Abstract
Dato l'elevato livello di eterogeneità e di mutazioni inerenti tumori umani, terapie singoli agenti, o regimi di associazione che prendono di mira la stessa via, sono destinate a fallire. L'accento deve essere posto sulla inibizione di percorsi che sono responsabili per la resistenza intrinseca e / o adattabile alla terapia. Un campo di ricerca attiva è lo sviluppo e la sperimentazione di inibitori di riparazione del DNA che promuovono l'azione di, e prevenire la resistenza a, comunemente chemioterapia e la radioterapia utilizzata. Abbiamo utilizzato un nuovo protocollo per valutare l'efficacia di inibizione BRCA2 come mezzo per sensibilizzare le cellule tumorali al DNA dannoso cisplatino farmaco. Metabolismo cellulare tumorale (acidificazione e respirazione) è stata monitorata in tempo reale per un periodo di 72 ore per delineare efficacia del trattamento su un minuto da basi minuti. In combinazione, abbiamo effettuato una valutazione della frequenza metastatico con una membrana corioallantoidea embrione di pollo (CAM) il modello di stravaso e l'invasione. Questoprotocollo affronta alcuni dei punti deboli di uso comune in vitro e in vivo i metodi per valutare nuovi regimi di terapia del cancro. Può essere utilizzato in aggiunta ai metodi comuni come saggi di proliferazione cellulare, saggi di morte cellulare, e studi in vivo xenotrapianto murini, discriminare più strettamente tra target e agenti candidati, e selezionare solo i candidati più promettenti per ulteriore sviluppo.
Introduction
Resistenza mirata e / o trattamento del cancro citotossico è un importante problema clinico che può portare al fallimento del trattamento, ricaduta acquisita, e un aumento della mortalità del paziente 1. Dato l'elevato livello di eterogeneità nella maggior parte dei tumori, è una certezza matematica che un tumore del numero sufficientemente elevato di cellule conterrà un sottoinsieme di cellule resistenti alle terapie singole o combinate rivolte vie molecolari in cui tali cellule dipendono per la sopravvivenza 2,3. Tali cellule tumorali possono essere selezionate positivamente per durante il trattamento, determinando una recidiva di malattia. Sviluppo di nuove terapie che contemporaneamente colpiscono diversi meccanismi di sopravvivenza delle cellule del cancro, prima o dopo la selezione del trattamento-mediata, è quindi clinicamente importante.
Un alto livello di instabilità del genoma e la mutazione nei genomi tumorali è una caratteristica fondamentale che distingue le cellule tumorali da cellule ospiti non-tumorali 4. Di conseguenza, un usefustrategia l per aumentare l'efficacia delle attività lesiva sul DNA chemioterapia e per prevenire lo sviluppo di resistenza è di inibire attivamente la riparazione del DNA nelle cellule tumorali 5. Si tratta di un tema di indagine e una varietà di nuovi bersagli di riparazione del DNA vengono esplorati in un contesto pre-clinico. Un certo numero di piccole molecole o inibitori a base antisenso-di questi obiettivi sono stati sviluppati e in attesa di collaudo 6-8. L'obiettivo è quello di individuare le più promettenti candidati pre-clinici e valutare la loro sicurezza ed efficacia in studi clinici.
L'alto costo degli studi clinici e il rischio di fallimento (per una serie di motivi, tra cui la valutazione pre-clinica non ottimale) sono formidabili ostacoli al progresso nello sviluppo di nuove terapie 9. L'uso di modelli adeguati e rigorosi pre-clinico per valutare adeguatamente nuovi bersagli terapeutici e farmaci candidati può diminuire il tasso di fallimento delle sperimentazioni cliniche 10
Alcuni metodi pre-clinici di uso comune per valutare l'efficacia di nuovi regimi anti-cancro sono: a) la misura di capacità di ridurre la proliferazione delle cellule tumorali in vitro (saggi di proliferazione cellulare), b) la riduzione della terapia indotta della capacità delle cellule tumorali di colonie di coltura tissutale (forma saggi formazione di colonie), c) la riduzione terapia indotta in cellule tumorali attività metabolica in vitro (conversione redox-dye), d) induzione terapia indotta vitro morte delle cellule tumorali in (apoptosi, necrosi, autophagic, associato con la mitosi e altri) 11, ed e) in vivo riduzione della crescita o ablazione umano e topo eterotrapianti 12-14 terapia indotta.
