Abstract
Devido ao elevado nível de heterogeneidade e inerentes mutações em cancros humanos, as terapias de agente único, ou combinações de drogas que têm como alvo a mesma via, são propensos a falhar. Ênfase deve ser colocada sobre a inibição de vias, que são responsáveis pela resistência intrínseca e / ou à terapia adaptativa. Um campo ativo de investigação é o desenvolvimento e teste de inibidores de reparo de DNA que promovem a ação de, e prevenir a resistência a, comumente usado quimioterapia e radioterapia. Utilizou-se um novo protocolo para avaliar a eficácia de inibição BRCA2 como um meio para sensibilizar células tumorais ao ADN prejudiciais cisplatina droga. O metabolismo das células do tumor (acidificação e respiração) foi monitorada em tempo real por um período de 72 h, para delinear a eficácia do tratamento em um minuto a minuto. Em combinação, foi realizada uma avaliação da freqüência metastático utilizando uma membrana corioalantóide embrião de galinha (CAM) modelo de extravasamento e invasão. Esteprotocolo aborda alguns dos pontos fracos dos comumente usados in vitro e in vivo para avaliar métodos novos esquemas de terapia do câncer. Ele pode ser usado em adição aos métodos comuns, tais como ensaios de proliferação celular, ensaios de morte celular, e os estudos in vivo de xenoenxertos de murina, para discriminar entre alvos mais de perto e de agentes candidatos, e seleccionar apenas os candidatos mais promissores para posterior desenvolvimento.
Introduction
A resistência adquirida ao alvo e / ou tratamento do cancro citotóxica é um problema clínico importante que pode levar ao fracasso do tratamento, recaída, e um aumento da mortalidade do paciente. Dado o elevado grau de heterogeneidade na maioria dos tumores, é uma certeza matemática que um tumor do número de células suficientemente elevado irá conter um subconjunto de células resistentes a terapias individuais ou combinadas de segmentação vias moleculares em que as referidas células dependem para a sobrevivência 2,3. Tais células tumorais podem ser seleccionadas positivamente por durante o tratamento, levando a recorrência da doença. O desenvolvimento de novas terapias que visam simultaneamente diferentes mecanismos de sobrevivência de células de cancro, quer antes ou depois da selecção mediada por tratamento, é, portanto, clinicamente importante.
Um elevado nível de instabilidade do genoma e mutação no genoma de tumor é uma característica fundamental que distingue as células de cancro a partir de células hospedeiras não-tumorais 4. Consequentemente, uma useful estratégia para aumentar a eficácia da quimioterapia danos no DNA e para prevenir o desenvolvimento da resistência é inibir activamente a reparação do ADN em células tumorais 5. Este é um campo ativo de investigação e de uma variedade de alvos de reparo de DNA novos estão sendo exploradas em um cenário pré-clínica. Uma série de pequenas moléculas ou inibidores à base de anti-sentido de estas metas foram desenvolvidos e são submetidos a testes 6-8. O objectivo é o de identificar os candidatos pré-clínicos mais promissoras e avaliar a sua segurança e eficácia em ensaios clínicos.
O alto custo dos ensaios clínicos e o risco de falha (para uma variedade de razões, incluindo a avaliação pré-clínica sub-ótima) são formidáveis obstáculos ao progresso no desenvolvimento de novas terapias 9. A utilização de modelos adequados e rigorosos pré-clínico para avaliar adequadamente novos alvos terapêuticos e medicamentos candidatos podem diminuir a elevada taxa de insucesso de 10 ensaios clínicos
Alguns métodos pré-clínicos comumente usados para avaliar a eficácia de novos regimes anti-cancro são: a) medição da capacidade para reduzir a proliferação de células tumorais in vitro (ensaios de proliferação celular), b) redução induzida pela terapia da capacidade de as células tumorais colónias de cultura de tecidos de forma (ensaios de formação de colónias), c) redução induzida pela terapia da actividade metabólica das células tumorais in vitro (conversão de corante redox), d) induzida por terapia de indução de morte in vitro de células de tumor (por apoptose, necrótica, autophagic, associado com a mitose e outros) 11, e e) a redução in vivo de crescimento ou ablação de xenoenxertos humanos e de rato induzida por terapia 12-14.
