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कैंसर ड्रग संवेदीकरण के प्रभावशीलता का मूल्यांकन Published: February 6, 2015 doi: 10.3791/52388
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 4, 1
1Microbiology and Immunology, Western University, 2Biochemistry, Western University, 3Surgery, Western University, 4Oncology, Western University

Abstract

कारण विविधता और एक ही मार्ग जो लक्ष्य मानव कैंसर, एकल एजेंट चिकित्सा, या संयोजन परहेजों में निहित परिवर्तन के उच्च स्तर को विफल करने के लिए की संभावना है। जोर उपचार के लिए आंतरिक और / या अनुकूली प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार हैं कि रास्ते के निषेध पर रखा जाना चाहिए। जांच के एक सक्रिय क्षेत्र विकास और आमतौर पर कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी के लिए इस्तेमाल किया, की कार्रवाई को बढ़ावा देने के लिए, और प्रतिरोध को रोकने कि डीएनए की मरम्मत अवरोधकों का परीक्षण कर रहा है। हम डीएनए हानिकारक दवा सिसप्लैटिन को ट्यूमर कोशिकाओं को जागरूक करने के लिए एक साधन के रूप में बीआरसीए 2 निषेध के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। ट्यूमर सेल चयापचय (अम्लीकरण और श्वसन) मिनट के आधार द्वारा एक मिनट पर उपचार प्रभावशीलता चित्रित करने के लिए 72 घंटे की अवधि के लिए वास्तविक समय में नजर रखी थी। संयोजन में, हम एक चिकन भ्रूण chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) परिस्त्राव और आक्रमण के मॉडल का उपयोग कर मेटास्टैटिक आवृत्ति के एक आकलन प्रदर्शन किया। यहप्रोटोकॉल उपन्यास कैंसर के उपचार परहेजों का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो में और vivo तरीकों में इस्तेमाल किया सामान्यतः की कमजोरियों के कुछ पते। यह इस तरह के सेल प्रसार assays के, कोशिका मृत्यु assays के रूप में आम तरीकों के अलावा में इस्तेमाल किया जा सकता है, और इन विवो murine xenograft अध्ययन में, और अधिक बारीकी से उम्मीदवार लक्ष्य और एजेंटों के बीच भेदभाव, और आगे विकास के लिए केवल सबसे होनहार उम्मीदवारों का चयन करने के लिए।

Introduction

साइटोटोक्सिक कैंसर के इलाज के उपचार की विफलता, पतन का कारण बन सकता है कि एक महत्वपूर्ण नैदानिक ​​समस्या है लक्षित और / या करने के लिए प्रतिरोध का अधिग्रहण किया है, और रोगी मृत्यु दर एक वृद्धि हुई है। सबसे ट्यूमर में विविधता के उच्च स्तर को देखते हुए यह पर्याप्त उच्च सेल नंबर की एक ट्यूमर उन कोशिकाओं अस्तित्व 2,3 के लिए निर्भर है जिस पर आणविक रास्ते को लक्षित एकल या संयुक्त उपचार के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं के एक सबसेट शामिल होंगे कि एक गणितीय निश्चितता है। इस तरह के ट्यूमर कोशिकाओं को सकारात्मक रूप से रोग की पुनरावृत्ति के लिए अग्रणी, उपचार के दौरान के लिए चुना जा सकता है। एक साथ होने से पहले या उपचार की मध्यस्थता चयन के बाद, या तो अलग कैंसर सेल अस्तित्व तंत्र लक्ष्य है कि उपन्यास के उपचारों के विकास, इस प्रकार चिकित्सकीय महत्वपूर्ण है।