Una delle principali debolezze dei metodi elencati in vitro è che nessuno di loro forniscono valutazione continua in tempo reale l'effetto di terapie candidati. Piuttosto, forniscono informazioni solo in selezionati, momenti ampiamente separatidurante il corso del trattamento. Tali misurazioni sono diminuiti capacità di riflettere con precisione l'entità e la tempistica delle risposte delle cellule tumorali. In vivo i modelli del mouse xenotrapianto sono limitati da costi elevati, la lunghezza di tempo per completare, e il rischio di dosaggio e trattamento tempistica sub-ottimali (scheduling). Inoltre, vi sono prove che i modelli roditori xenotrapianto sono predittori limitati di efficacia clinica negli esseri umani, rispetto alla valutazione in vitro delle risposte delle cellule primarie tumorali umane e stabilite linee cellulari tumorali umane a candidati interventi terapeutici 15,16.
Abbiamo ideato un protocollo nuova combinazione di valutare nuove combinazioni di farmaci pre-clinica, in modo che affronta le debolezze delle procedure più comuni elencati sopra. In luogo di proliferazione, formazione di colonie, o redox-dye test di conversione, abbiamo utilizzato un'unità di misura del metabolismo di analizzare l'adesione delle cellule, la respirazione, e l'acidificazione in tempo realedurante l'intero periodo di trattamento 17. Allo stesso tempo, abbiamo studiato gli effetti della combinazione di trattamento in vivo, utilizzando un embrione di pollo corioallantoidea membrana (CAM) il modello di invasione e metastasi 18,19. Abbiamo usato questi metodi per valutare la capacità di un oligonucleotide antisenso (ASO) rivolti BRCA2 potenziare l'efficacia del cisplatino farmaco chemioterapico comunemente usato.
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Protocol
NOTA: Il seguente protocollo è stato progettato per l'utilizzo con cellule aderenti. Le modifiche sono necessarie per applicare il metodo a cellule non-aderenti coltivate in sospensione. Gli esperimenti CAM descritti nel protocollo sono progettati per l'uso con cellule che esprimono un marcatore fluorescente (ad esempio, GFP, RFP, ecc). Nove giorni embrioni di pollo sono tenuti il giorno 2 del protocollo sperimentale per gli esperimenti CAM.
1. Preparazione e Trasfezione delle cellule tumorali con oligonucleotidi antisenso (ASO)
- Medio Aspirare dalla boccetta T75 (s) contenente cellule di interesse, lavare con 1XPBS, e aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina / EDTA. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura completo per ogni beuta e trasferire le cellule in soluzione ad un tubo da 50 ml. Contare le cellule e regolare il volume in modo che la concentrazione finale è 1.0x10 5 cellule per ml.
- Label due gruppi di palloni T25: un gruppo conterrà otto flaconi, etichettati 1-8, e sarà used per l'esperimento di misura metabolismo tempo reale; e il secondo gruppo conterrà anche 8 palloni e verrà utilizzato per l'esperimento CAM embrione di pollo. Aggiungere 2 ml di cellule in soluzione ad ogni pallone e posto in incubatrice (37 ° C, 5% CO 2 O / N).
- La mattina dopo (giorno 0, Tempo 0), etichetta di tre 5 ml provette nel modo seguente: il controllo (non-targeting ASO o siRNA), 'obiettivo di interesse' (vale a dire, il targeting ASO o siRNA), e Lipofectamine 2000 (o simile reagente di trasfezione). Diluire le soluzioni magazzino ASO alla concentrazione appropriata con mezzo privo di siero in provetta appropriata.