A principal deficiência dos métodos in vitro listados é que nenhum deles fornecer avaliação contínua em tempo real do efeito das terapias candidatos. Em vez disso, eles fornecem informações somente em pontos de tempo selecionado, amplamente separadosdurante o curso do tratamento. Tais medidas têm diminuído a capacidade para refletir com precisão a magnitude e tempo de respostas das células tumorais. In vivo modelos rato xenograft também são limitadas pelo alto custo, duração de tempo para ser concluído, e risco de dosagem e tratamento calendário abaixo do ideal (agendamento). Além disso, há evidências de que os modelos de xenoenxerto de roedor são preditores limitadas de eficácia clínica em seres humanos, em comparação com uma avaliação in vitro das respostas de células de tumores humanos primários e linhas celulares de tumores humanos estabelecidos a intervenções terapêuticas candidatos 15,16.
Eu inventei um protocolo combinação novela para avaliar novas combinações de medicamentos pré-clínica, de forma que aborda os pontos fracos dos procedimentos mais comuns listados acima. Em lugar de proliferação, a formação de colónias, ou ensaios de conversão de corante redox, utilizou-se uma unidade de medição de metabolismo para analisar a adesão celular, a respiração, a acidificação e em tempo realdurante todo o período de tratamento de 17. Simultaneamente, foram investigados os efeitos da combinação de tratamento in vivo usando um modelo de membrana corioalantóica (CAM) de invasão e metástase 18,19 embrião de galinha. Utilizou-se estes métodos para avaliar a capacidade de um oligonucleótido anti-sentido (ASO) BRCA2 direccionamento para potenciar a eficácia da cisplatina utilizada fármaco quimioterapêutico.
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Protocol
NOTA: O protocolo seguinte foi desenvolvido para utilização com células aderentes. As modificações são necessárias para aplicar o método com as células não-aderentes cultivadas em suspensão. Os ensaios de CAM descritas no protocolo são concebidos para utilização com células que expressam um marcador fluorescente (por exemplo, GFP, RFP, etc.). Nove dias de idade embriões de galinha são necessários no dia 2 do protocolo experimental para os experimentos CAM.
1. Preparação e transfecção de células de tumor com oligonucleótidos anti-sentido (ASOs)
- Aspirar o meio do frasco (s) contendo as células T75 de interesse, lavagem com PBS 1 X, e adicionar 2 ml de 0,25% de tripsina / EDTA. Adicionar 10 ml de meio de crescimento completo a cada balão e transferir as células em solução para um tubo de 50 ml. Contar as células e ajustar o volume para que a concentração final é de 1,0x10 células por 5 ml.
- Etiqueta de dois grupos de frascos T25: um grupo conterá oito frascos rotulados, 1-8, e irá ser used para o tempo real experiência de medição metabolismo; e o segundo grupo também conterá 8 frascos e irá ser utilizado para a experiência de CAM de embrião de galinha. Adicionar 2 ml de solução de células em cada balão e para lugar na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 O / N).
- Na manhã seguinte (Dia 0, Tempo 0), etiqueta três 5 ml tubos da seguinte forma: controle (não-alvo ASO ou siRNA), "alvo de interesse" (ou seja, visando ASO ou siRNA), e Lipofectamine 2000 (ou um semelhante o reagente de transfecção). Dilui-se as soluções de estoque de ASO a uma concentração adequada por meio isento de soro no tubo apropriado.
- Adicionar a quantidade necessária de reagente de transfecção para o tubo apropriado e incubar em meio isento de soro, durante 5 min. Adicionar a solução de reagente de transfecção para os tubos de ASO e incubar durante 20 min.
- Adicionar 250 uL de solução de reagente de transfecção controlo ASO para cada um dos frascos de 1-4 em cada grupo, e 250ul da solução de reagente de transfecção "alvo de interesse" ASO para cada um dos frascos de 5-8 em cada grupo. Incubar durante 4 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2).
- Durante a incubação, siga os passos descritos na secção 2.1. Após a incubação, adicionar 3 ml de meio completo a cada frasco no grupo experimental CAM e retornar à incubadora S / N (37 ᵒC, 5% de CO 2). Processe o grupo experimento metabolismo de acordo com a descrição na seção 2.2. Processe o experimento CAM definido de acordo com a descrição na seção 4.
2. Biosensor Chip Preparação e semeadura de células
- Em um ambiente estéril, lavar cuidadosamente seis chips biossensores com 400 ul de PBS. Esterilizar os chips com 400 mL de etanol a 70% para 20 min. Lavar três vezes com 400 ul de PBS.
