Abstract
نظرا لمستوى عال من عدم التجانس والطفرات الكامنة في السرطانات البشرية، والعلاجات وكيل واحدة، أو نظم الجمع التي تستهدف نفس المسار، من المحتمل أن تفشل. ولا بد من التركيز على تثبيط الممرات التي هي المسؤولة عن المقاومة الذاتية و / أو التكيف للعلاج. حقل نشط من التحقيق هو تطوير واختبار مثبطات إصلاح الحمض النووي التي تشجع على العمل، ومنع مقاومة، وتستخدم عادة العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي. استخدمنا بروتوكول رواية لتقييم فعالية BRCA2 تثبيط كوسيلة لتوعية الخلايا السرطانية على الحمض النووي الضارة سيسبلاتين المخدرات. تم رصد استقلاب الخلية السرطانية (تحمض والتنفس) في الوقت الحقيقي لمدة 72 ساعة لتحديد فعالية العلاج على أساس كل دقيقة دقيقة. في الجمع، وأجرينا تقييما لتردد المنتشر باستخدام غشاء مشيمائي جنين الدجاج (CAM) نموذج من التسرب والغزو. هذابروتوكول يعالج بعض نقاط الضعف في يشيع استخدامها في التجارب المختبرية وأساليب الجسم الحي لتقييم نظم جديدة علاج السرطان. ويمكن استخدامه بالإضافة إلى الطرق الشائعة مثل فحوصات تكاثر الخلايا، المقايسات موت الخلايا، وفي الدراسات المجراة طعم أجنبي الفئران، للتمييز بشكل وثيق بين أهداف المرشح والوكلاء، وحدد فقط المرشحين الواعدين لمزيد من التطوير.
Introduction
اكتسبت مقاومة لاستهداف و / أو علاج السرطان السامة للخلايا هي مشكلة السريرية الهامة التي يمكن أن تؤدي إلى فشل العلاج، الانتكاس، وزيادة معدل وفيات مرضى 1. ونظرا لمستوى عال من عدم التجانس في معظم الأورام، بل هو اليقين الرياضي التي ورم من عدد الخلايا عالية بما فيه الكفاية سوف تحتوي مجموعة فرعية من خلايا مقاومة للعلاج واحدة أو مجتمعة استهداف المسارات الجزيئية التي تعتمد تلك الخلايا من أجل البقاء 2،3. الخلايا السرطانية هذه يمكن تحديدها بشكل إيجابي للأثناء العلاج، مما يؤدي إلى تكرار المرض. تطوير علاجات جديدة تستهدف في الوقت نفسه آليات بقاء الخلايا السرطانية المختلفة، سواء قبل أو بعد اختيار بوساطة العلاج، وبالتالي من المهم سريريا.
وهناك مستوى عال من عدم الاستقرار الجينوم وطفرة في الجينوم الورم هو سمة الأساسية التي تميز الخلايا السرطانية من خلايا المضيف غير ورم-4. ونتيجة لذلك، ويلقون مفيدةاستراتيجية لتر إلى زيادة فعالية العلاج الكيميائي الضارة DNA ومنع تطور المقاومة لمنع بنشاط إصلاح الحمض النووي في الخلايا السرطانية 5. هذا هو الحقل النشط التحقيق ومجموعة متنوعة من الأهداف إصلاح الحمض النووي جديدة يجري استكشافها في إعداد ما قبل السريرية. وقد تم تطوير عدد من جزيء صغير أو مثبطات القائم على العقاقير من هذه الأهداف وتشهد اختبار 6-8. والهدف هو التعرف على المرشحين ما قبل السريرية الواعدة وتقييم سلامتها وفعاليتها في التجارب السريرية.