ट्यूमर जीनोम में जीनोम अस्थिरता और उत्परिवर्तन की एक उच्च स्तरीय गैर ट्यूमर मेजबान कोशिकाओं 4 से कैंसर की कोशिकाओं को अलग है कि एक मौलिक विशेषता है। नतीजतन, एक usefuडीएनए को नुकसान पहुँचाए कीमोथेरेपी के प्रभाव को बढ़ाने के लिए और प्रतिरोध के विकास को रोकने के लिए एल रणनीति सक्रिय रूप से ट्यूमर कोशिकाओं को 5 में डीएनए की मरम्मत को बाधित करने के लिए है। यह एक पूर्व नैदानिक ​​सेटिंग में पता लगाया जा रहा है जांच और उपन्यास डीएनए की मरम्मत लक्ष्यों की एक किस्म के एक सक्रिय क्षेत्र है। छोटे अणु या इन लक्ष्यों की antisense आधारित अवरोधकों की एक संख्या विकसित किया गया है और 6-8 के परीक्षण के दौर से गुजर रहे हैं। उद्देश्य चिकित्सीय परीक्षण में उनकी सुरक्षा और प्रभावकारिता सबसे होनहार पूर्व नैदानिक ​​उम्मीदवारों की पहचान करने और मूल्यांकन करने के लिए है।

क्लिनिकल परीक्षण की उच्च लागत और (उप इष्टतम पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन सहित कारणों की एक किस्म के लिए) असफलता के जोखिम को नए उपचारों 9 के विकास में प्रगति के लिए दुर्जेय बाधाएं हैं। पर्याप्त रूप से चिकित्सीय लक्ष्य और उम्मीदवार दवाओं नई मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त और पूर्व नैदानिक ​​कठोर मॉडल के उपयोग क्लिनिकल परीक्षण 10 के उच्च असफलता की दर कम हो सकती है

इन विट्रो (सेल प्रसार assays के) ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता में, ख) चिकित्सा प्रेरित कमी में ट्यूमर सेल प्रसार को कम करने की क्षमता का एक माप): कुछ सामान्य रूप से प्रयुक्त पूर्व नैदानिक ​​विधियों उपन्यास विरोधी कैंसर परहेजों की प्रभावशीलता हैं मूल्यांकन करने के लिए फार्म टिशू कल्चर कालोनियों (कॉलोनी गठन assays के) इन विट्रो (रेडॉक्स डाई रूपांतरण) में इन विट्रो ट्यूमर कोशिका मृत्यु का, घ) चिकित्सा प्रेरित प्रेरण (apoptotic, परिगलित, autophagic, जुड़े में ट्यूमर सेल चयापचय गतिविधि में, ग) चिकित्सा प्रेरित कमी vivo में पिंजरे का बँटवारा और अन्य) 11, और ई) के साथ मानव और माउस xenografts 12-14 के विकास या पृथक की कमी चिकित्सा प्रेरित।

सूचीबद्ध इन विट्रो तरीकों में से एक बड़ी कमजोरी उनमें से कोई भी उम्मीदवार के उपचारों के प्रभाव का लगातार वास्तविक समय मूल्यांकन प्रदान करता है। बल्कि, वे केवल चयनित, व्यापक रूप से अलग की समय बिंदुओं पर जानकारी प्रदान करते हैंउपचार के दौरान। इस तरह के मापन सटीकता से ट्यूमर सेल प्रतिक्रिया की भयावहता और समय को प्रतिबिंबित करने की क्षमता कम हो गई है। विवो माउस xenograft मॉडल भी उच्च लागत, पूरा करने के लिए समय की लंबाई, और उप इष्टतम खुराक और उपचार के समय (समय-निर्धारण) का खतरा द्वारा सीमित हैं। इसके अलावा, कृंतक xenograft मॉडल प्राथमिक मानव ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की इन विट्रो आकलन की तुलना में मानव में नैदानिक ​​प्रभावकारिता के सीमित भविष्यवक्ताओं, और उम्मीदवार उपचारात्मक उपायों 15,16 करने के लिए स्थापित मानव ट्यूमर सेल लाइनें हैं कि सबूत नहीं है।

हम ऊपर सूचीबद्ध अधिक आम प्रक्रियाओं की कमजोरियों पते एक तरीके से, पूर्व नैदानिक ​​नई दवा संयोजन का मूल्यांकन करने के लिए एक उपन्यास संयोजन प्रोटोकॉल तैयार की। प्रसार, कॉलोनी के गठन, या रेडॉक्स डाई रूपांतरण assays के स्थान में, हम वास्तविक समय में कोशिका आसंजन, श्वसन, और अम्लीकरण का विश्लेषण करने के लिए एक चयापचय माप की इकाई का उपयोग कियापूरे उपचार की अवधि 17 के दौरान। इसके साथ ही, हम एक चिकन भ्रूण आक्रमण और मेटास्टेसिस 18,19 के chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) मॉडल का उपयोग करके विवो में उपचार के संयोजन के प्रभाव की जांच की। हम आमतौर पर इस्तेमाल किया chemotherapeutic दवा सिसप्लैटिन की प्रभावशीलता को शक्ति प्रदान करने के लिए बीआरसीए 2 को लक्षित एक antisense oligonucleotide (ASO) की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया।

