Abstract
Debido al alto nivel de heterogeneidad y las mutaciones inherentes en los cánceres humanos, las terapias con agentes individuales, o regímenes de combinación que se dirigen a la misma vía, son propensos a fallar. Se debe poner énfasis en la inhibición de las vías que son responsables de la resistencia intrínseca y / o de adaptación a la terapia. Un campo activo de investigación es el desarrollo y prueba de los inhibidores de reparación del ADN que promueven la acción de, y prevenir la resistencia a, comúnmente utilizado la quimioterapia y la radioterapia. Se utilizó un nuevo protocolo para evaluar la eficacia de la inhibición de BRCA2 como un medio para sensibilizar a las células tumorales al medicamento cisplatino que daña el ADN. Metabolismo de la célula tumoral (la acidificación y la respiración) se monitorizó en tiempo real por un período de 72 horas para delinear la efectividad del tratamiento en un minuto a minuto. En combinación, se realizó una evaluación de la frecuencia metastásica utilizando una membrana corioalantoidea de embrión de pollo (CAM) modelo de la extravasación y la invasión. Esteprotocolo aborda algunas de las debilidades de los comúnmente utilizados in vitro y métodos in vivo para evaluar los regímenes de terapia del cáncer novedosas. Se puede utilizar además de los métodos comunes tales como ensayos de proliferación celular, ensayos de muerte celular, y estudios in vivo de xenoinjertos murinos en, discriminar más estrechamente entre los objetivos de candidatos y agentes, y seleccionar sólo los candidatos más prometedores para el desarrollo futuro.
Introduction
Resistencia al objetivo y / o el tratamiento del cáncer citotóxica es un problema clínico importante que puede conducir al fracaso del tratamiento, recaída adquirida, y el aumento de la mortalidad del paciente 1. Dado el alto nivel de heterogeneidad en la mayoría de los tumores, es una certeza matemática que un tumor del número de células suficientemente alto contendrá un subconjunto de células resistentes a las terapias simples o combinadas dirigidas a las vías moleculares en que dichas células dependen para su supervivencia 2,3. Tales células tumorales pueden ser seleccionados positivamente para durante el tratamiento, dando lugar a recurrencia de la enfermedad. Desarrollo de nuevas terapias que se dirigen simultáneamente diferentes mecanismos de supervivencia de células cancerosas, ya sea antes o después de la selección del tratamiento mediada, por lo tanto es clínicamente importante.
Un alto nivel de inestabilidad del genoma y la mutación en los genomas tumorales es una característica fundamental que distingue a las células cancerosas de las células huésped no tumorales 4. En consecuencia, un useful estrategia para aumentar la eficacia de la quimioterapia que daña el ADN y para prevenir el desarrollo de resistencia es para inhibir activamente la reparación del ADN en las células tumorales 5. Este es un campo activo de investigación y una variedad de objetivos de reparación del ADN novedosas se están estudiando en un entorno pre-clínico. Una serie de pequeñas moléculas o inhibidores basados en antisentido de estos objetivos se han desarrollado y están en fase de pruebas 6.8. El objetivo es identificar los candidatos pre-clínicas más prometedoras y evaluar su seguridad y eficacia en los ensayos clínicos.
El alto costo de los ensayos clínicos y el riesgo de fracaso (para una variedad de razones, incluyendo la evaluación preclínica subóptima) son obstáculos formidables para progresar en el desarrollo de nuevas terapias 9. El uso de modelos apropiados y rigurosos pre-clínico para evaluar adecuadamente nuevas dianas terapéuticas y fármacos candidatos puede disminuir la alta tasa de fracaso de los ensayos clínicos 10
Algunos métodos de pre-clínicos utilizados comúnmente para evaluar la efectividad de los regímenes anti-cáncer novela son: a) medición de la capacidad para reducir la proliferación de células tumorales in vitro (ensayos de proliferación celular) b) reducción, inducida por el tratamiento en la capacidad de las células tumorales a colonias de cultivo de tejido forma (ensayos de formación de colonias), c) la reducción inducida por el tratamiento en la actividad metabólica de las células tumorales in vitro (conversión redox-dye), d) inducidos por la terapia de inducción de la muerte celular in vitro del tumor (apoptótico, necrótico, autophagic, asociado con la mitosis y otros) 11, y e) in vivo reducción del crecimiento o la ablación de humanos y de ratón xenoinjertos 12-14 terapia inducida.