ارتفاع تكلفة التجارب السريرية ومخاطر الفشل (لمجموعة متنوعة من الأسباب بما في ذلك تقييم ما قبل السريرية دون المستوى الأمثل) هي عقبات كأداء أمام التقدم في تطوير علاجات جديدة 9. استخدام نماذج مناسبة وصارمة ما قبل السريرية لتقييم كاف الأهداف العلاجية والأدوية المرشحة الجديد قد يقلل من نسبة الفشل عالية من التجارب السريرية 10
بعض أساليب ما قبل السريرية تستخدم عادة لتقييم فعالية نظم جديدة مضادة للسرطان هي: أ) قياس القدرة على الحد من انتشار الخلايا السرطانية في المختبر (المقايسات تكاثر الخلايا)، ب) تخفيض الناجم عن العلاج في قدرة الخلايا السرطانية ل المستعمرات زراعة الأنسجة شكل (المقايسات تشكيل مستعمرة)، ج) تخفيض الناجم عن العلاج في النشاط الأيضي الخلايا السرطانية في المختبر (تحويل الأكسدة صبغ)، د) التي يسببها العلاج تحريض في المختبر موت الخلايا السرطانية (أفكارك، نخرية، ذاتية البلعمة، ويرتبط مع الانقسام، وغيرها) 11، وه) في الجسم الحي الحد من النمو أو الاجتثاث من الفأر والإنسان xenografts 12-14 العلاج التي يسببها.
ومن أوجه الضعف الرئيسية للفي المختبر الطرق المذكورة هو أن أيا منها لا توفر المستمر التقييم في الوقت الحقيقي لتأثير العلاجات مرشح. بدلا من ذلك، أنها توفر المعلومات فقط في المختارة، نقاط زمنية متباعدة-أثناء العلاج. وقد تضاءلت هذه القياسات القدرة على التفكير بدقة حجم وتوقيت استجابات الخلايا السرطانية. في الجسم الحي ونماذج الماوس طعم أجنبي محدودة أيضا التكلفة العالية، وطول الوقت لإكمال، وخطر دون المستوى الأمثل الجرعات والعلاج توقيت (جدولة). وبالإضافة إلى ذلك، هناك أدلة على أن نماذج القوارض طعم أجنبي هي تنبؤ محدودة من الفعالية السريرية في البشر، مقارنة مع التقييم في المختبر من ردود الخلايا السرطانية الإنسان الأساسية وخطوط الخلايا السرطانية البشرية التي أنشئت لمرشح التدخلات العلاجية 15،16.
نحن وضعت بروتوكولا تركيبة جديدة لتقييم مجموعات دواء جديد قبل سريريا، بطريقة تعالج نقاط الضعف في الإجراءات أكثر شيوعا المذكورة أعلاه. في مكان الانتشار، تشكيل مستعمرة، أو الأكسدة صبغ المقايسات التحويل، نحن تستخدم وحدة قياس التمثيل الغذائي لتحليل التصاق الخلية، والتنفس، وتحمض في الوقت الحقيقيخلال فترة العلاج كاملة 17. في وقت واحد، ونحن التحقيق في الآثار المترتبة على الجمع بين العلاج في الجسم الحي باستخدام الجنين الدجاج مشيمائي غشاء (CAM) نموذج من الغزو والانبثاث 18،19. استخدمنا هذه الأساليب لتقييم قدرة قليل النوكليوتيد العقاقير (ASO) تستهدف BRCA2 لتحفيز فعالية يشيع استخدامها سيسبلاتين المخدرات العلاج الكيميائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تصميم بروتوكول التالية للاستخدام مع الخلايا الملتصقة. ويطلب تعديلات على تطبيق طريقة إلى الخلايا غير ملتصقة تزرع في تعليق. وقد صممت هذه التجارب CAM موضح في البروتوكول للاستخدام مع الخلايا التي تعبر عن علامة فلوري (على سبيل المثال، GFP، RFP، الخ). مطلوبة الأجنة تسعة أيام الدجاج القديمة في يوم 2 من البروتوكول التجريبي للتجارب CAM.