- Coloque os chips dentro cultur tecido estérile pratos para evitar a contaminação. Coloque três chips em um prato chamado 'control', e três em um prato chamado 'alvo de interesse ".
- Rotular dois tubos de 50 ml como "controle" e "alvo de interesse". Lavar as células com PBS e adicionar um volume apropriado de 0,25% de tripsina / EDTA. Aguarde até que o separa de monocamada e recolher as células de cada frasco. Depositar a solução no tubo apropriado.
- Contar as células e ajustar o volume para que a concentração final é de 6.0x10 5 células / mL. Centrifuga-se e voltar a suspender as células se a concentração inicial é demasiado baixo.
- Adicionar 250 ul da solução de células para cada chip biossensor em que o grupo apropriado (para um total de 1.25x10 5 células por chip). Execute esta tarefa um grupo de cada vez para minimizar o risco de confundir os chips. Coloque os pratos estéreis contendo os chips dentro de uma câmara de umidade para evitar a evaporação, e colocar os cha umidadember na incubadora S / N (37 ᵒC, 5% de CO 2).
- Na manhã seguinte (Dia 1), aspirar cuidadosamente o meio de cada chip e substituí-la com 250 ul de meio de crescimento suplementado com soro 0,2% de bovino fetal (FBS) e 1x penicilina e estreptomicina (P / S). Incubar durante 4 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2).
3. Metabolismo Sistema de Medição Preparação e Solution Preparação
- Durante a incubação, preparar as soluções de drogas necessárias e o sistema de medição de metabolismo para o próximo ensaio.
NOTA: O sistema de medição metabolismo contém um total de seis módulos. Cada módulo acomoda um único chip a cada ensaio.- Subdividir o ensaio nos seguintes grupos experimentais: um chip da cada um dos "controlo" e "alvo de interesse" grupos para receber veículo para a duração do ensaio; dois chips de cada grupo a receber tratamento droga durante um período de tempo definido durante o umssay, seguido pelo veículo durante o período de lavagem.
- Para estudos de sensibilização de drogas, modificar o comprimento, tempo e concentração de tratamento de drogas para se adequar a droga particular em questão.
NOTA: Para cisplatina, as seguintes etapas foram determinados empiricamente com células A549, e pode variar dependendo da linha celular. Executar todas as etapas, com a taxa de fluxo padrão de 4 l / min.
6 hr de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S
24 hr de 6 mM cisplatina em meio + 0,2% FBS 1x P / S
24 h de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S
18 horas de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S
4 h de 0,1% de Triton-X
NOTA: Os desvios estes passos exigirá cálculo para determinar o volume necessário de soluções a médio e drogas com base na vazão desejada e duração do experimento. As secções que se seguem baseiam-se os passos descritos acima.
- Etiqueta e preencher catorze 50 ml tubos com 50 ml de meio de crescimento + 0,2% de FBS umd 1x P / S. Coloque seis em um suporte para tubos de medição do metabolismo do sistema, de seis em outro, e os dois restantes de um terceiro suporte de tubos que também contém tubos com cisplatina. Selar as duas primeiras cremalheiras com uma membrana permeável ao ar para prevenir a evaporação.
- Prepara-se uma solução de 6 pM de cisplatina (do volume apropriado) em meio + 0,2% de FBS com 1x P / S. Repartir o volume necessário de uma solução de cisplatina em quatro tubos de 50 ml marcados.
- Colocar os tubos nas restantes quatro slots no terceiro metabolismo suporte de tubos de medição. Certifique-se de que os tubos são colocados nas respectivas aberturas que correspondem aos biomodules desejados. Selar os tubos com uma membrana permeável ao ar.
- Preparar e rotular seis tubos de 50 ml e enchê-los com 20 ml cada uma solução 0,1% Triton-X no meio. A solução Triton-X vai lisar as células restantes e fornecer um valor "zero" para cada chip. Colocar os tubos em uma quarta medida metabolismo suporte para tubos de unidade e selar with uma membrana permable ar para evitar uma evaporação excessiva.
- Coloque as fichas no biomodules e iniciar o experimento.
4. CAM Experiment tratamento medicamentoso e Injeção
NOTA: As etapas e os procedimentos para a preparação embriões de galinha para um experimento CAM são descritos em outros lugares 19
- Começar a processar o hr pós-transfecção CAM experimento 48 (Dia 2). Sub-dividir o "controle" e "alvo de interesse" grupos em dois frascos para o veículo, e dois para a cisplatina. Aspirar o meio dos frascos e reconstituir ou com 3 ml de meio fresco, ou 6? M cisplatina. Incubar durante 6 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2).