Una debilidad importante de los métodos enumerados in vitro es que ninguno de ellos proporciona una evaluación continua en tiempo real de los efectos de las terapias candidatos. Más bien, ellos proporcionan información sólo a los puntos de tiempo seleccionados, ampliamente separadas-durante el curso del tratamiento. Tales medidas han disminuido la capacidad de reflejar con exactitud la magnitud y el momento de las respuestas de células tumorales. En vivo modelos de xenoinjertos de ratón también están limitados por el alto costo, la duración de tiempo en completarse, y el riesgo de dosificación y tratamiento momento subóptimo (programación). Además, hay evidencia de que los modelos de xenoinjerto de roedores son predictores limitados de eficacia clínica en humanos, en comparación con la evaluación in vitro de las respuestas de las células tumorales humanas primarias y establecidas las líneas celulares tumorales humanas a candidatos intervenciones terapéuticas 15,16.
Hemos ideado un nuevo protocolo de combinación para evaluar nuevas combinaciones de fármacos pre-clínica, de una manera que aborda las deficiencias de los procedimientos más comunes que se enumeran anteriormente. En lugar de la proliferación, la formación de colonias, o ensayos de conversión redox en colorantes, se utilizó una unidad de medición para analizar el metabolismo de la adhesión celular, la respiración, y la acidificación en tiempo realdurante todo el periodo de tratamiento de 17. Al mismo tiempo, se investigaron los efectos de la combinación de tratamiento in vivo mediante el uso de un embrión de pollo modelo corioalantoica membrana (CAM) de la invasión y la metástasis 18,19. Se utilizó estos métodos para evaluar la capacidad de un oligonucleótido antisentido (ASO) dirigidos BRCA2 para potenciar la eficacia del cisplatino fármaco quimioterapéutico comúnmente utilizado.
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Protocol
NOTA: El siguiente protocolo fue diseñado para su uso con células adherentes. Se requieren modificaciones para aplicar el método a las células no adherentes cultivadas en suspensión. Los experimentos CAM descritos en el protocolo están diseñados para su uso con las células que expresan un marcador fluorescente (por ejemplo, GFP, RFP, etc.). Nueve días embriones de pollo de edad se requieren en el día 2 del protocolo experimental para los experimentos CAM.
1. Preparación y transfección de células tumorales con oligonucleótidos antisentido (ASO)
- Aspirar medio de T75 frasco (s) que contiene células de interés, lavar con 1XPBS, y añadir 2 ml de 0,25% de tripsina / EDTA. Añadir 10 ml de medio de crecimiento completo a cada matraz y transferir las células en solución a un tubo de 50 ml. Contar las células y ajustar el volumen de forma que la concentración final es 1.0x10 5 células por ml.
- Etiqueta dos grupos de matraces T25: un grupo se contienen ocho frascos etiquetados, 1-8, y estarán used para el tiempo real experimento de medición del metabolismo; y el segundo grupo también contendrá 8 matraces y será utilizado para el experimento CAM de embrión de pollo. Añadir 2 ml de células en solución a cada matraz y el lugar en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 O / N).
- A la mañana siguiente (día 0, Tiempo 0), la etiqueta de tres tubos de 5 ml de la siguiente manera: control (no de metas de ASO o siRNA), "diana de interés" (es decir, la orientación ASO o siRNA) y Lipofectamine 2000 (o similar reactivo de transfección). Diluir las soluciones de stock ASO a la concentración apropiada con medio libre de suero en el tubo apropiado.
- Añadir la cantidad requerida de reactivo de transfección en el tubo apropiado y se incuban en medio libre de suero durante 5 min. Añadir la solución de reactivo de transfección a los tubos de ASO y se incuba durante 20 min.
- Añadir 250 l de solución de control reactivo de transfección ASO a cada uno de los matraces 1-4 en cada grupo, y 250l de solución de reactivo de transfección 'diana de interés' ASO a cada uno de los matraces 5-8 en cada grupo. Incubar durante 4 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2).
- Durante la incubación, llevar a cabo los pasos descritos en la sección 2.1. Después de la incubación, añadir 3 ml de medio completo a cada matraz en el grupo experimento CAM y volver a la incubadora de O / N (37 ᵒC, 5% de CO 2). Procesar el grupo experimento metabolismo según la descripción en el apartado 2.2. Procesar el experimento CAM establecerá según la descripción en la sección 4.
2. Biosensor Preparación Chip y la siembra de células
- En un entorno estéril, lavar cuidadosamente seis chips biosensores con 400 l de PBS. Esterilizar los chips con 400 l de etanol al 70% durante 20 min. Lavar tres veces con 400 l de PBS.
- Coloque los chips dentro cultur tejido estérile platos para evitar la contaminación. Coloque tres fichas en un plato llamado 'el control', y tres en un plato llamado 'blanco de interés'.