- Aggiungere la quantità necessaria di reagente di trasfezione al tubo appropriato e incubare in terreno privo di siero per 5 min. Aggiungere la soluzione reagente di trasfezione ai tubi ASO e incubare per 20 min.
- Aggiungere 250 pl di controllo ASO soluzione reagente di trasfezione per ciascuno dei flaconi 1-4 in ciascun gruppo, e 250microlitri di 'bersaglio di interesse' ASO soluzione reagente di trasfezione per ciascuno dei flaconi 5-8 in ciascun gruppo. Incubare per 4 ore (37 ᵒC, 5% di CO 2).
- Durante l'incubazione, eseguire le operazioni descritte nella sezione 2.1. Dopo l'incubazione, aggiungere 3 ml di mezzo completo in ciascuno dei palloni gruppo esperimento CAM e ritornare alla incubatore O / N (37 ᵒC, 5% CO 2). Elaborare il gruppo dell'esperimento metabolismo in base alla descrizione nella sezione 2.2. Elaborare l'esperimento CAM impostato secondo la descrizione al punto 4.
2. Chip Preparazione Biosensor e semina cellulare
- In un ambiente sterile, lavare accuratamente sei chip biosensore con 400 ml di PBS. Sterilizzare i chip con 400 ml di etanolo al 70% per 20 min. Lavare tre volte con 400 ml di PBS.
- Posizionare i chip all'interno cultur tessuto sterilee piatti per evitare la contaminazione. Mettere tre chip in un piatto etichettato 'di controllo', e tre in un piatto denominato 'obiettivo di interesse'.
- Etichettare due 50 ml tubi come 'controllo' e 'oggetto di interesse'. Lavare le cellule con PBS e aggiungere un volume adeguato di 0,25% tripsina / EDTA. Attendere che le stacca monostrato e raccogliere le cellule da ciascun flacone. Deposito la soluzione nel tubo appropriata.
- Contare le cellule e regolare il volume in modo che la concentrazione finale è 6.0x10 5 cellule / ml. Centrifuga e risospendere le cellule se la concentrazione iniziale è troppo bassa.
- Aggiungere 250 microlitri della soluzione di cellule per ogni chip biosensore nel gruppo appropriato (per un totale di 1.25x10 5 cellule per chip). Eseguire questa attività un gruppo alla volta per minimizzare il rischio di confondere i chip. Porre le capsule sterili contenenti i chip all'interno di una camera di umidità per evitare l'evaporazione, e posto le cha umiditàmber nell'incubatrice O / N (37 ᵒC, 5% di CO 2).
- La mattina dopo (giorno 1), aspirare accuratamente la media da ogni chip e sostituirlo con 250 ml di terreno di coltura addizionato con siero fetale bovino 0,2% (FBS) e 1x penicillina e la streptomicina (P / S). Incubare per 4 ore (37 ᵒC, 5% di CO 2).
Preparazione sistema 3. Metabolismo Misurazione e Solution Preparazione
- Durante l'incubazione, preparare le soluzioni farmacologiche necessarie e il sistema di misura del metabolismo per il test imminente.
NOTA: Il sistema di misurazione del metabolismo contiene un totale di sei moduli. Ogni modulo ospita un gettone per ogni esperimento.- Suddividere il dosaggio nei seguenti gruppi sperimentali: un chip di ciascuno degli 'di controllo' e 'bersaglio di interesse' gruppi per ricevere veicolo per la durata del test; due chip di ogni gruppo per ricevere il trattamento farmacologico per un periodo di tempo definito durante l'unassay, seguito dal veicolo durante il periodo di washout.
- Per gli studi di sensibilizzazione droga, modificare la lunghezza, la tempistica e concentrazione del trattamento farmacologico per adattarsi alla particolare farmaco in questione.
NOTA: Per cisplatino, i seguenti passaggi sono stati determinati empiricamente con le cellule A549, e può variare a seconda della linea cellulare. Eseguire tutte le fasi con la portata di default di 4 ml / min.
