו זמנית למקד מנגנוני הישרדות של תאי הסרטן שונים, לפני או אחרי בחירה בתיווך טיפול, לכן חשוב מבחינה קלינית.
רמה גבוהה של חוסר יציבות הגנום ומוטציה בגנומים גידול היא מאפיין בסיסי שמבדיל את התאים סרטניים לתאי מארח שאינו סרטני 4. כתוצאה מכך, usefuאסטרטגית l כדי להגדיל את האפקטיביות של כימותרפיה פוגע ב- DNA ולמנוע את התפתחותה של התנגדות היא לעכב באופן פעיל בתיקון ה- DNA בתאי גידול 5. זהו שדה פעיל של חקירה ומגוון רחב של יעדי תיקון DNA רומן נבדקים בסביבה פרה-קלינית. מספר המולקולה קטנה או המעכבים מבוססי antisense של מטרות אלו פותחו ועוברים בדיקת 6-8. המטרה היא לזהות את המועמדים פרה-קליניים המבטיחים ביותר ולהעריך את הבטיחות והיעילות שלהם בניסויים קליניים.
העלות הגבוהה של ניסויים קליניים ואת הסיכון לכשל (עבור מגוון רחב של סיבות, כולל הערכה טרום-קלינית תת-אופטימלי) הם מכשולים אדירים להתקדמות בפיתוח הטיפולים החדשים 9. השימוש במודלים מתאימים וקפדניים פרה-קליניים להעריך כראוי חדש מטרות טיפוליות ותרופות מועמד עלול להפחית את שיעור כישלון הגבוה של ניסויים קליניים 10
כמה שיטות פרה-קליניות נפוצה בשימוש כדי להעריך את היעילות של טיפולים אנטי-סרטני רומן הם: א) מדידה של היכולת להפחית שגשוג תאים סרטניים במבחנה (מבחני התפשטות תאים), ב) הפחתה מושרה טיפול בקיבולת של תאי גידול ל מושבות בתרבית רקמת טופס (מבחני הקמת מושבה), ג) הפחתה מושרה טיפול בפעילות המטבולית של תאי גידול במבחנה (המרה חיזור-צבע), ד) אינדוקציה מושרה טיפול של מוות של תאים סרטניים במבחנה (אפופטוטיים, נימקי, autophagic, הקשורים עם מיטוזה ואחרים) 11, וה) in vivo טיפול-induced הפחתה של צמיחה או אבלציה של xenografts אדם והעכבר 12-14.
חולשה העיקרית של מבחנה השיטות המפורטות בהיא שאף אחד מהם לספק הערכה בזמן אמת מתמשכת של השפעת טיפולי מועמד. במקום זאת, הם מספקים מידע רק בנקודתי זמן שנבחרו באופן נרחב מופרדים,במהלך הטיפול. מדידות כאלה הצטמצמו יכולת לשקף את העוצמה ועיתוי של תגובות תאים סרטניים בצורה מדויקת. בvivo מודלים xenograft העכבר מוגבלים גם על ידי עלות גבוהה, משך זמן להשלמת, וסיכון של עיתוי אופטימלי מינון וטיפול (תזמון). בנוסף, יש ראיות לכך שמודלי xenograft המכרסמים הם מנבאים מוגבלים של יעילות קלינית בבני אדם, בהשוואה להערכה במבחנה של תגובות של תאים סרטניים אנושיים ראשוניים ושורות תאי גידול אנושי הוקמו להתערבויות טיפוליות מועמד 15,16.