- Etiquetar dos tubos de 50 ml como 'control' y 'blanco de interés'. Lavar las células con PBS y añadir un volumen apropiado de 0,25% de tripsina / EDTA. Espere hasta que los separa en monocapa y recoger las células de cada matraz. Depositar la solución en el tubo apropiado.
- Contar las células y ajustar el volumen de forma que la concentración final es 6.0x10 5 células / ml. Centrifugar y resuspender las células si la concentración inicial es demasiado baja.
- Añadir 250 l de la solución de células para cada chip biosensor en el grupo apropiado (para un total de 1.25x10 5 células por chip). Realice este un grupo de tareas a la vez para minimizar el riesgo de confundir las fichas. Colocar los recipientes estériles que contienen las fichas dentro de una cámara de humedad para evitar la evaporación, y colocar las cha humedadmber en la incubadora O / N (37 ᵒC, 5% de CO 2).
- A la mañana siguiente (día 1), aspirar cuidadosamente el medio de cada chip y reemplazarla con 250 l de medio de crecimiento suplementado con suero bovino fetal 0,2% (FBS) y 1x penicilina y estreptomicina (P / S). Incubar durante 4 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2).
3. Metabolismo Medición de preparación del sistema y Preparación de la solución
- Durante la incubación, preparar las soluciones necesarias de drogas y el sistema de medición del metabolismo para el próximo ensayo.
NOTA: El sistema de medición del metabolismo contiene un total de seis módulos. Cada módulo tiene capacidad para un chip por experimento.- Subdividir el ensayo en los siguientes grupos experimentales: una ficha de cada uno de los 'control' y 'objetivo de interés' grupos para recibir vehículo durante la duración del ensayo; dos chips de cada grupo para recibir tratamiento contra las drogas por un período definido de tiempo durante el assay, seguido de vehículo durante el período de lavado.
- Para estudios de sensibilización de drogas, modificar la duración, el tiempo, y la concentración de tratamiento de drogas para adaptarse a la droga en cuestión.
NOTA: Para el cisplatino, los siguientes pasos se determinaron empíricamente con células A549, y puede variar dependiendo de la línea celular. Realice todas las etapas con el caudal predeterminado de 4 l / min.
6 h de crecimiento medio + 0,2% de SFB y 1x P / S
24 h de 6 micras cisplatino en medio + 0,2% de SFB 1x P / S
24 h de crecimiento medio + 0,2% de SFB y 1x P / S
18 h de crecimiento medio + 0,2% de SFB y 1x P / S
4 h de 0,1% Triton X-
NOTA: Las desviaciones de estos pasos requerirán cálculo para determinar el volumen necesario de soluciones de mediano y medicina basada en el caudal deseado y la duración del experimento. En las secciones siguientes se basan en los pasos descritos anteriormente.
- Etiqueta y llenar catorce tubos de 50 ml con 50 ml de medio de crecimiento + 0,2% FBS unad 1x P / S. Coloque las seis de una medición metabolismo bastidor de tubo de sistema, seis en otro, y los dos restantes en un tercer bastidor de tubo que contiene también tubos con cisplatino. Sellar los dos primeros bastidores con una membrana permeable al aire para evitar la evaporación.
- Preparar una solución de 6 micras cisplatino (del volumen apropiado) en medio de + 0,2% de SFB con 1x P / S. Dispensar el volumen requerido de solución de cisplatino en cuatro tubos de 50 ml marcados.
- Colocar los tubos en las cuatro ranuras restantes en el bastidor de tubo de medición tercera metabolismo. Asegúrese de que los tubos se colocan en las ranuras correspondientes que corresponden a los biomodules deseados. Sellar los tubos con una membrana permeable al aire.
- Preparar y etiquetar seis tubos de 50 ml y llenarlos con 20 ml cada una de 0,1% de solución de Triton-X en el medio. La solución de Triton-X se lisar las células restantes y proporcionar un valor "cero" para cada chip. Colocar los tubos en un bastidor de tubo unidad de medición Cuarta metabolismo y sellar ingenioh una membrana permable de aire para evitar la evaporación excesiva.
- Cargar las fichas en las biomodules e iniciar el experimento.
4. Experimento CAM Tratamiento de Drogas y Inyección
NOTA: Los pasos y el procedimiento para la preparación de embriones de pollo para un experimento de CAM se describe en otra parte 19
- Iniciar la tramitación de la CAM experimento de 48 horas después de la transfección (Día 2). Sub-dividir el 'control' y 'objetivo de interés' grupos en dos matraces de vehículo, y dos para el cisplatino. Aspirar el medio de los matraces y reponer, ya sea con 3 ml de medio fresco, o 6 mu M de cisplatino. Incubar durante 6 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2).