1. إعداد وترنسفكأيشن من الخلايا السرطانية مع العقاقير [أليغنوكليوتيد] (خدمات الإيدز)
- نضح المتوسطة من T75 قارورة (ق) التي تحتوي على خلايا الفائدة، ويغسل مع 1XPBS، وإضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين / EDTA. إضافة 10 مل من متوسط النمو الكامل لكل قارورة ونقل الخلايا في حل لأنبوب 50 مل. عد الخلايا وضبط مستوى الصوت بحيث التركيز النهائي هو 1.0x10 5 خلايا لكل مل.
- التسمية مجموعتين من قوارير T25: مجموعة واحدة وسيتضمن ثمانية قوارير، وصفت 1-8، وستكون شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لفي الوقت الحقيقي تجربة قياس التمثيل الغذائي. وستحتوي المجموعة الثانية أيضا 8 قوارير وسوف تستخدم للتجربة CAM الجنين الدجاج. إضافة 2 مل من الخلايا في حل كل قارورة ووضعه في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2 O / N).
- في صباح اليوم التالي (يوم 0، 0 الوقت)، والتسمية ثلاثة 5 مل أنابيب النحو التالي: التحكم (عدم استهداف ASO أو سيرنا)، 'الهدف من الفوائد "(أي استهداف ASO أو سيرنا)، وLipofectamine عام 2000 (أو ما شابه ترنسفكأيشن الكاشف). تمييع الحلول الأسهم ASO إلى التركيز المناسب مع المتوسطة مجانا المصل في أنبوب المناسب.
- إضافة المبلغ المطلوب من كاشف ترنسفكأيشن إلى أنبوب المناسب واحتضان في المصل خالية متوسطة لمدة 5 دقائق. إضافة محلول كاشف ترنسفكأيشن للأنابيب ASO واحتضان لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 250 ميكرولتر من السيطرة ASO حل كاشف ترنسفكأيشن إلى كل من قوارير 1-4 في كل مجموعة، و 250ميكرولتر من "الهدف من الفوائد" ASO حل كاشف ترنسفكأيشن إلى كل من قوارير 5-8 في كل مجموعة. احتضان لمدة 4 ساعات (37 ᵒC، 5٪ CO 2).
- أثناء الحضانة، وتنفيذ الخطوات الموضحة في القسم 2.1. بعد الحضانة، إضافة 3 مل من المتوسط الكامل على كل قارورة في مجموعة التجربة CAM والعودة إلى الحاضنة O / N (37 ᵒC، 5٪ CO 2). معالجة مجموعة تجربة التمثيل الغذائي وفقا لوصف في القسم 2.2. معالجة التجربة CAM تعيين وفقا للوصف في الفرع 4.
2. جهاز الاستشعار البيولوجي إعداد رقاقة والبذر الخلية
- في بيئة معقمة، وغسل بعناية ستة رقائق جهاز الاستشعار البيولوجي مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. تعقيم رقائق مع 400 ميكرولتر من الايثانول 70٪ لمدة 20 دقيقة. يغسل ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- وضع رقائق داخل الثقافيه الأنسجة العقيمةأطباق البريد لمنع التلوث. وضع ثلاث رقائق في طبق المسمى "السيطرة"، وثلاثة في طبق المسمى "الهدف من الفائدة.
- تسمية اثنين من 50 مل أنابيب باسم 'السيطرة' و 'الهدف من الفائدة. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة حجم مناسب من 0.25٪ التربسين / EDTA. الانتظار حتى يفصل أحادي الطبقة وجمع الخلايا من كل قارورة. إيداع الحل في أنبوب المناسب.
- عد الخلايا وضبط مستوى الصوت بحيث التركيز النهائي هو 6.0x10 5 خلية / مل. الطرد المركزي و resuspend الخلايا إذا كان تركيز أولي منخفض جدا.