אנחנו המצאתי פרוטוקול שילוב רומן להעריך שילובי תרופות חדשים מראש קליני, באופן שמטפל בחולשות של ההליכים נפוצים יותר מפורטים לעיל. במקום של שגשוג, יצירת מושבות, או מבחני המרת חיזור-צבע, השתמש יחידת מדידת חילוף חומרים לנתח הידבקות תא, נשימה, והחמצה בזמן אמתבמהלך תקופת הטיפול כל 17. במקביל, אנו חקרנו את ההשפעות של שילוב הטיפול בvivo באמצעות עובר עוף מודל chorioallantoic קרום (CAM) של פלישה וגרורות 18,19. אנחנו השתמשנו בשיטות אלה כדי להעריך את היכולת של מולקולת אנטיסנס קצר (ASO) מיקוד BRCA2 להגברת היעילות של ציספלטין התרופה כימותרפיות הנפוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול הבא נועד לשימוש עם תאים חסיד. שינויים נדרשים ליישם את השיטה שלאינם חסיד תאים שגודלו בהשעיה. ניסויי CAM המתוארים בפרוטוקול מיועד לשימוש עם תאים המבטאים את סמן פלואורסצנטי (למשל, GFP, RFP, וכו '). עוברי עוף בן תשעה יום נדרשים ביום 2 לפרוטוקול הניסוי לניסויי CAM.
1. הכנה וTransfection של תאים סרטניים עם Oligonucleotides antisense (ASOs)
- בינוני לשאוב מבקבוק T75 (ים) המכיל תאים של עניין, לשטוף עם 1XPBS, ולהוסיף 2 מיליליטר של 0.25% טריפסין / EDTA. הוסף 10 מיליליטר של מדיום גידול מלא לכל בקבוק ולהעביר את התאים בפתרון לשפופרת 50 מיליליטר. ספירת התאים ולהתאים את עוצמת הקול, כך שהריכוז הסופי הוא 1.0x10 5 תאים לכל מיליליטר.
- תווית שתי קבוצות של צלוחיות T25: קבוצה אחת תכיל שמונה צלוחיות, שכותרתו 1-8, ויהיה uSED לניסוי מדידת חילוף חומרים בזמן אמת; והקבוצה השנייה גם תכיל 8 צלוחיות ותשמש לניסוי CAM עובר עוף. הוסף 2 מיליליטר של תאים בפתרון לכל בקבוק ומקום בחממה (37 ° C, 5% CO 2 O / N).
- למחרת בבוקר (יום 0, הזמן 0), תווית שלושה 5 מיליליטר צינורות כדלקמן: (ASO ללא מיקוד או siRNA) שליטה, "היעד של עניין" (כלומר, ASO מיקוד או siRNA), וLipofectamine 2000 (או דומה מגיב transfection). לדלל את פתרונות המניות ASO לריכוז המתאים עם מדיום חופשי בסרום בצינור המתאים.
- להוסיף את הסכום הנדרש של מגיב transfection לצינור המתאים ודגירה במדיום סרום ללא למשך 5 דקות. מוסיף את הפתרון מגיב transfection לצינורות ASO דגירה במשך 20 דקות.
- הוסף 250 μl של פתרון מגיב transfection שליטת ASO לכל אחד מצלוחיות 1-4 בכל קבוצה, ו- 250μl של פתרון "היעד של עניין" ASO מגיב transfection לכל אחד מצלוחיות 5-8 בכל קבוצה. דגירה של 4 שעות (37 ᵒC, 5% CO 2).
- במהלך דגירה, לבצע את הפעולות מתוארות בסעיף 2.1. לאחר הדגירה, להוסיף 3 מיליליטר של מדיום מלא לכל בקבוק בקבוצת ניסוי CAM ולחזור לO החממה / N (37 ᵒC, 5% CO 2). לעבד את קבוצת ניסוי חילוף חומרים לפי התיאור בסעיף 2.2. לעבד את ניסוי CAM נקבע לפי התיאור בסעיף 4.
2. biosensor צ'יפ הכנה וזריעת תאים
- בסביבת סטרילית, בזהירות לשטוף שישה שבבי biosensor עם 400 μl של PBS. לעקר את השבבים עם 400 μl של 70% אתנול עבור 20 דקות. לשטוף שלוש פעמים עם 400 μl של PBS.