- Aspirar el medio, luego lavar y trypsinize las células; recoger las células tratadas con tripsina en solución en cuatro debidamente etiquetados tubos de 15 ml.
- Centrifugar y lavar las células tres veces con PBS. Vuelva a suspender el sedimento celular en 5 ml de PBS unad contar las células.
- Ajuste el volumen para que la concentración final de células es 1.0x10 6 células / ml. Transferir la solución de células en la etiqueta tubos de 5 ml para inyección, y colocar en hielo. Invertir suavemente los tubos antes de la inyección para asegurar que las células estén bien mezclados.
- Ponga a un lado un total de 24 embriones de pollo (9 días de edad) para la inyección (6 por grupo). Realizar la inyección usando una aguja de vidrio unida a un tubo flexible conectado a una jeringa de 1 ml. La persona que realiza la inyección debe ser cegado al grupo de tratamiento.
- Utilizando un microscopio estéreo, inyectar 1.0x10 5 células en un volumen de 100 l en la circulación venosa de la CAM. Utilice una técnica pulsante lenta para inyectar el volumen completo de las células. Frote suavemente la zona de inyección con una toallita suave para detener el flujo de sangre y absorber cualquier derrame. Etiqueta cada envase embrión adecuadamente después de cada inyección.
- Confirmar la presencia y distribución de células fluorescentes en la vasculatura de la CAM después de la inyección mediante la visualización de ellos usando un microscopio fluorescente. Tome nota de los embriones en el que el número de células tumorales parece baja, o la distribución sea pobre.
- Coloca los embriones de pollo en una cámara de humedad y almacenarlos en una incubadora (37 ° C, 60% de humedad). Espere 7-9 días antes de la enumeración de los focos metastásicos.
5. metastásico Focus Enumeración
- Durante el periodo de incubación de 7-9 días, seguimiento de los embriones y descartar los muertos. Asegúrese de que la cámara de humedad permanece húmedo en todo momento durante el período de incubación.
- Utilizando un microscopio fluorescente estéreo de 20 aumentos, escanear toda la superficie superior de la CAM de embriones en un patrón regular, en forma de rejilla.
- Cuente el número de focos metastásicos en cada campo de visión, y luego contar el número de un total definitivo por embrión. Si lo hace, para los seis embriones en cada grupo proporcionará un número o mediaf focos metastásicos por tratamiento.
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Representative Results
Resultados y cifras adaptadas con permiso de trabajo publicado 22.
BRCA2 inhibición induce una disminución en la respiración en las células tumorales tratadas con cisplatino
Las células del cáncer de pulmón humano A549 tratados con BRCA2 de metas ASO y cisplatino exhibido una disminución temprana e irreversible en la respiración, en comparación con las células que recibieron el control de ASO y cisplatino solo; después de 24 h de tratamiento con cisplatino la diferencia en la respiración entre BRCA2 ASO y control ASO células tratadas fue de 39% (Figura 1A). Es importante destacar que esta disminución en la respiración comenzó antes de una caída detectable en la adhesión celular, lo que sugiere que esto ocurrió independiente de los cambios en el número de células. La respiración comenzó a disminuir aproximadamente 10 h antes de la primera caída observable en la adhesión, lo que sugiere que una gota en la respiración puede ser un evento formativo que precede a la muerte celular (Figura 1B). No hay diferencia en acidification se observó durante el experimento plazo de 72 horas, lo que sugiere que BRCA2 ASO y el tratamiento con cisplatino tiene poco o ningún efecto sobre el metabolismo de la glucosa (Figura 1C).
Inhibición BRCA2 combinado con el tratamiento con cisplatino disminuye la frecuencia de la metástasis
Células de cáncer de pulmón humano A549 se trataron con control de ASO o BRCA2 ASO en presencia o ausencia de cisplatino, y se inyectaron en la circulación venosa de la CAM (Figura 2A). Nueve días después de la inyección, las células tratadas con BRCA2 ASO y cisplatino mostraron una frecuencia de 77% menor de focos metastásicos en comparación con las células tratadas con el control de ASO y cisplatino, o BRCA2 ASO sola (Figura 2B). Esto sugiere que BRCA2 ASO y tratamiento con cisplatino tiene el potencial para disminuir o prevenir la carga metastásica en pacientes con tumores sólidos.