6 ore di crescita a medio + 0,2% FBS e 1x P / S
24 ore di 6 micron cisplatino in media + 0,2% FBS 1x P / S
24 ore di crescita a medio + 0,2% FBS e 1x P / S
18 ore di crescita a medio + 0,2% FBS e 1x P / S
4 h di 0,1% Triton X-
NOTA: deviazioni dalle seguente procedura richiederanno calcolo per determinare il volume di soluzioni medie e farmaco basato sulla portata desiderata e la durata dell'esperimento. Le seguenti sezioni sono basate sulle fasi sopra descritte.
- Etichetta e riempire quattordici 50 ml provette con 50 ml di una crescita media + 0,2% FBS und 1x P / S. Inserire sei una misurazione metabolismo tubo sistema a cremagliera, sei in un altro, e gli altri due in una terza cremagliera tubo che contiene anche i tubi con cisplatino. Sigillare le prime due cremagliere con una membrana permeabile aria per evitare l'evaporazione.
- Preparare una soluzione di 6 micron cisplatino (del volume appropriato) in media + 0,2% FBS con 1x P / S. Dispensare il volume richiesto di soluzione di cisplatino in quattro etichettati 50 ml provette.
- Posizionare i tubi nelle restanti quattro slot nel terzo metabolismo tubo di misurazione rack. Assicurarsi che i tubi sono disposti in apposite feritoie corrispondenti alle biomodules desiderati. Sigillare le provette con una membrana permeabile all'aria.
- Preparare ed etichettare sei 50 ml tubi e riempirli con 20 ml ciascuna di 0,1% soluzione Triton-X in mezzo. La soluzione di Triton-X lisare tutte le cellule rimanenti e fornire un valore 'zero' per ogni chip. Porre i tubi in una quarta misura metabolismo tubo unità rack e sigillare with una membrana permable aria per evitare l'eccessiva evaporazione.
- Caricare i chip nelle biomodules e avviare l'esperimento.
Trattamento Drug 4. CAM Experiment e iniezione
NOTA: I passi e le procedure per la preparazione di embrioni di pollo per un esperimento CAM sono descritte altrove 19
- Iniziare l'elaborazione del CAM esperimento a 48 ore dopo la trasfezione (Day 2). Sub-dividere il 'controllo' e 'oggetto di interesse' gruppi in due palloni per il veicolo, e due per cisplatino. Aspirare il supporto dai fiaschi e riempire sia con 3 ml di mezzo fresco, o 6 micron cisplatino. Incubare per 6 ore (37 ᵒC, 5% di CO 2).
- Aspirare il mezzo, poi lavare e trypsinize le cellule; raccogliere le cellule trypsinized in soluzione in quattro opportunamente etichettati provette da 15 ml.
- Centrifuga e lavare le cellule tre volte con PBS. Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di PBS und contare le cellule.
- Regolare il volume in modo che la concentrazione cellulare finale è 1.0x10 6 cellule / ml. Trasferire la soluzione cella in etichettati 5 ml tubi per l'iniezione, e disporli sul ghiaccio. Capovolgere delicatamente le provette prima dell'iniezione per assicurare che le cellule sono ben miscelati.
- Mettere da parte un totale di 24 embrioni di pollo (9 giorni) per l'iniezione (6 per gruppo). Effettuare l'iniezione con un ago di vetro collegata ad un tubo flessibile collegato ad una siringa da 1 ml. L'individuo esegue l'iniezione deve essere accecato al gruppo di trattamento.
- Utilizzando un microscopio stereo, iniettare 1.0x10 5 cellule in un volume di 100 microlitri nella circolazione venosa della CAM. Utilizzare una lenta, tecnica pulsante di iniettare l'intero volume delle cellule. Tamponare delicatamente il sito di iniezione con un morbido pulire per arginare il flusso di sangue e di assorbire eventuali perdite. Etichettare ogni contenitore embrione adeguatamente dopo ogni iniezione.