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Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल पक्षपाती कोशिकाओं के साथ उपयोग के लिए डिजाइन किया गया था। संशोधनों निलंबन में उगाई जाने वाली गैर-पक्षपाती कोशिकाओं को विधि लागू करने के लिए आवश्यक हैं। प्रोटोकॉल में वर्णित सीएएम प्रयोगों एक फ्लोरोसेंट मार्कर (जैसे, GFP, आरएफपी, आदि) व्यक्त कि कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए तैयार कर रहे हैं। नौ दिन पुराना चिकन भ्रूण सीएएम प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के दिन 2 पर आवश्यक हैं।

1. तैयारी और एंटी-सेन्स oligonucleotides के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के अभिकर्मक (ASOS)

  1. ब्याज की कोशिकाओं से युक्त T75 कुप्पी (एस) से महाप्राण मध्यम, 1XPBS से धो लें, और 0.25% / trypsin EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें। प्रत्येक फ्लास्क को पूरा मध्यम विकास के 10 मिलीलीटर जोड़ें और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब का हल में कोशिकाओं को हस्तांतरण। कोशिकाओं की गणना और अंतिम एकाग्रता मिलीलीटर प्रति 5 कोशिकाओं 1.0x10 है कि इतनी मात्रा समायोजित करें।
  2. T25 बोतल के लेबल को दो समूहों: एक समूह 1-8 से लेबल आठ बोतल, शामिल होंगे, और यू हो जाएगावास्तविक समय चयापचय माप प्रयोग के लिए SED; और दूसरे समूह भी 8 बोतल में शामिल होंगे और चिकन भ्रूण सीएएम प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। इनक्यूबेटर में प्रत्येक फ्लास्क और जगह (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 हे / एन) का हल में कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. अगली सुबह (0 दिन, समय 0), लेबल तीन 5 मिलीलीटर ट्यूब प्रकार है: नियंत्रण (गैर लक्षित कर ASO या siRNA), 'ब्याज का लक्ष्य' (यानी, लक्षित कर ASO या siRNA), और 2000 Lipofectamine (या एक समान अभिकर्मक अभिकर्मक)। उपयुक्त ट्यूब में सीरम मुक्त माध्यम से उचित एकाग्रता के लिए शेयर ASO समाधान पतला।
    1. उपयुक्त ट्यूब के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए आवश्यक राशि जोड़ें और 5 मिनट के लिए सीरम मुक्त माध्यम में सेते हैं। ASO ट्यूबों के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान जोड़ें और 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. प्रत्येक समूह में बोतल 1-4 से प्रत्येक के लिए नियंत्रण ASO अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान के 250 μl जोड़ें, और 250प्रत्येक समूह में बोतल 5-8 से प्रत्येक के लिए 'लक्ष्य ब्याज की' ASO अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान के μl। 4 घंटा (37 ᵒC, 5% सीओ 2) के लिए सेते हैं।
    1. ऊष्मायन के दौरान, धारा 2.1 में वर्णित चरणों के बाहर ले जाने के लिए। ऊष्मायन के बाद, सीएएम प्रयोग समूह में प्रत्येक फ्लास्क को पूरा मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ने और इनक्यूबेटर हे करने के लिए वापस / एन (37 ᵒC, 5% सीओ 2)। खंड 2.2 में वर्णन के अनुसार चयापचय प्रयोग समूह प्रक्रिया। धारा 4 में वर्णन के अनुसार निर्धारित सीएएम प्रयोग की प्रक्रिया।

