Abstract
På grunn av det høye nivået av heterogenitet og mutasjoner som ligger i kreft hos mennesker, monoterapi behandlinger, eller kombinasjonsregimer som retter seg mot samme vei, er sannsynlig å mislykkes. Det må legges vekt på hemming av veier som er ansvarlig for indre og / eller adaptive resistens mot behandlingen. En aktiv innen etterforskning er utvikling og testing av DNA-reparasjons hemmere som fremmer virkningen av, og hindre motstand mot, som vanligvis brukes kjemoterapi og strålebehandling. Vi brukte en ny protokoll for å evaluere effektiviteten av BRCA2-inhibering som et middel for å sensibilisere tumorceller for DNA-ødeleggende medikament cisplatin. Svulst celle metabolisme (forsuring og respirasjon) ble overvåket i sanntid for en periode på 72 timer for å avgrense behandlingseffektivitet på et minutt for minutt basis. I kombinasjon, utførte vi en vurdering av metastatisk frekvens ved hjelp av en kylling embryo chorioallantoic membran (CAM) modell av ekstravasasjon og invasjon. Detteprotokollen adressene noen av svakhetene som vanligvis brukes in vitro og in vivo metoder for å vurdere nye kreftterapi regimer. Den kan brukes i tillegg til vanlige metoder som for eksempel celle proliferasjonsanalyser, celledød analyser og in vivo murine xenograft-studier, for nærmere å diskriminere blant kandidat mål og midler, og velger kun de mest lovende kandidater for videre utvikling.
Introduction
Ervervet resistens til målrettet og / eller cytotoksisk kreftbehandling er en viktig klinisk problem som kan føre til behandlingssvikt, tilbakefall, og økt pasient dødelighet 1. Gitt den høye grad av heterogenitet i de fleste tumorer, er det en matematisk sikkerhet at en tumor i tilstrekkelig høy celletallet vil inneholde et undersett av celler som er resistente mot enkle eller kombinerte terapier rettet mot molekylære reaksjonsveier som disse cellene avhengige av for overlevelse 2,3. Slike tumorceller kan bli positivt valgt for under behandlingen, noe som fører til tilbakefall av sykdommen. Utvikling av nye behandlingsformer som samtidig retter seg mot forskjellige cancer-celle overlevelse mekanismer, enten før eller etter behandling-mediert valg, er således klinisk viktige.
Et høyt nivå av genom ustabilitet og mutasjon i tumor genomer er et grunnleggende trekk som skiller kreftceller fra ikke-svulstvertsceller 4. Følgelig en useful strategi for å øke effektiviteten av DNA-skadende kjemoterapi og for å hindre utvikling av resistens er aktivt å hemme DNA-reparasjon i tumorceller 5. Dette er en aktiv felt av undersøkelse og en stor mengde av nye DNA-reparasjons mål blir undersøkt i en pre-klinisk miljø. En rekke små molekyl eller antisense-baserte hemmere av disse målene har blitt utviklet og er under testing 6-8. Målet er å identifisere de mest lovende prekliniske kandidater og vurdere deres sikkerhet og effekt i kliniske studier.
Den høye kostnaden for kliniske studier, og risikoen for å mislykkes (for en rekke årsaker, inkludert sub-optimal pre-klinisk evaluering) er formidable hindringer for å komme videre i utviklingen av nye behandlingsformer 9. Bruk av riktige og strenge pre-kliniske modeller å tilstrekkelig evaluere nye terapeutiske mål og kandidat legemidler kan redusere den høye strykprosent av kliniske studier 10
Noen vanlig brukte pre-kliniske metoder for å evaluere effektiviteten av nye anti-kreft-regimer er: a) måling av evnen til å redusere tumorcelleformering in vitro (celle proliferasjonsanalyser), b) terapi-indusert reduksjon i kapasitets av tumorceller til skjema vevskultur kolonier (kolonidannelse analyser), c) terapi-indusert reduksjon i tumorcelle metabolsk aktivitet in vitro (redox-farvestoff-konvertering), d) terapi-fremkalt induksjon av in vitro tumor celledød (apoptose, nekrotisk, autophagic, forbundet med mitose og andre) 11, og e) in vivo terapi-indusert reduksjon i vekst eller ablasjon av humane og mus xenograft 12-14.