- Confermare la presenza e distribuzione di cellule fluorescenti nella vascolarizzazione della CAM dopo iniezione visualizzando utilizzando un microscopio a fluorescenza. Prendete nota di tutti gli embrioni in cui il numero di cellule tumorali appare bassa, o la distribuzione è scarsa.
- Mettere gli embrioni di pollo in una camera umida e memorizzarli in un incubatore (37 ° C, 60% di umidità). Aspettare 7-9 giorni prima enumerazione foci metastatici.
5. metastatico fuoco Enumeration
- Durante il periodo di incubazione 7-9 giorni, monitorare gli embrioni e scartare eventuali morti. Assicurarsi che la camera di umidità rimane umida in qualsiasi momento durante il periodo di incubazione.
- Utilizzando un microscopio stereo fluorescenza a 20 ingrandimenti, la scansione dell'intera superficie superiore della CAM dell'embrione in un modello a griglia regolare.
- Contare il numero di focolai metastatico in ogni campo di vista, quindi coincidere il numero per un totale finale per embrione. In questo modo per i sei embrioni in ogni gruppo fornirà un numero o mediof foci metastatici per il trattamento.
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Representative Results
Risultati e figure adattato con il permesso di lavoro pubblicato 22.
Inibizione BRCA2 induce una diminuzione della respirazione nelle cellule tumorali trattate cisplatino
Cellule tumorali A549 polmonari umani trattati con BRCA2-targeting ASO e cisplatino esibito una diminuzione precoce e irreversibile nella respirazione, rispetto alle cellule che hanno ricevuto il controllo ASO e cisplatino da solo; dopo 24 ore di trattamento con cisplatino differenza nella respirazione tra BRCA2 ASO e controllo ASO trattate cellule è stata 39% (Figura 1A). È importante sottolineare che, questa diminuzione nella respirazione avviato prima un calo rilevabile in adesione cellulare, suggerendo che ciò è avvenuto indipendentemente delle variazioni del numero di cellule. Respirazione iniziato a diminuire a circa 10 ore prima della prima goccia osservabile in aderenza, suggerendo che una goccia in respirazione può essere un evento formativo che precede la morte cellulare (Figura 1B). Nessuna differenza in acidification è stata osservata durante l'esperimento lasso di tempo 72 ore, suggerendo che BRCA2 ASO e trattamento cisplatino ha poco o nessun effetto sul metabolismo del glucosio (Figura 1C).
Inibizione BRCA2 combinato con il trattamento cisplatino diminuisce la frequenza di metastasi
Cellule tumorali A549 polmonari umani sono stati trattati con controllo ASO o BRCA2 ASO in presenza o assenza di cisplatino, e iniettati nella circolazione venosa della CAM (Figura 2A). Nove giorni dopo l'iniezione, cellule trattate con BRCA2 ASO e cisplatino mostravano una frequenza più bassa 77% di foci metastatici rispetto alle cellule di controllo trattate con ASO e cisplatino o BRCA2 ASO sola (Figura 2B). Questo suggerisce che BRCA2 ASO e il trattamento cisplatino ha il potenziale per ridurre o prevenire onere metastatico nei pazienti con tumori solidi.