2. Biosensor चिप तैयार करना और सेल बोने

  1. एक बाँझ वातावरण में, ध्यान से पीबीएस के 400 μl के साथ छह biosensor चिप्स धो लें। 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के 400 μl के साथ चिप्स जीवाणुरहित। पीबीएस के 400 μl के साथ तीन बार धोएं।
    1. बाँझ ऊतक संस्कृतियों के अंदर चिप्स जगहई व्यंजन प्रदूषण को रोकने के लिए। 'नियंत्रण' नामक एक पकवान में तीन चिप्स जगह है, और 'रुचि लक्ष्य' लेबल एक डिश में तीन।
  2. 'नियंत्रण' और 'ब्याज का लक्ष्य' के रूप में दो 50 मिलीलीटर ट्यूब लेबल। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और 0.25% trypsin / EDTA के एक उचित मात्रा में जोड़ें। Monolayer detaches तक प्रतीक्षा करें और प्रत्येक कुप्पी से कोशिकाओं को इकट्ठा। उपयुक्त ट्यूब में समाधान जमा।
    1. कोशिकाओं की गणना और अंतिम एकाग्रता 6.0x10 5 कोशिकाओं / एमएल है कि इतनी मात्रा समायोजित करें। प्रारंभिक एकाग्रता बहुत कम है अपकेंद्रित्र कोशिकाओं resuspend और।
  3. (चिप प्रति 1.25x10 5 कोशिकाओं की कुल के लिए) उपयुक्त समूह में प्रत्येक biosensor चिप के लिए सेल के समाधान के 250 μl जोड़ें। चिप्स भ्रमित करने का जोखिम कम करने के लिए एक समय में इस कार्य को एक समूह प्रदर्शन करते हैं। वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक नमी कक्ष के अंदर चिप्स युक्त बाँझ व्यंजन हैं, जगह और आर्द्रता चा जगहmber इनक्यूबेटर में हे / एन (37 ᵒC, 5% सीओ 2)।
  4. अगली सुबह (दिवस 1), ध्यान से प्रत्येक चिप से मध्यम महाप्राण और 0.2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1x पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक मध्यम विकास के 250 μl के साथ बदलें। 4 घंटा (37 ᵒC, 5% सीओ 2) के लिए सेते हैं।

3. चयापचय मापन प्रणाली तैयार करना और समाधान तैयारी

  1. ऊष्मायन के दौरान, अपेक्षित दवा समाधान और आगामी परख के लिए चयापचय माप प्रणाली तैयार करते हैं।
    नोट: चयापचय माप प्रणाली छह मॉड्यूल की कुल शामिल हैं। प्रत्येक मॉड्यूल प्रयोग के प्रति एक चिप रह सकते हैं।
    1. निम्नलिखित प्रयोगात्मक समूहों में परख प्रतिभाग: एक चिप 'नियंत्रण' और परख की अवधि के लिए वाहन प्राप्त करने के लिए समूहों के हित का लक्ष्य 'में से प्रत्येक से; प्रत्येक समूह से दो चिप्स एक के दौरान समय का एक निर्धारित अवधि के लिए दवा उपचार प्राप्त करने के लिएssay, वार्शआउट अवधि के दौरान वाहन से पीछा किया।
    2. दवा संवेदीकरण अध्ययन के लिए, प्रश्न में विशेष दवा सूट करने के लिए नशीली दवाओं के उपचार की लंबाई, समय, और एकाग्रता को संशोधित।
      नोट: सिसप्लैटिन के लिए, निम्न चरणों A549 कोशिकाओं के साथ अनुभव से निर्धारित किया गया है, और सेल लाइन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। 4 μl / मिनट के डिफ़ॉल्ट प्रवाह की दर के साथ सभी स्तरों को पूरा करें।
      मध्यम विकास + 0.2% FBS और 1x पी / एस के 6 घंटा
      मध्यम में 6 माइक्रोन सिसप्लैटिन के 24 घंटा + 0.2% FBS के 1x पी / एस
      मध्यम विकास + 0.2% FBS और 1x पी / एस के 24 घंटा
      मध्यम विकास + 0.2% FBS और 1x पी / एस के 18 घंटा
      0.1% ट्राइटन एक्स के 4 घंटा
      नोट: इन चरणों से विचलन वांछित प्रवाह दर और प्रयोग की अवधि के आधार पर मध्यम और नशीली दवाओं के समाधान के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करने के लिए गणना की आवश्यकता होगी। निम्न वर्गों के ऊपर वर्णित चरणों पर आधारित हैं।
  2. लेबल और मध्यम विकास + 0.2% FBS के एक 50 मिलीलीटर के साथ चौदह 50 मिलीलीटर ट्यूब भरनाडी 1x पी / एस। एक चयापचय माप प्रणाली ट्यूब रैक में छह, दूसरे में छह, और भी सिसप्लैटिन साथ ट्यूबों में शामिल है कि एक तिहाई ट्यूब रैक में शेष दो रखें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक हवाई पारगम्य झिल्ली के साथ पहले दो रैक सील।
  3. 1x पी / एस के साथ मध्यम + 0.2% FBS के में (उचित मात्रा का) 6 माइक्रोन सिसप्लैटिन का एक समाधान तैयार है। चार से लेबल 50 मिलीलीटर ट्यूबों में सिसप्लैटिन समाधान के लिए आवश्यक मात्रा बांटना।
    1. तीसरे चयापचय माप ट्यूब रैक में शेष चार स्लॉट में ट्यूबों रखें। ट्यूब वांछित biomodules के अनुरूप है कि उपयुक्त स्लॉट में रखा जाता है कि सुनिश्चित करें। एक हवा पारगम्य झिल्ली के साथ ट्यूबों सील।
  4. तैयार है और छह से 50 मिलीलीटर ट्यूब लेबल और 20 मिलीलीटर माध्यम में 0.1% ट्राइटन एक्स समाधान से प्रत्येक के साथ उन्हें भरने। ट्राइटन एक्स समाधान किसी भी शेष कोशिकाओं lyse और प्रत्येक चिप के लिए एक 'शून्य' मूल्य प्रदान करेगा। एक चौथी चयापचय माप इकाई ट्यूब रैक में ट्यूबों प्लेस और बुद्धि सीलएच अत्यधिक वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक हवाई permable झिल्ली।
  5. Biomodules में चिप्स लोड और प्रयोग आरंभ करें।