Figura 1. monitoreo en tiempo real de la adhesión de células tumorales, la respiración y la acidificación. A549 células fueron transfectadas con BRCA2 ASO, chapada en chips biosensores, y tratado con cisplatino durante 24 horas utilizando el Sistema de Descubrimiento Bionas. Las mediciones de (A) la respiración, (B) la adherencia, y (C) la acidificación se realizaron cada 4 minutos durante un período de 72 h. Pink = controlar ASO, azul = BRCA2 ASO, verde = controlan ASO + cisplatino, rojo = BRCA2 ASO + cisplatino. Figura adaptada de la obra publicada con permiso 22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Enumerar metastásico frefre- utilizando un modelo de CAM de embrión de pollo. células A549 transfectadas con BRCA2 ASO fueron tratados con cisplatino durante 6 h, y luego se inyecta en la circulación venosa de un embrión de pollo de 9 días de edad (A). Focos metastásicos (B) (visualizado usando un microscopio confocal con un objetivo de 40x) se contaron nueve días después de la inyección (C). Figura adaptada de la obra publicada con permiso 22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Debido al coste inherente y el riesgo asociado con los ensayos clínicos, hay una necesidad de desarrollar una mejor y más rigurosa metodología de prueba pre-clínica para evaluar adecuadamente los regímenes de tratamiento contra el cáncer novedosas. Las técnicas actuales de uso común todas las debilidades de exposición que pueden limitar su capacidad para discriminar entre objetivos / agentes terapéuticos potencialmente prometedoras, y aquellos que pueden ser menos eficaces. Hemos elaborado un protocolo para evaluar nuevos enfoques contra el cáncer que aborda muchas de las deficiencias de los métodos tradicionales.
Una característica particularmente importante del protocolo descrito es la capacidad para medir las respuestas celulares en tiempo real, y para seguir los cambios en el metabolismo y la adhesión minuto por minuto. Esto permite la identificación de los efectos de drogas pico, la dosificación óptima y una comprensión más detallada de la interacción entre los componentes del tratamiento de combinación de drogas. Al mismo tiempo, da una idea de discrealteraciones metabólicas del te en las células cancerosas, que es información que no está previsto por el recuento de células, la apoptosis, o ensayos de tinte de conversión. Una limitación de este ensayo es la incapacidad para determinar con precisión el tipo de muerte celular que se está produciendo durante el tratamiento de drogas. Los cambios en la viabilidad se verá reflejado por los cambios en la adherencia al chip biosensor, pero esto no proporciona información sobre la forma de la muerte celular. También es posible utilizar microscopía de fluorescencia y vivir técnicas de imagen de células para determinar datos metabólicos similares, y esto puede ser utilizado además de los experimentos descritos en este protocolo 20,21.
Además, el uso del modelo de CAM de embrión de pollo para estudiar la frecuencia de metástasis tras el tratamiento es una manera eficaz para determinar si un nuevo objetivo, o la combinación de fármacos medicamento disminuye la frecuencia de las células cancerosas que la extravasación y / o invaden el tejido circundante. Esta es una pregunta particularmente relevante desde un clipunto de vista nica, porque la enfermedad metastásica provoca una alta proporción de mortalidad entre los pacientes de cáncer. Un factor limitante potencial es que el tratamiento de fármaco real no se produce en la CAM. En lugar de ello se produce ex vivo y las células pre-tratadas se inyecta en la CAM. Por lo tanto, este ensayo no proporciona información con respecto a la absorción del fármaco o la distribución in vivo. Además, las inyecciones intravenosas CAM son técnicamente difíciles y requieren de práctica / experiencia significativa.
Se utilizó este protocolo para evaluar la capacidad de un ASO BRCA2 de metas para sensibilizar las células tumorales a la DNA medicamento cisplatino perjudicial. Los resultados de nuestros experimentos identificaron BRCA2 como un objetivo prometedor para el ataque terapéutico, y también proporcionaron justificación para un mayor desarrollo pre-clínico de la BRCA2 ASO como un fármaco candidato. Tenemos la visión de este protocolo que se utiliza para identificar nuevos objetivos para el tratamiento de combinación, sobre todo en el floreciente campo de DNUna inhibición reparación. Sentimos que este protocolo se utiliza mejor, además de las técnicas más comunes en la biología del cáncer, en un esfuerzo para evaluar con más rigor los nuevos enfoques contra el cáncer.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido posible gracias a las subvenciones a JK de los Centros de Excelencia de Ontario y el Fondo de Investigación de Ontario.
Nos gustaría dar las gracias a Siddika Pardhan y el Dr. Peter Ferguson para la asistencia técnica durante el rodaje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
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