- إضافة 250 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل رقاقة جهاز الاستشعار البيولوجي في المجموعة المناسبة (أي ما مجموعه 1.25x10 5 خلايا لكل رقاقة). تنفيذ هذه المهمة مجموعة واحدة في وقت واحد لتقليل مخاطر الخلط بين رقائق البطاطس. وضع أطباق العقيمة التي تحتوي على رقائق داخل غرفة الرطوبة لمنع التبخر، ووضع تشا الرطوبةmber في الحاضنة O / N (37 ᵒC، 5٪ CO 2).
- في صباح اليوم التالي (يوم 1)، نضح بعناية متوسطة من كل رقاقة واستبدالها مع 250 ميكرولتر من النمو المتوسط تستكمل مع المصل بنسبة 0.2٪ بقري جنيني (FBS) والبنسلين والستربتومايسين 1X (P / S). احتضان لمدة 4 ساعات (37 ᵒC، 5٪ CO 2).
3. الأيض قياس تحضير النظام وإعداد الحل
- أثناء الحضانة، وإعداد الحلول المخدرات المطلوبة ونظام القياس الأيض للمقايسة القادم.
ملاحظة: يحتوي نظام قياس التمثيل الغذائي ما مجموعه ست وحدات. كل وحدة تستوعب رقاقة واحدة في التجربة.- تقسيم الفحص في المجموعات التجريبية التالية: رقاقة واحدة من كل من "السيطرة" و "الهدف من الفوائد" مجموعات لاستقبال السيارة لمدة الفحص. اثنين من رقائق من كل مجموعة لتلقي العلاج من تعاطي المخدرات لفترة محددة من الوقت خلال لssay، تليها سيارة خلال الفترة من الاخفاق.
- للدراسات توعية المخدرات، تعديل طول، والتوقيت، وتركيز العلاج من تعاطي المخدرات لتتناسب مع دواء معين في السؤال.
ملاحظة: للحصول على سيسبلاتين، وتم تحديد الخطوات التالية تجريبيا مع خلايا A549، ويمكن أن تختلف اعتمادا على خط الخلية. تنفيذ كافة مراحل مع معدل التدفق الافتراضي من 4 ميكرولتر / دقيقة.
6 ساعات من النمو المتوسطة + FBS 0.2٪ و1X P / S
24 ساعة من 6 ميكرومتر سيسبلاتين في المتوسط + 0.2٪ FBS 1X P / S
24 ساعة من النمو المتوسطة + FBS 0.2٪ و1X P / S
18 ساعة من النمو المتوسطة + FBS 0.2٪ و1X P / S
4 ساعات من 0.1٪ تريتون-X
ملاحظة: سوف الانحرافات عن هذه الخطوات تتطلب حسابية لتحديد حجم المطلوب من حلول متوسطة والمخدرات على أساس معدل التدفق المطلوب ومدة التجربة. وتقوم الأقسام التالية على الخطوات الموضحة أعلاه.
- التسمية وملء أربعة عشر 50 مل الأنابيب مع 50 مل من النمو المتوسطة + 0.2٪ FBS لد 1X P / S. وضع ستة في واحد قياس التمثيل الغذائي أنبوب نظام الرف، ستة في بلد آخر، والباقيين في رفوف أنبوب الثالث الذي يحتوي أيضا على أنابيب مع سيسبلاتين. ختم رفوف الأولين مع غشاء منفذ الهواء لمنع التبخر.
- يعد حل من 6 ميكرومتر سيسبلاتين (من حجم مناسب) في المتوسط + 0.2٪ FBS مع 1X P / S. الاستغناء عن حجم المطلوب من حل سيسبلاتين إلى أربعة وصفت 50 مل أنابيب.
- وضع أنابيب في فتحات الأربعة المتبقية في عملية التمثيل الغذائي الثالث أنبوب قياس الرف. ضمان أن يتم وضع الأنابيب في فتحات المناسبة التي تتوافق مع biomodules المطلوب. ختم الأنابيب مع غشاء نفاذية الهواء.