4. सीएएम प्रयोग दवा उपचार और इंजेक्शन

नोट: एक सीएएम प्रयोग के लिए चिकन भ्रूण तैयार करने के लिए कदम और प्रक्रिया कहीं और 19 में वर्णित हैं

  1. सीएएम प्रयोग 48 घंटा बाद अभिकर्मक (2 दिन) की प्रक्रिया शुरू। दो वाहन के लिए बोतल, और सिसप्लैटिन के लिए दो भागों में 'नियंत्रण' और 'समूहों के हित के लक्ष्य' उप-विभाजित करते हैं। बोतल से मध्यम Aspirate और तीन ताजा माध्यम से मिलीलीटर, या 6 माइक्रोन सिसप्लैटिन के साथ या तो भरपाई होगी। 6 घंटा (37 ᵒC, 5% सीओ 2) के लिए सेते हैं।
  2. धोने फिर, मध्यम Aspirate और कोशिकाओं trypsinize; चार उचित लेबल 15 मिलीलीटर ट्यूबों में समाधान में trypsinized कोशिकाओं को इकट्ठा।
    1. अपकेंद्रित्र और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। पीबीएस एक के 5 मिलीलीटर में सेल गोली पुनः निलंबितकोशिकाओं की गिनती होगी।
    2. अंतिम सेल एकाग्रता 1.0x10 6 कोशिकाओं / एमएल है कि इतनी मात्रा समायोजित करें। इंजेक्शन के लिए लेबल 5 मिलीलीटर ट्यूबों में सेल समाधान स्थानांतरण, और बर्फ पर जगह है। कोशिकाओं में अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन के लिए धीरे से पहले ट्यूब पलटना।
  3. इंजेक्शन के लिए (9 दिन पुरानी) 24 चिकन भ्रूण (समूह 6 प्रतिशत) की कुल अलग निर्धारित करें। 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा एक लचीला ट्यूब से जुड़ी एक गिलास सुई का उपयोग इंजेक्शन प्रदर्शन। इंजेक्शन प्रदर्शन कर व्यक्ति के इलाज के समूह के लिए अंधा हो जाना चाहिए।
    1. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सीएएम की शिरापरक संचलन में 1.0x10 100 μl की मात्रा में 5 कोशिकाओं इंजेक्षन। कोशिकाओं की पूरी मात्रा इंजेक्षन करने के लिए एक धीमी, pulsating तकनीक का प्रयोग करें। एक नरम रक्त का प्रवाह स्टेम और किसी भी spillage से अवशोषित करने के लिए पोंछने के साथ धीरे इंजेक्शन साइट थपका। उचित रूप से प्रत्येक इंजेक्शन के बाद प्रत्येक भ्रूण कंटेनर लेबल।
  4. उपस्थिति और वितरित की पुष्टि करेंसीएएम की वाहिका में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के bution एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर उन्हें visualizing द्वारा इंजेक्शन के बाद। ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या कम दिखाई देता है, या वितरण गरीब है, जिसमें किसी भी भ्रूण का ध्यान रखना।
  5. एक आर्द्रता चैम्बर में चिकन भ्रूण प्लेस और एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस, 60% आर्द्रता) में उन्हें दुकान। मेटास्टैटिक foci की गणना से पहले 7-9 दिनों तक प्रतीक्षा करें।