Figura 1. Monitoraggio in tempo reale delle cellule A549 adesione delle cellule tumorali, la respirazione, e l'acidificazione. Sono state trasfettate con BRCA2 ASO, placcato su chip biosensori, e trattati con cisplatino per 24 ore utilizzando il Discovery System Bionas. Misure di (A) respirazione, (B) aderenza, e (C) acidificazione stati eseguiti ogni 4 min per un periodo di 72 ore. Rosa = controllo ASO, blu = BRCA2 ASO, verdi = controllano ASO + cisplatino, rosso = BRCA2 ASO + cisplatino. Figura adattato dal lavoro pubblicato con il permesso 22. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Enumerazione metastatico frefrequenza utilizzando un modello CAM embrione di pollo. cellule A549 trasfettate con BRCA2 ASO sono stati trattati con cisplatino per 6 ore, e poi iniettati nella circolazione venosa di un embrione di pollo: 9 giorno (A). Focolai metastatico (B) (visualizzato utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 40x) sono stati contati nove giorni dopo l'iniezione (C). Figura adattato dal lavoro pubblicato con il permesso 22. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
A causa del costo inerente e rischi associati a test clinici, vi è la necessità di sviluppare una migliore e più rigorosa metodologia di test pre-clinici per valutare adeguatamente nuovi regimi di trattamento anti-cancro. Attuali tecniche comunemente utilizzate tutte debolezze mostrano che possono limitare la loro capacità di discriminare tra potenzialmente promettenti terapeutici target / agenti, e quelli che possono essere meno efficaci. Abbiamo ideato un protocollo per valutare nuovi approcci anti-tumorali che affronta molte delle carenze dei metodi tradizionali.
Una caratteristica particolarmente importante del protocollo descritto è la capacità di misurare le risposte cellulari in tempo reale, e di tenere traccia delle modifiche nel metabolismo e l'adesione di minuto in minuto. Ciò consente l'identificazione di effetti dei farmaci di picco, il dosaggio ottimale e una comprensione più dettagliata della interazione tra i componenti del trattamento di combinazione farmacologica. Allo stesso tempo, permette di comprendere meglio Discreziote alterazioni metaboliche nelle cellule tumorali, che sono informazioni che non è fornito da conteggio delle cellule, l'apoptosi, o saggi dye-conversione. Un limite di questo saggio è l'impossibilità di determinare con precisione il tipo di morte cellulare che avviene durante il trattamento farmacologico. Cambiamenti nella viabilità saranno riflesse dai cambiamenti rispetto al chip biosensore, ma questo non fornisce informazioni riguardanti le modalità di morte cellulare. È anche possibile utilizzare la microscopia a fluorescenza e vivere tecniche di imaging cella per determinare i dati metabolici simili, e questo può essere utilizzato in aggiunta agli esperimenti descritti in questo protocollo 20,21.
Inoltre, l'uso del modello di embrione di pollo CAM per lo studio della frequenza metastatico dopo il trattamento è un modo efficace per determinare se un nuovo obiettivo, droga, o combinazione di droga diminuisce la frequenza di cellule tumorali che stravaso e / o invadono il tessuto circostante. Questa è una domanda particolarmente rilevante da un clipunto di vista tecnica, perché la malattia metastatica provoca un'alta percentuale di mortalità tra i pazienti affetti da cancro. Un fattore limitante potenziale è che il trattamento effettivo farmaco non si verifica nel CAM. Invece si verifica ex vivo e le cellule pre-trattate vengono poi iniettato nel CAM. Pertanto, questo dosaggio non fornisce informazioni riguardanti assorbimento farmaco o distribuzione in vivo. Inoltre, le iniezioni endovenose CAM sono tecnicamente impegnativi e richiedono pratica significativa / esperienza.
Abbiamo usato questo protocollo per valutare la capacità di un ASO-BRCA2 il targeting per sensibilizzare le cellule tumorali al DNA cisplatino droga dannosa. I risultati dei nostri esperimenti identificato BRCA2 come bersaglio promettente per l'attacco terapeutico, e anche fornito motivazioni per un ulteriore sviluppo pre-clinico del BRCA2 ASO come farmaco candidato. Prevediamo questo protocollo sia utilizzata per identificare nuovi bersagli per il trattamento di combinazione, in particolare nel settore in rapida crescita della DNUna inibizione di riparazione. Riteniamo che questo protocollo sarà meglio utilizzato in aggiunta alle tecniche più comuni in biologia del cancro, nel tentativo di valutare più rigorosamente nuovi approcci anti-cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato reso possibile da finanziamenti a JK dei Centri di eccellenza dell'Ontario e del Fondo di ricerca Ontario.
Vorremmo ringraziare Siddika Pardhan e il Dr. Peter Ferguson per l'assistenza tecnica durante le riprese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
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