- Aspirar o meio e, em seguida lavar e trypsinize as células; recolher as células tripsinizadas em solução em quatro rotulados apropriadamente tubos de 15 ml.
- Centrifugar e lavar as células três vezes com PBS. Re-suspender o sedimento de células em 5 ml de PBS umad contar as células.
- Ajustar o volume de forma a que a concentração celular final é 1,0x10 6 células / ml. Transferir a solução de células marcadas em tubos de 5 ml por injecção, e colocar em gelo. Inverta os tubos suavemente antes da injecção para assegurar que as células são bem misturados.
- Separe um total de 24 embriões de galinha (9 dias de idade) para injeção (6 por grupo). Realizar a injecção utilizando uma agulha de vidro ligada a um tubo flexível ligado a uma seringa de 1 ml. O indivíduo que executa a injecção deve ser cegos ao grupo de tratamento.
- Usando um microscópio estéreo, injectar 1,0x10 5 células em um volume de 100 ul para a circulação venosa da CAM. Usar uma técnica lenta, pulsante para injectar o volume total das células. Passe suavemente o local da injecção com um wipe para conter o fluxo de sangue e absorver qualquer derrame. Escreva em cada recipiente embrião adequadamente após cada injecção.
- Confirme a presença e distribuição de células fluorescentes na vasculatura da CAM após a injecção, visualizando-os utilizando um microscópio de fluorescência. Tome nota de todos os embriões na qual o número de células tumorais parece baixo, ou a distribuição é pobre.
- Coloque os embriões de galinha em uma câmara de umidade e armazená-los em uma incubadora (37 ° C, 60% de umidade). Aguarde 7-9 dias antes de enumerar focos metastáticos.
5. metastático Foco enumeração
- Durante o período de incubação de 7-9 dia, monitorar os embriões e descartar qualquer mortos. Certifique-se de que a câmara de umidade permanece úmido em todos os momentos durante o período de incubação.
- Usando um microscópio estéreo fluorescente com ampliação de 20x, verificar toda a superfície superior da CAM de embriões em, um padrão tipo grelha regular.
- Contar o número de focos de metástase em cada campo de visão, em seguida, contar o número para um total final por embrião. Se o fizer, para os seis embriões em cada grupo irá fornecer um número o médiof focos metastáticos por tratamento.
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Representative Results
Resultados e figuras adaptado com permissão de trabalho publicado em 22.
Inibição BRCA2 induz uma diminuição na respiração cisplatina em células tumorais tratadas
Células de câncer de pulmão humano A549 tratados com BRCA2-targeting ASO e cisplatina apresentaram uma diminuição precoce e irreversível na respiração, em comparação com as células que receberam o controlo ASO e cisplatina isolada; após 24 horas de tratamento com cisplatina a diferença de respiração entre BRCA2 ASO e controlo ASO células tratadas foi de 39% (Figura 1A). É importante notar que esta diminuição da respiração iniciada antes de uma gota detectável na adesão celular, o que sugere que este ocorreu independente de alterações do número de células. Respiração começaram a diminuir de cerca de 10 horas antes da primeira gota observável na adesão, sugerindo que uma queda na respiração pode ser um evento formativo que precede a morte celular (Figura 1B). Nenhuma diferença na acidification foi observada durante o ensaio de 72 h prazo, sugerindo que BRCA2 ASO e tratamento com cisplatina tem pouco ou nenhum efeito sobre o metabolismo da glucose (Figura 1C).
Inibição BRCA2 combinado com o tratamento com cisplatina diminui a freqüência de metástase
Células de cancro de pulmão humano A549 foram tratadas com controlo ASO ou BRCA2 ASO na presença ou na ausência de cisplatina, e injectado na circulação venosa da CAM (Figura 2A). Nove dias após a injecção, as células tratadas com BRCA2 ASO e cisplatina apresentaram uma frequência de 77% inferior de focos metastáticos em comparação com células de controlo tratadas com ASO e cisplatina, ou BRCA2 ASO sozinho (Figura 2B). Isto sugere que BRCA2 ASO e tratamento com cisplatina tem o potencial de reduzir, ou evitar carga metastática em pacientes com tumores sólidos.