5. Metastatic फोकस गणन

  1. 7-9 दिन ऊष्मायन अवधि के दौरान, भ्रूण पर नजर रखने के लिए और किसी भी मृत लोगों को त्यागें। आर्द्रता चैम्बर ऊष्मायन अवधि के दौरान हर समय नम रहता है यह सुनिश्चित।
  2. 20X बढ़ाई पर एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एक नियमित रूप से, ग्रिड की तरह पैटर्न में भ्रूण सीएएम की पूरी ऊपरी सतह को स्कैन।
  3. फिर भ्रूण प्रति एक अंतिम कुल के लिए संख्या टैली, देखने के प्रत्येक क्षेत्र में मेटास्टैटिक foci के संख्या की गणना। प्रत्येक समूह में छह भ्रूण के लिए ऐसा करने से एक औसत संख्या ओ प्रदान करेगाइलाज के प्रति एफ मेटास्टैटिक foci।

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Representative Results

परिणाम और आंकड़े प्रकाशित काम 22 से अनुमति के साथ अनुकूलित।

बीआरसीए 2 निषेध सिसप्लैटिन में इलाज ट्यूमर कोशिकाओं में श्वसन में कमी लाती है

ASO बीआरसीए 2-लक्ष्य और सिसप्लैटिन अकेले नियंत्रण ASO और सिसप्लैटिन प्राप्त जो कोशिकाओं की तुलना में, श्वसन में एक प्रारंभिक और अपरिवर्तनीय कमी का प्रदर्शन के साथ इलाज मानव A549 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं; कोशिकाओं का इलाज किया सिसप्लैटिन उपचार के 24 घंटा बीआरसीए 2 ASO और नियंत्रण ASO के बीच श्वसन में अंतर के बाद 39% (चित्रा 1 ए) था। महत्वपूर्ण बात है, श्वसन में यह कमी इस सेल नंबर में परिवर्तन की स्वतंत्र हुआ, सुझाव है कि कोशिका आसंजन में एक detectable ड्रॉप से ​​पहले शुरू कर दिया। श्वसन श्वसन में एक बूंद कोशिका मृत्यु (चित्रा 1 बी) पछाड़ दिया है कि एक प्रारंभिक घटना हो सकती है, सुझाव है कि आसंजन में पहली नमूदार ड्रॉप से पहले लगभग 10 घंटा कम करने के लिए शुरू किया। एसी में कोई फर्क नहींidification बीआरसीए 2 ASO और सिसप्लैटिन उपचार ग्लूकोज चयापचय (चित्रा 1C) पर कोई प्रभाव नहीं करने के लिए कुछ किया है, सुझाव है कि 72 घंटा प्रयोग समय-सीमा के दौरान मनाया गया।

सिसप्लैटिन उपचार के साथ संयुक्त बीआरसीए 2 निषेध मेटास्टेसिस की आवृत्ति कम हो जाती है