- מניחים את השבבים בתוך cultur רקמות סטרילייםמנות דואר על מנת למנוע זיהום. הנח שלושה שבבים בצלחת שכותרתו "שליטה", ושלוש בצלחת שכותרתו "יעד של עניין".
- תווית שני צינורות 50 מיליליטר כ 'שליטה' ו 'יעד של עניין ". לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף נפח מתאים של 0.25% טריפסין / EDTA. חכה עד שמתנתק monolayer ולאסוף את התאים מבקבוק אחד. להפקיד את הפתרון לתוך הצינור המתאים.
- ספירת התאים ולהתאים את עוצמת הקול, כך שהריכוז הסופי הוא 6.0x10 5 תאים / מיליליטר. צנטריפוגה ו resuspend התאים אם הריכוז הראשוני הוא נמוך מדי.
- הוסף 250 μl של פתרון התא לכל שבב biosensor בקבוצה המתאימה (עבור הסכום כולל של 1.25x10 5 תאים לכל שבב). בצע קבוצה אחת המשימה זו בכל פעם כדי למזער את הסיכון של מבלבל את השבבים. מניחים את הכלים סטריליים המכילים שבבים בתוך תא לחות על מנת למנוע אידוי, ולמקם את צ'ה לחותmber בחממה O / N (37 ᵒC, 5% CO 2).
- למחרת בבוקר (יום 1), לשאוב בזהירות בינונית מכל שבב ולהחליף אותו עם 250 μl של מדיום גידול בתוספת סרום 0.2% שור עוברי (FBS) ו1x פניצילין וסטרפטומיצין (P / S). דגירה של 4 שעות (37 ᵒC, 5% CO 2).
הכנת מערכת 3. מטבוליזם מדידה ופתרון הכנה
- במהלך הדגירה, להכין את הפתרונות הנדרשים סמים ומערכת מדידת חילוף חומרים לassay הקרוב.
הערה: מערכת מדידת חילוף חומרים מכילה בסך הכל שישה מודולים. כל מודול מכיל שבב אחד לכל ניסוי.- לחלק את assay לקבוצות הניסוי הבא: שבב אחד מכל אחת מ'השליטה 'ו' היעד של העניין "קבוצות לקבל רכב למשך assay; שני שבבים מכל קבוצה על מנת לקבל טיפול תרופתי לתקופה מוגדרת של זמן במהלךssay, ואחריו רכב במהלך תקופת המתנה.
- ללימודי רגישות סמים, לשנות את האורך, עיתוי, וריכוז של טיפול תרופתי כדי להתאים את התרופה המסוימת בשאלה.
הערה: לציספלטין, השלבים הבאים נקבעו באופן אמפירי עם תאי A549, ועשויה להשתנות בהתאם לשורת תאים. לבצע את כל השלבים עם קצב זרימת ברירת המחדל של 4 μl / min.
6 שעות של מדיום + FBS 0.2% הצמיחה ו1x P / S
24 שעות של 6 מיקרומטר ציספלטין במדיום + 0.2% FBS 1x P / S
24 שעות של מדיום + FBS 0.2% הצמיחה ו1x P / S
18 שעות של מדיום + FBS 0.2% הצמיחה ו1x P / S
4 שעות של 0.1% Triton-X
הערה: סטיות מהפעולות הבאות תדרוש חישוב כדי לקבוע את הנפח הנדרש של פתרונות בינוניים ותרופה המבוססת על קצב הזרימה ומשך הניסוי הרצויים. הסעיפים שלהלן מבוססים על הצעדים שתוארו לעיל.
- תווית ולמלא ארבע עשרה צינורות 50 מיליליטר עם 50 מיליליטר של 0.2% FBS מדיום גידולד 1x P / S. מניחים שישה במתלות צינור מערכת מדידת חילוף חומרים אחד, שש באחר, ושני הנותרים במתלים צינור שלישי שמכיל גם צינורות עם ציספלטין. לאטום את שני המדפים הראשונים עם קרום חדיר אוויר על מנת למנוע אידוי.