- إعداد وتسمية ستة 50 مل أنابيب وشغل لهم مع 20 مل لكل من 0.1٪ تريتون-X الحل في المتوسط. فإن الحل تريتون-X ليز أي الخلايا المتبقية وتوفير قيمة "الصفر" لكل رقاقة. وضع الأنابيب في قياس التمثيل الغذائي الرابع أنبوب حدة رف وختم خفة دمح غشاء permable الهواء لمنع التبخر المفرط.
- تحميل رقائق في biomodules وبدء التجربة.
4. CAM تجربة العلاج من تعاطي المخدرات وحقن
ملاحظة: الخطوات والإجراءات لإعداد أجنة الدجاج لإجراء تجربة CAM موصوفة في أماكن أخرى 19
- بدء معالجة CAM تجربة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن (يوم 2). تقسيم الفرعي "السيطرة" و "الهدف من الفوائد" مجموعة إلى قسمين قوارير للمركبة، واثنين من لسيسبلاتين. نضح المتوسطة من قوارير وتجديد مع أي 3 مل من المتوسط الطازجة، أو 6 ميكرومتر سيسبلاتين. احتضان لمدة 6 ساعات (37 ᵒC، 5٪ CO 2).
- نضح المتوسطة، ثم غسل ويعرض للتريبسين الخلايا. جمع الخلايا trypsinized في حل إلى أربعة وصفت بشكل مناسب 15 مل الأنابيب.
- الطرد المركزي وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. اعادة تعليق بيليه خلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني لد عد الخلايا.
- ضبط مستوى الصوت بحيث تركيز الخلية النهائي هو 1.0x10 6 خلية / مل. نقل الحل خلية في المسمى 5 مل أنابيب للحقن، ووضع على الجليد. عكس أنابيب بلطف قبل الحقن للتأكد من أن الخلايا هي مختلطة أيضا.
- تخصيص ما مجموعه 24 أجنة الدجاج (9 أيام من العمر) للحقن (6 لكل مجموعة). إجراء الحقن باستخدام إبرة الزجاج تعلق على أنبوب مرن متصلة حقنة 1 مل. يجب أعمى الفرد أداء الحقن لمجموعة العلاج.
- باستخدام مجهر ستيريو، وضخ 1.0x10 5 الخلايا في حجم 100 ميكرولتر إلى الدورة الدموية الوريدية للCAM. استخدام بطيئة، تقنية النبض لحقن حجم كامل من الخلايا. ربت بلطف موقع الحقن مع مسح لينة لوقف تدفق الدم وامتصاص أي تسرب. تسمية كل حاوية الجنين بشكل مناسب بعد كل حقنة.
- تأكد من وجود وزعتهيسود تبادل الخلايا الفلورسنت في الأوعية الدموية للCAM بعد الحقن من خلال وضع تصور لهم باستخدام المجهر الفلورسنت. يحيط علما أي الأجنة التي يبدو أن عدد الخلايا السرطانية منخفضة، أو توزيع ضعيف.
- وضع أجنة الدجاج في غرفة الرطوبة وتخزينها في حاضنة (37 ° C، الرطوبة 60٪). الانتظار 7-9 أيام قبل تعداد البؤر النقيلي.
5. النقيلي التركيز التعداد
- خلال فترة الحضانة 7-9 يوم، ومراقبة الأجنة وتجاهل أي منها ميتة. تأكد من أن غرفة الرطوبة تبقى رطبة في جميع الأوقات خلال فترة الحضانة.
- باستخدام مجهر ستيريو الفلورسنت في 20X التكبير، مسح السطح العلوي بأكمله للCAM الجنين في، نمط الشبكة مثل منتظم.
- حساب عدد من البؤر المنتشر في كل مجال الرؤية، ثم حصر عدد ليصبح المجموع النهائي في الجنين. سوف تفعل ذلك لأجنة ستة في كل مجموعة تقديم متوسط عدد سبؤر النقيلي و لكل معاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج والأرقام تكييفها بإذن من الأعمال المنشورة 22.