मानव A549 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को सिसप्लैटिन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में नियंत्रण ASO या बीआरसीए 2 ASO के साथ व्यवहार किया है, और एम (2A चित्रा) के शिरापरक परिसंचरण में इंजेक्ट किया गया। इंजेक्शन के बाद नौ दिन, बीआरसीए 2 ASO और सिसप्लैटिन के साथ इलाज किया कोशिकाओं अकेले नियंत्रण ASO और सिसप्लैटिन, या बीआरसीए 2 ASO (चित्रा 2 बी) के साथ इलाज किया कोशिकाओं की तुलना में मेटास्टैटिक foci के एक 77% कम आवृत्ति का प्रदर्शन किया। इस बीआरसीए 2 ASO और सिसप्लैटिन उपचार में कमी या ठोस ट्यूमर के रोगियों में मेटास्टैटिक बोझ को रोकने की क्षमता है कि पता चलता है।

चित्र 1 ट्यूमर सेल पालन, श्वसन, और अम्लीकरण। A549 कोशिकाओं के चित्रा 1. वास्तविक समय की निगरानी biosensor चिप्स पर चढ़ाया, बीआरसीए 2 ASO साथ ट्रांसफ़ेक्ट, और Bionas खोज प्रणाली का उपयोग करते हुए 24hrs के लिए सिसप्लैटिन के साथ इलाज किया गया। (ए) श्वसन, (बी) के पालन, और (सी) अम्लीकरण की माप 72 घंटा की अवधि में हर 4 मिनट प्रदर्शन किया गया। गुलाबी = नीले आसो = बीआरसीए 2 ASO पर नियंत्रण, हरी = ASO + सिसप्लैटिन, लाल = बीआरसीए 2 ASO + सिसप्लैटिन नियंत्रित करते हैं। अनुमति 22 के साथ प्रकाशित काम से अनुकूलित चित्रा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. गणना मेटास्टैटिक frequency एक चिकन भ्रूण अभियान मॉडल का उपयोग कर। बीआरसीए 2 ASO साथ ट्रांसफ़ेक्ट A549 कोशिकाओं छह घंटे के लिए सिसप्लैटिन के साथ व्यवहार किया है, और फिर एक 9 दिन पुराने चिकन भ्रूण (ए) के शिरापरक परिसंचरण में इंजेक्ट किया गया। मेटास्टैटिक foci (बी) (एक 40x उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कल्पना) इंजेक्शन (सी) के बाद नौ दिनों गिना रहे थे। अनुमति 22 के साथ प्रकाशित काम से अनुकूलित चित्रा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कारण क्लिनिकल परीक्षण के साथ जुड़े निहित लागत और जोखिम के लिए, बेहतर और पर्याप्त रूप से उपन्यास विरोधी कैंसर उपचार परहेज मूल्यांकन करने के लिए पूर्व नैदानिक ​​परीक्षण पद्धति और अधिक कठोर विकसित करने की आवश्यकता नहीं है। वर्तमान सामान्य रूप से प्रयुक्त तकनीक कम प्रभावी हो सकता है कि सभी प्रदर्शनी संभावित होनहार चिकित्सकीय लक्ष्य / एजेंटों के बीच विभेद करने के लिए अपनी क्षमता को सीमित कर सकता है कि कमजोरियों, और उन। हम पारंपरिक तरीकों की कमियों के कई पतों कि नई विरोधी कैंसर दृष्टिकोण का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार की।

वर्णित प्रोटोकॉल की एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण विशेषता वास्तविक समय में सेलुलर प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, और मिनट से चयापचय और पालन मिनट में परिवर्तन ट्रैक करने की क्षमता है। इस शिखर दवा प्रभाव, इष्टतम खुराक की पहचान और नशीली दवाओं के संयोजन उपचार के घटकों के बीच बातचीत का एक अधिक विस्तृत समझ के लिए अनुमति देता है। इसके साथ ही, यह discre में अंतर्दृष्टि प्रदान करता हैसेल गिनती, apoptosis, या डाई-रूपांतरण assays के द्वारा प्रदान नहीं की है कि जानकारी है जो कैंसर की कोशिकाओं में ते चयापचय परिवर्तन। इस परख की एक सीमा है सही ढंग से दवा उपचार के दौरान उत्पन्न हो रही है कि कोशिका मृत्यु के प्रकार का निर्धारण करने में असमर्थता है। व्यवहार्यता में परिवर्तन biosensor चिप के पालन में परिवर्तन से परिलक्षित होगा, लेकिन इस कोशिका मृत्यु के तरीके के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। यह भी इसी तरह की चयापचय डेटा निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें और सेल इमेजिंग तकनीक जीने के लिए संभव है, और यह इस प्रोटोकॉल 20,21 में वर्णित प्रयोगों के लिए इसके अलावा में इस्तेमाल किया जा सकता है।