- הכן פתרון של 6 ציספלטין מיקרומטר (בנפח המתאים) בFBS + 0.2% בינוניים עם 1x P / S. לוותר הנפח הנדרש של פתרון ציספלטין לארבעה 50 מיליליטר צינורות שכותרתו.
- מניחים את הצינורות בארבעת חריצים שנותרו במתל צינור מדידת חילוף חומרים שלישיים. ודא שהצינורות ממוקמים בחריצים המתאימים שמתאימים לbiomodules הרצוי. לאטום את הצינורות עם קרום חדיר אוויר.
- הכן ולתייג שישה צינורות 50 מיליליטר ולמלא אותם עם 20 מיליליטר כל אחד מ0.1% פתרון Triton-X במדיום. פתרון Triton-X יהיה lyse כל תאים הנותרים ולספק ערך 'אפס' לכל שבב. מניחים את הצינורות במתלים צינור יחידת מדידת חילוף החומרים רביעי ולאטום שנינותh קרום permable אוויר על מנת למנוע אידוי מוגזם.
- טען את השבבים לbiomodules וליזום את הניסוי.
ניסוי CAM 4. טיפול תרופתי והזרקה
הערה: השלבים והליך הכנת עוברי עופות לניסוי CAM מתוארים במקום אחר 19
- בגין עיבוד CAM ניסוי 48 לאחר transfection שעות (יום 2). תת-לחלק את "שליטה" ו- "היעד של העניין" קבוצות לשתי צלוחיות לרכב, ושניים לציספלטין. לשאוב את המדיום מהצלוחיות ולחדש עם או 3 מיליליטר של מדיום חדש, או 6 מיקרומטר ציספלטין. דגירה של 6 שעות (37 ᵒC, 5% CO 2).
- לשאוב את המדיום, ולאחר מכן לשטוף וtrypsinize התאים; לאסוף את תאי trypsinized בפתרון לארבעה 15 מיליליטר צינורות שכותרתו כראוי.
- צנטריפוגה ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. להשעות מחדש את התא גלולה ב 5 מיליליטר של PBSd לספור את התאים.
- כוון את עוצמת הקול, כך שריכוז התא הסופי הוא 1.0x10 6 תאים / מיליליטר. מעביר את פתרון התא לתוך 5 מיליליטר צינורות שכותרתו להזרקה, ומניח על קרח. להפוך את הצינורות בעדינות לפני הזרקה כדי להבטיח שהתאים מתערבבים היטב.
- להפריש סכום כולל של 24 עוברי עופות (בן 9 ימים) להזרקה (6 בכל קבוצה). לבצע ההזרקה באמצעות מחט זכוכית מחוברת לצינור גמיש מחובר למזרק 1 מיליליטר. פרט ביצוע ההזרקה צריך להיות עיוור כדי קבוצת הטיפול.
- באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, להזריק 1.0x10 5 תאים בנפח של 100 μl למחזור דם הוורידים של CAM. השתמש בטכניקה איטית, פועמת להזריק נפח המלא של תאים. בעדינות טיפת אתר ההזרקה עם רך לנגב לבלום את זרימת הדם ולספוג כל דליפה. כל תווית מיכל עובר כראוי לאחר כל הזרקה.
- לאשר את קיומו וdistribution של תאי ניאון בכלי הדם של CAM לאחר הזרקה על ידי הדמיתם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימו לב לכל עוברים בו המספר של תאים סרטניים נראה נמוך, או ההפצה היא עניה.
- מניחים את עוברי העוף בתא לחות ולאחסן אותם בחממה (37 ° C, לחות 60%). חכה 7-9 ימים לפני ספירת מוקדים גרורתי.
5. גרורתי פוקוס ספירה
- במהלך תקופת הדגירה 7-9 היום, לפקח על העוברים וזורקים כל מתים. ודא שתא לחות נותר לח בכל העת במהלך תקופת הדגירה.
- באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ניאון בהגדלה 20X, לסרוק את כל פני השטח העליונים של CAM העובר בדפוס קבוע, כמו רשת.
- לספור את מספר המוקדים גרורתי בכל שדה הראייה, ואז עולה בקנה אחד המספר לסך סופי לכל עובר. עושה זאת במשך ששת העוברים בכל קבוצה תספק o מספר ממוצעתמוקדים גרורתי f לכל טיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות ונתונים מותאמים באישור העבודה שפורסמה 22.
עיכוב BRCA2 גורם לירידה בנשימה בתאי גידול ציספלטין טופל
תאים אנושיים ריאות A549 סרטן שטופלו ב- BRCA2 מיקוד ASO וציספלטין הציג ירידה מוקדמת ובלתי הפיכה בנשימה, בהשוואה לתאים שקיבלו שליטה ASO וציספלטין לבד; לאחר 24 שעות של טיפול ציספלטין ההבדל בנשימה בין BRCA2 ASO והשליטה ASO תאים שטופלו היה 39% (איור 1 א). חשוב לציין, ירידה זו בנשימה התחילה לפני ירידה לזיהוי בהידבקות תא, המצביעה על כך זה התרחש עצמאי של שינויים במספר תאים. נשימה החלה לרדת כ -10 שעות לפני הירידה הנצפית הראשונה בהדבקה, מה שמרמז שירידה בנשימה עלולה להיות אירוע מכונן שמקדים תא מוות (איור 1). לא נמצא הבדל בacidification נצפה במהלך מסגרת זמן ניסוי 72 שעות, מה שמרמז שיש BRCA2 ASO וטיפול ציספלטין לא מעט השפעה על חילוף חומרים של הגלוקוז (איור 1 ג).
עיכוב BRCA2 בשילוב עם ציספלטין טיפול מקטין את התדירות של גרורות
טופלו תאי סרטן ריאות A549 אדם עם השליטה ASO או BRCA2 ASO בנוכחותו או היעדריו של ציספלטין, ומוזרקים לתוך מחזור דם הוורידים של CAM (איור 2 א). תשעה ימים לאחר הזרקה, תאים שטופלו ב- BRCA2 ASO וציספלטין הציגו תדירות 77% נמוכות יותר של מוקדים גרורתי בהשוואה לתאים שטופלו עם השליטה ASO וציספלטין, או BRCA2 ASO לבד (איור 2). הדבר מצביע על כך שיש BRCA2 ASO וטיפול ציספלטין הפוטנציאל להפחית או למנוע נטל גרורתי בחולים עם גידולים מוצקים.
ניטור בזמן אמת 1. איור של דבקות תאים סרטניים, נשימה, והחמצה. תאי A549 היה transfected עם BRCA2 ASO, מצופה על שבבי biosensor, וטופל בציספלטין ל24hrs באמצעות מערכת גילוי Bionas. מדידות של נשימה (), דבקות (B), והחמצה (C) בוצעו כל דקות 4 על פני תקופה של 72 שעות. ורוד = לשלוט ASO, כחול = BRCA2 ASO, = ירוק לשלוט ציספלטין ASO +, = ציספלטין BRCA2 ASO + אדום. איור המותאם מעבודה שפורסמה ברשות 22. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
fre גרורתי 2. ספירת איורquency באמצעות מודל CAM עובר עוף. תאי A549 transfected עם BRCA2 ASO טופלו בציספלטין במשך 6 שעות, ולאחר מכן הוזרק למחזור הוורידים של עובר 9 יום ישן עוף (). מוקדים גרורתי (B) (דמיין באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 40X) נספרו תשעה ימים לאחר הזרקה (C). איור המותאם מעבודה שפורסמה ברשות 22. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל העלות הכרוכה והסיכון כרוך בניסויים קליניים, יש צורך לפתח טוב יותר ויותר מחמיר מתודולוגיית בדיקות פרה-קלינית להעריך כראוי משטרי טיפול אנטי-סרטני רומן. שיטות קיימים כיום נפוצה בשימוש כל חולשות התערוכה שעלולה להגביל את היכולת שלהם להבחין בין מטרות / סוכנים טיפוליים פוטנציאל מבטיחים, ואלה שעשויים להיות פחות יעילים. אנחנו המצאתי פרוטוקול להעריך גישות אנטי-סרטניות חדשות שמטפלות ברבים מהחסרונות של שיטות מסורתיות.