BRCA2 تثبيط يؤدي الى انخفاض في التنفس في سيسبلاتين تعامل الخلايا السرطانية
الخلايا السرطانية A549 رئة الإنسان تعامل مع BRCA2 استهداف ASO وأظهرت سيسبلاتين انخفاضا المبكر والذي لا رجعة فيه في التنفس، مقارنة مع الخلايا التي تلقت تحكم ASO وسيسبلاتين وحدها؛ بعد 24 ساعة من العلاج سيسبلاتين الفرق في التنفس بين BRCA2 ASO والسيطرة ASO تعامل الخلايا كان 39٪ (الشكل 1A). الأهم من ذلك، بدأ هذا الانخفاض في التنفس قبل قطرة كشف في التصاق الخلايا، مما يوحي بأن هذا حدث مستقلة عن التغيرات في عدد الخلايا. بدأ التنفس لخفض ما يقرب من 10 ساعة قبل أول انخفاض ملحوظ في التصاق، مما يدل على أن الانخفاض في التنفس قد يكون حدثا التكويني الذي يسبق موت الخلايا (الشكل 1B). لا فرق في ميلانوقد لوحظ idification خلال 72 ساعة التجربة الإطار الزمني، مما يوحي بأن BRCA2 ASO والعلاج سيسبلاتين ديه القليل لأي تأثير على استقلاب الجلوكوز (الشكل 1C).
تثبيط BRCA2 جنبا إلى جنب مع العلاج سيسبلاتين يقلل من تواتر ورم خبيث
تم علاج الخلايا السرطانية A549 رئة الإنسان مع التحكم ASO أو BRCA2 ASO في وجود أو عدم وجود سيسبلاتين، وحقنه في الدورة الدموية الوريدية للCAM (الشكل 2A). تسعة أيام بعد الحقن، وخلايا تعامل مع BRCA2 ASO وسيسبلاتين أظهرت أدنى تردد 77٪ من البؤر النقيلي مقارنة مع الخلايا المعالجة مع التحكم ASO وسيسبلاتين، أو BRCA2 ASO وحدها (الشكل 2B). هذا يشير إلى أن BRCA2 ASO والعلاج سيسبلاتين لديه القدرة على تقليل أو منع العبء المنتشر في المرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة.
و transfected الشكل مراقبة 1. في الوقت الحقيقي لتمسك الخلايا السرطانية، والتنفس، وتحمض. خلايا A549 مع BRCA2 ASO، مطلي على رقائق جهاز الاستشعار البيولوجي، وتعامل مع سيسبلاتين ل24hrs على استخدام نظام ديسكفري Bionas. وأجريت قياسات (A) التنفس، (ب) التمسك، و (C) تحمض كل 4 دقائق على مدى 72 ساعة. الوردي = السيطرة على ASO والأزرق = BRCA2 ASO، = الخضراء تسيطر ASO + سيسبلاتين والأحمر = BRCA2 ASO + سيسبلاتين. الرقم مقتبس من الأعمال المنشورة بإذن 22. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تعداد النقيلي الصحائفquency باستخدام نموذج CAM الجنين الدجاج. خلايا A549 transfected مع BRCA2 ASO عولجوا سيسبلاتين لمدة 6 ساعة، ثم حقنها في الدورة الدموية الوريدية من جنين الدجاج القديم اليوم 9 (A). بؤر النقيلي (B) (تصور باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف 40X) احصي تسعة أيام بعد الحقن (C). الرقم مقتبس من الأعمال المنشورة بإذن 22. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظرا لتكلفة الكامنة والمخاطر المرتبطة التجارب السريرية، هناك حاجة لتطوير أفضل وأكثر صرامة منهجية اختبار ما قبل السريرية لتقييم كاف نظم العلاج المضاد للسرطان الرواية. الحالية تقنيات شائعة الاستخدام جميع نقاط الضعف المعرض التي قد تحد من قدرتها على التمييز بين الأهداف العلاجية المحتملة واعد / وكلاء، وتلك التي قد تكون أقل فعالية. نحن وضعت بروتوكولا لتقييم نهج مكافحة السرطان الجديدة التي تتناول العديد من أوجه القصور في الطرق التقليدية.