इसके अलावा, चिकन भ्रूण अभियान मॉडल के उपयोग के इलाज के बाद मेटास्टैटिक आवृत्ति अध्ययन करने के लिए एक नया लक्ष्य, दवा, या नशीली दवाओं के संयोजन extravasate और / या आसपास के ऊतकों पर आक्रमण जो कैंसर की कोशिकाओं की आवृत्ति कम हो जाती है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। यह एक सीएलआई से एक विशेष रूप से प्रासंगिक सवाल हैnical दृष्टिकोण, metastatic रोग कैंसर रोगियों के बीच मृत्यु दर का एक उच्च अनुपात का कारण बनता है। एक संभावित सीमित कारक वास्तविक दवा इलाज सीएएम में घटित नहीं करता है। इसके बजाय यह पूर्व vivo होता है और पूर्व इलाज कोशिकाओं तो सीएएम में इंजेक्ट किया जाता है। इसलिए, इस परख vivo में दवा तेज या वितरण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। इसके अलावा, नसों में सीएएम इंजेक्शन तकनीकी रूप से चुनौती दे रहे हैं और महत्वपूर्ण अभ्यास / अनुभव की आवश्यकता होती है।

हम डीएनए हानिकारक दवा सिसप्लैटिन को ट्यूमर कोशिकाओं को जागरूक करने के लिए एक बीआरसीए 2-लक्षित कर ASO की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। हमारे प्रयोगों के परिणामों चिकित्सकीय हमले के लिए एक आशाजनक लक्ष्य के रूप में बीआरसीए 2 की पहचान की है, और यह भी एक उम्मीदवार दवा के रूप में बीआरसीए 2 ASO के आगे पूर्व नैदानिक ​​विकास के लिए तर्क प्रदान की है। हम विशेष रूप से डी.एन. के तेजी से बढ़ते क्षेत्र में, संयोजन उपचार के लिए उपन्यास लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है इस प्रोटोकॉल की कल्पनाएक मरम्मत निषेध। हम इस प्रोटोकॉल का सबसे अच्छा और अधिक इसरो नई विरोधी कैंसर दृष्टिकोण का मूल्यांकन करने के प्रयास में, कैंसर जीव विज्ञान में ज्यादा आम तकनीक के अलावा में इस्तेमाल किया जाएगा लग रहा है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम में उत्कृष्टता के ओंटारियो केन्द्रों और ओंटारियो रिसर्च फंड से जे के लिए अनुदान के द्वारा ही संभव बनाया गया था।

हम फिल्माने के दौरान तकनीकी सहायता के लिए Siddika Pardhan और डॉ पीटर फर्ग्यूसन को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CCL-185 http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx
AeraSeal film Carl Roth GmbH
AMEM Wisent Bioproducts 210-011-QK
Antisense oligodeoxynucleotides Avecia BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 )
Axio Zoom V16 Microscope Carl Zeiss http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html
Bionas Biosensor Chips Bionas GmbH and Micronas GmbH BIS8001D
Bionas Discovery 2500 System  Bionas GmbH http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/
Cisplatin Sigma Aldrich 479306
Fertilized chicken eggs Sourced locally
Fetal bovine serum  Gibco - Life Technologies
Lipofectamine 2000  Invitrogen - Life Technologies  12566014 http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html
PBS Wisent Bioproducts 311-010-CL
Trypsin (0.25%)/EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL

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References

  1. Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
  2. Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
  3. Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
  6. Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
  7. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
  8. Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
  9. Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
  10. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  11. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
  12. Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
  13. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
  14. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
  15. Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
  16. Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
  17. Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
  18. Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
  19. Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
  20. Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
  21. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
  22. Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).

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चिकित्सा अंक 96 चिकन भ्रूण Chorio-allantoic झिल्ली मॉडल वास्तविक समय चयापचय की निगरानी ​​कैंसर रोधी दवा परीक्षण पूर्व नैदानिक ​​विकास डीएनए की मरम्मत
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Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (96), e52388, doi:10.3791/52388 (2015).

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