תכונה חשובה במיוחד של הפרוטוקול המתואר היא היכולת למדוד תגובות הסלולר בזמן אמת, ולעקוב אחר שינויים בדקה חילוף חומרים ודבקות בדקה. זה מאפשר לזיהוי השפעות סמים שיא, מינון אופטימלי והבנה מפורטת יותר של יחסי הגומלין בין המרכיבים של טיפול משולב תרופתי. במקביל, הוא מספק תובנה discreשינויים מטבוליים te בתאי סרטן, שהוא מידע שאינו מסופק על ידי ספירת תאים, אפופטוזיס, או מבחני צבע-המרה. הגבלה של assay זה היא חוסר היכולת לקבוע את הסוג של מוות של תאים שהתעוררה במהלך הטיפול תרופתי בצורה מדויקת. שינויים בכדאיות יבואו לידי ביטוי על ידי שינויים בדבקות בשבב biosensor, אבל זה לא מספק מידע לגבי אופן המוות של תאים. אפשר גם להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות טכניקות הדמיה תא כדי לקבוע נתונים מטבולים דומים, וזה יכול לשמש בנוסף לניסויים שתוארו בפרוטוקול זה 20,21.
יתר על כן, שימוש במודל CAM עובר העוף ללמוד תדירות גרורתי לאחר הטיפול הוא דרך יעילה כדי לקבוע אם יעד חדש, סמים, או שילוב תרופה מפחית את התדירות של תאי הסרטן שextravasate ו / או לפלוש לרקמות. זו שאלה רלוונטית במיוחד מCLIנקודת מבט nical, כי מחלה גרורתית גורמת שיעור גבוה של תמותה בקרב חולי סרטן. גורם מגביל הוא פוטנציאל שהטיפול תרופתי בפועל אינו מתרחש בCAM. במקום זה מתרחש vivo לשעבר ולאחר מכן התאים שטופלו מראש מוזרקים לתוך CAM. לכן, assay זה אינו מספק מידע לגבי ספיגת תרופה או הפצת in vivo. בנוסף, זריקות CAM תוך ורידי הן מאתגרות מבחינה טכנית ודורשות אימון / ניסיון משמעותי.
אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להעריך את היכולת של ASO מיקוד BRCA2 לרגישות תאים סרטניים לציספלטין התרופה המזיקה DNA. תוצאות הניסויים שלנו זיהו BRCA2 כמטרה מבטיחה להתקפה טיפולית, וגם סיפקו רציונל לפיתוח פרה-קליני נוסף של ASO BRCA2 כתרופה מועמדת. אנחנו מדמיינים פרוטוקול זה משמש לזיהוי מטרות חדשות לטיפול משולב, בעיקר בתחום המתפתח של DNעיכוב תיקון. אנחנו מרגישים פרוטוקול זה ישמש הטוב ביותר, בנוסף לטכניקות נפוצות יותר בביולוגיה של סרטן, במאמץ כדי להעריך יותר מחמיר גישות אנטי-סרטניות חדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו התאפשרה על ידי מענקים לJK ממרכזי אונטריו של אקסלנס וקרן המחקר לאונטריו.
ברצוננו להודות לSiddika Pardhan וד"ר פיטר פרגוסון לקבלת סיוע טכני בזמן צילומים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