وهناك ميزة مهمة بشكل خاص للبروتوكول وصفها هي القدرة على قياس الاستجابات الخلوية في الوقت الحقيقي، وتتبع التغيرات في التمثيل الغذائي والالتزام دقيقة بدقيقة. وهذا يسمح للتعرف على آثار المخدرات الذروة، الجرعات المثلى وفهم أكثر تفصيلا للتفاعل بين مكونات العلاج الدواء المركب. في وقت واحد، فإنه يوفر نظرة ثاقبة discreالتعديلات التمثيل الغذائي الشركة المصرية للاتصالات في الخلايا السرطانية، والتي هي المعلومات التي لا يتم توفيرها من قبل العد الخلية، وموت الخلايا المبرمج، أو المقايسات صبغ التحويل. وجود قيود على هذا الاختبار هو عدم القدرة على تحديد دقيق لنوع من موت الخلايا التي تحدث أثناء العلاج من تعاطي المخدرات. سوف تنعكس التغييرات في جدوى بسبب التغيرات في التمسك رقاقة جهاز الاستشعار البيولوجي، ولكن هذا لا يوفر معلومات حول طريقة موت الخلايا. ومن الممكن أيضا استخدام مضان المجهر والعيش تقنيات التصوير خلية لتحديد البيانات الأيض مماثلة، وهذه يمكن استخدامها بالإضافة إلى التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول 20،21.
وعلاوة على ذلك، واستخدام الدجاج الجنين نموذج CAM لدراسة التردد المنتشر بعد العلاج هو وسيلة فعالة لتحديد ما إذا كان هدف جديد، المخدرات، أو تركيبة الدواء يقلل من تواتر الخلايا السرطانية التي يتسرب و / أو غزو الأنسجة المحيطة. هذا هو السؤال أهمية خاصة من المبادرة القطريةnical جهة نظر، لأن المرض المنتشر يسبب نسبة عالية من الوفيات بين مرضى السرطان. ومن العوامل التي تحد محتمل هو أن العلاج من تعاطي المخدرات الفعلية لا يحدث في CAM. بدلا من ذلك فإنه يحدث خارج الحي ومن ثم يتم حقن الخلايا المعالجة المسبقة في CAM. لذلك، هذا الاختبار لا يقدم معلومات بشأن امتصاص الدواء أو التوزيع في الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، والحقن في الوريد CAM تشكل تحديا تقنيا وتتطلب ممارسة هامة / تجربة.
استخدمنا هذا البروتوكول لتقييم قدرة ASO استهداف BRCA2 لتوعية الخلايا السرطانية إلى DNA سيسبلاتين المخدرات الضارة. نتائج تجاربنا حددت BRCA2 كهدف واعدة للهجوم العلاجية، وقدمت أيضا الأساس المنطقي لمزيد من التطوير ما قبل السريرية للBRCA2 ASO كدواء مرشح. نحن نتصور هذا البروتوكول المستخدمة لتحديد أهداف رواية للعلاج الجمع، وخاصة في مجال المزدهرة من DNوتثبيط إصلاح. نشعر سوف يكون من الأفضل استخدام هذا البروتوكول بالإضافة إلى تقنيات أكثر شيوعا في بيولوجيا السرطان، وذلك في محاولة لتقييم أكثر صرامة مناهج جديدة لمكافحة السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقدم هذا العمل ممكن من المنح المقدمة إلى JK من مراكز أونتاريو للتميز وصندوق أبحاث أونتاريو.
ونود أن نشكر Siddika Pardhan والدكتور بيتر فيرغسون للحصول على المساعدة الفنية أثناء التصوير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