En stor svakhet av de nevnte in vitro-metoder er at ingen av dem gir kontinuerlig sanntids evaluering av effekten av kandidat terapier. Snarere, de gir informasjon kun på utvalgte, mye separerte tidspunkteri løpet av behandlingen. Slike målinger har redusert kapasitet til å gjenspeile størrelsen og timingen av tumorcelle svar. In vivo mus xenograft modeller er også begrenset av høye kostnader, lang tid å fullføre, og risikoen for sub-optimal dosering og behandling timing (planlegging). I tillegg er det bevis for at gnager xenograft modeller er begrenset prediktorer for klinisk effekt hos mennesker, sammenlignet med in vitro vurdering av svarene av primære humane tumorceller og etablerte humane tumorcellelinjer til kandidat terapeutiske intervensjoner 15,16.
Vi utviklet en ny kombinasjon protokoll for å evaluere nye medikamentkombinasjoner pre-klinisk, på en måte som tar for seg svakheter ved de mer vanlige prosedyrene nevnt ovenfor. I stedet for proliferasjon, kolonidannelse, eller redoks-fargestoff konverterings assays, benyttet vi en metabolisme måleenhet for å analysere celleadhesjon, respirasjon, og surgjøring i sanntidunder hele behandlingsperioden 17. Samtidig har vi undersøkt effekten av behandlingen kombinasjon in vivo ved å bruke et kylling embryo chorioallantoic membran (CAM) modell av invasjon og metastase 18,19. Vi brukte disse fremgangsmåter for å evaluere evnen av et antisense-oligonukleotid (ASO) rettet BRCA2 å forsterke effektiviteten av den vanlig brukte kjemoterapeutisk middel cisplatin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Følgende protokoll er designet for bruk med heftende celler. Endringer er nødvendig for å bruke metoden til ikke-heftende celler dyrket i suspensjon. CAM-forsøk som er beskrevet i protokollen er konstruert for bruk sammen med celler som uttrykker en fluorescerende markør (f.eks, GFP, RFP, etc.). Ni dager gamle kyllingembryoer er nødvendig på dag 2 av den eksperimentelle protokollen for CAM-eksperimenter.
1. Forberedelse og Transfeksjon av tumorceller med Antisenseoligonukleotider (Asos)
- Aspirer medium fra T75 kolbe (e) som inneholder celler av interesse, vask med 1XPBS, og tilsett 2 ml 0,25% trypsin / EDTA. Tilsett 10 ml komplett vekstmedium til hver kolbe og overføre cellene i oppløsning i et 50 ml rør. Telle cellene og justere volumet, slik at den endelige konsentrasjonen er 1.0x10 5 celler per ml.
- Label to grupper av T25 kolber: én gruppe vil inneholde åtte kolber, merket 1-8, og vil være used for sanntids metabolisme måling eksperiment; og den andre gruppen også inneholde 8 kolber, og vil bli brukt for kyllingembryo CAM forsøket. Tilsett 2 ml celler i oppløsning til hver kolbe, og plasser i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2 O / N).
- Neste morgen (dag 0, Time 0), etikett tre 5 ml rør som følger: kontroll (non-målretting ASO eller siRNA), 'mål av interesse "(dvs. rettet mot ASO eller siRNA), og Lipofectamine 2000 (eller en lignende transfeksjon reagens). Fortynne lager ASO løsninger til passende konsentrasjon med serumfritt medium i passende rør.
- Tilsett nødvendig mengde transfeksjon reagens til det aktuelle røret, og inkubasjon i serumfritt medium i 5 min. Tilsett transfeksjon reagensoppløsning til ASO rørene og inkuber i 20 min.
- Tilsett 250 ul av kontroll ASO transfeksjon reagensoppløsning til hver av kolbene 1-4 i hver gruppe, og 250ul av "mål av interesse 'ASO transfeksjon reagensoppløsning til hver av kolbene 5-8 i hver gruppe. Inkuber i 4 timer (37 ᵒC, 5% CO2).
- Under inkubasjon, utføre trinnene som er beskrevet i kapittel 2.1. Etter inkubering tilsett 3 ml komplett medium i hver kolbe i CAM forsøket gruppe og tilbake til inkubatoren O / N (37 ᵒC, 5% CO2). Behandle stoffskiftet eksperiment gruppen i henhold til beskrivelsen i kapittel 2.2. Behandle CAM eksperiment angitt i henhold til beskrivelsen i § 4.