Figura 1. monitorização em tempo real de células A549 a adesão de células tumorais, a respiração, e acidificação. BRCA2 foram transfectadas com ASO, é plaqueada em chips biossensores, e tratados com cisplatina durante 24 horas usando o Bionas Discovery System. Medições de (A) a respiração, (B) a aderência, e (C) a acidificação foram efectuadas todos os 4 min ao longo de um período de 72 h. Rosa = controlar ASO, azul = BRCA2 ASO, verde = controlar ASO + cisplatina, vermelho = BRCA2 ASO + cisplatina. Figura adaptada da obra publicada com permissão 22. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Enumerar metastático frefre- utilizando um modelo de CAM de embrião de galinha. As células A549 transf ectadas com BRCA2 ASO foram tratados com cisplatina durante 6 horas, e em seguida injectados para dentro da circulação venosa de um embrião de galinha 9 dias (A). Focos metastáticos (B) (visualizado usando um microscópio confocal com um objectivo 40x) foram contadas nove dias a seguir à injecção (C). Figura adaptada da obra publicada com permissão 22. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Devido ao custo inerente e os riscos associados com os ensaios clínicos, existe uma necessidade de desenvolver uma melhor e mais rigorosa metodologia de ensaio pré-clínico para avaliar adequadamente a novos regimes de tratamento anti-cancro. Atuais técnicas comumente usadas todas as fraquezas de exposição que podem limitar a sua capacidade de discriminar entre alvos terapêuticos potencialmente promissoras / agentes, e aqueles que podem ser menos eficaz. Eu inventei um protocolo para avaliar novas abordagens anti-câncer que aborda muitas das deficiências dos métodos tradicionais.
Um aspecto particularmente importante do protocolo descrito é a capacidade de medir as respostas celulares, em tempo real, e para acompanhar as mudanças no metabolismo e aderência minuto a minuto. Isto permite a identificação dos efeitos dos fármacos de pico, a dosagem óptima e uma compreensão mais detalhada da interacção entre os componentes do tratamento de combinação de fármacos. Ao mesmo tempo, fornece insights sobre desprestígioalterações metabólicas te nas células cancerosas, o que é informação que não é fornecido pela contagem de células, a apoptose, ou ensaios de dye-conversão. Uma limitação deste ensaio é a incapacidade de determinar com exactidão o tipo de morte celular que ocorre durante o tratamento com droga. Mudanças na viabilidade será refletido por mudanças na adesão ao chip biossensor, mas isso não fornece informações sobre a forma de morte celular. É também possível usar a microscopia de fluorescência e técnicas de imagem ao vivo de células para determinar os dados metabólicos semelhantes, e este pode ser utilizado para além das experiências descritas neste protocolo 20,21.
Além disso, a utilização do modelo CAM embrião de galinha para estudar frequência metastático após o tratamento é uma maneira eficaz para determinar se um novo alvo, droga, ou combinação de medicamentos diminui a freqüência de células cancerosas que extravasar e / ou invadir tecidos circundantes. Esta é uma questão particularmente relevante a partir de um cliponto de vista nica, porque a doença metastática provoca uma alta proporção de mortalidade entre os pacientes com câncer. Um potencial factor limitante é que o tratamento efectivo da droga não ocorre na CAM. Em vez disso, ocorre ex vivo e as células pré-tratadas são então injectado na CAM. Por isso, este ensaio não fornece informações sobre a absorção da droga ou a distribuição in vivo. Além disso, as injeções intravenosas CAM são tecnicamente desafiador e requer prática significativa / experiência.
Usamos este protocolo para avaliar a capacidade de um ASO-targeting BRCA2 para sensibilizar células tumorais para o DNA cisplatina droga prejudicial. Os resultados de nossas experiências identificadas BRCA2 como um alvo promissor para o ataque terapêutica, e também forneceu justificativa para um maior desenvolvimento pré-clínico do BRCA2 ASO como uma droga candidato. Nós encaramos este protocolo a ser utilizado para identificar alvos novos para tratamento de combinação, especialmente no florescente campo de DNA inibição de reparo. Nós sentimos que este protocolo vai ser melhor usado em conjunto com as técnicas mais comuns na biologia do câncer, em um esforço para avaliar com mais rigor novas abordagens anti-câncer.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi possível graças a subvenções a JK dos Centros de Excelência de Ontário e do Fundo de Investigação Ontario.
Gostaríamos de agradecer a Siddika Pardhan e Dr. Peter Ferguson para a assistência técnica durante as filmagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
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