2. Biosensor Chip Forberedelse og Cell Seeding
- I et sterilt miljø, vaskes grundig seks biosensor chips med 400 ul PBS. Sterilisere chips med 400 mL av 70% etanol for 20 min. Vask tre ganger med 400 ul PBS.
- Plassere chips inne sterilt vev culture retter å hindre forurensning. Plasser tre chips i en skål merket "kontroll", og tre i en tallerken merket "target av interesse".
- Etikett to 50 ml tuber som "kontroll" og "target av interesse". Vask celler med PBS og legge en passende volum på 0,25% Trypsin / EDTA. Vent til monolaget løsner og samle cellene fra hver kolbe. Sette løsningen inn i riktig tube.
- Telle cellene og justere volumet, slik at den endelige konsentrasjonen er 6.0x10 5 celler / ml. Sentrifuger og resuspender cellene hvis den opprinnelige konsentrasjon er for lav.
- Tilsett 250 ul av celleløsning til hver biosensor chip i den aktuelle gruppe (for totalt 1.25x10 5 celler per chip). Utføre denne oppgaven én gruppe om gangen for å minimere risikoen for forvirrende sjetongene. Plasser sterile retter som inneholder chips inne i en luftfuktighet kammer for å hindre fordamping, og plasser luftfuktighet chamber i inkubatoren O / N (37 ᵒC, 5% CO2).
- Den neste morgen (dag 1), forsiktig aspirere mediet fra hver chip og erstatte den med 250 ul vekstmedium supplementert med 0,2% føtalt bovint serum (FBS), og 1 x penicillin og streptomycin (P / S). Inkuber i 4 timer (37 ᵒC, 5% CO2).
3. Metabolisme målesystem Forberedelse og Solution Forberedelse
- I løpet av inkubasjonen, fremstille de nødvendige medikamentløsninger og metabolismen målesystem for den kommende analysen.
MERK: Metabolismen målesystemet inneholder totalt seks moduler. Hver modul har plass en chip per eksperiment.- Dele analysen i følgende eksperimentgrupper: en chip fra hver av de "kontroll" og "mål av interesse 'grupper for å motta kjøretøyet for varigheten av analysen; to brikker fra hver gruppe for å få behandling for en definert tidsperiode i løpet av enssay, etterfulgt av kjøretøy under utvaskingsperiode.
- For narkotika allergi studier, endre lengden, timing, og konsentrasjonen av medikamentell behandling som passer den aktuelle stoffet i spørsmålet.
MERK: For cisplatin, ble følgende trinn bestemmes empirisk med A549 celler, og kan variere avhengig av cellelinje. Utføre alle stadier med standardstrømningshastighet på 4 mL / min.
6 timer av vekstmedium + 0,2% FBS og 1 x P / S
24 hr på 6 pM cisplatin i medium + 0,2% FBS 1 x P / S
24-timers vekstmedium + 0,2% FBS og 1 x P / S
18 timer av vekstmedium + 0,2% FBS og 1 x P / S
4 timer på 0,1% Triton-X
MERK: Avvik fra denne fremgangsmåten vil kreve beregning for å bestemme den nødvendige volum av medium og medikamentløsninger basert på den ønskede strømningshastighet og varigheten av forsøket. De følgende avsnittene er basert på trinnene som er beskrevet ovenfor.
- Etikett og fylle fjorten 50 ml rør med 50 ml vekstmedium + 0,2% FBS end 1x P / S. Plasser seks i ett metabolisme målesystem tube rack, seks i en annen, og de resterende to i en tredje tube rack som også inneholder rør med cisplatin. Forsegle de første to stativer med en luftpermeabel membran for å hindre fordampning.
- Fremstille en oppløsning av 6 pM cisplatin (av riktig volum) i medium + 0,2% FBS med 1 x P / S. Dispensere det nødvendige volum av cisplatin løsning i fire merkede 50 ml rør.
- Plasser rørene i de resterende fire spor i den tredje metabolisme måle rørstativ. Pass på at rørene er plassert i de aktuelle sporene som tilsvarer de ønskede biomodules. Forsegle rørene med en luft gjennomtrengelig membran.
- Forberede og merke seks 50 ml rør og fylle dem med 20 ml hver av 0,1% Triton-X løsning i medium. Triton-X-løsningen vil lysere eventuelle gjenværende celler og gir en "null" verdi for hver chip. Plasser rørene i en fjerde metabolisme måleenhet tube rack og forsegle viddh en luft permable membran for å hindre overdreven fordampning.
- Laste sjetongene inn i biomodules og starte eksperimentet.
4. CAM Experiment Drug Treatment og Injection
MERK: Trinnene og prosedyre for å forberede kylling embryoer for en CAM eksperiment er beskrevet andre steder 19
- Begynne å behandle CAM eksperiment 48 timer etter transfeksjon (Dag 2). Sub-dele "kontroll" og "target interesse 'grupper i to flasker for kjøretøy, og to for cisplatin. Aspirere mediet fra kolbene og fylle med enten 3 ml friskt medium, eller 6 pM cisplatin. Inkuber i 6 timer (37 ᵒC, 5% CO2).
- Aspirer medium, deretter vaske og trypsineres cellene; samle trypsinisert celler i løsning i fire hensiktsmessig merket 15 ml rør.
- Sentrifuger og vaske cellene tre ganger med PBS. Re-suspendere cellepelleten i 5 ml PBS end telle cellene.
- Justere volumet, slik at den endelige cellekonsentrasjonen er 1.0x10 6 celler / ml. Overføre celle løsning i merkede 5 ml rør for injeksjon, og legg på is. Invertere rørene forsiktig før injeksjon for å sikre at cellene er godt blandet.
- Avsatt totalt 24 kylling embryoer (9 dager gamle) for injeksjon (6 per gruppe). Utføre injeksjonen ved hjelp av en glass nål festet til en fleksibel slange som er koblet til en 1 ml sprøyte. Den enkelte utfører injeksjon bør blindet til behandlingsgruppen.
- Ved hjelp av et stereomikroskop, injiserer 1.0x10 5 celler i et volum på 100 ul i den venøse sirkulasjon av CAM. Bruke en langsom, pulserende teknikk for å injisere hele volumet av cellene. Forsiktig DAB injeksjonsstedet med en myk klut for å stanse strømmen av blod og absorbere søl. Merk hver embryo container hensiktsmessig etter hver injeksjon.
- Bekrefte tilstedeværelse og distrisjon av fluorescerende celler i blodkar av CAM etter injeksjon ved å visualisere dem ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Ta oppmerksom på eventuelle embryo der antallet kreftceller vises lav, eller fordelingen er dårlig.
- Legg kyllingembryoer i en fuktighet kammer og lagre dem i en inkubator (37 ° C, 60% fuktighet). Vente 7-9 dager før opplisting metastaser.
5. metastatisk Focus Enumeration
- I løpet av 7-9 dagers inkubasjonstid, overvåke embryoene og kast eventuelle døde. Sørg for at luftfuktigheten kammeret forblir fuktig hele tiden under inkubasjonstiden.
- Ved hjelp av en fluorescerende stereomikroskop ved 20X forstørrelse, skanne hele øvre overflate av embryoet CAM i et vanlig, gitterlignende mønster.
- Telle antall metastaser i hvert synsfelt, deretter telle antall for en endelig totalt per embryo. Gjør du det for de seks befruktede egg i hver gruppe vil gi et gjennomsnittlig antall of metastaser per behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultater og tall tilpasset med tillatelse fra publiserte arbeider 22.
BRCA2 inhibering induserer en reduksjon i respirasjon i cisplatinbehandlede tumorceller
Menneskelige A549 lungekreft celler behandlet med BRCA2-targeting ASO og cisplatin utstilt en tidlig og irreversibel nedgang i åndedrett, sammenlignet med celler som mottok kontroll ASO og cisplatin alene; etter 24 timers behandling med cisplatin forskjellen i respirasjonen mellom BRCA2 ASO og kontroll ASO behandlede celler var 39% (figur 1A). Viktigere, denne reduksjon i respirasjon startet før en påvisbar fall i celleadhesjon, noe som tyder på at dette skjedde uavhengig av endringer i celletallet. Respirasjon begynte å avta ca. 10 timer før den første iakttagelse av fallet i adhesjon, noe som tyder på at et fall i respirasjon kan være en formende arrangement som går forut for celledød (figur 1B). Ingen forskjell i acidification ble observert i løpet av 72 timer eksperiment tidsramme, noe som tyder på at BRCA2 ASO og cisplatin behandling har liten eller ingen effekt på glukosemetabolismen (figur 1C).
BRCA2 hemming kombinert med cisplatin behandling reduserer hyppigheten av metastaser
A549 humane lungekreftceller ble behandlet med kontroll ASO eller BRCA2 ASO i nærvær eller fravær av cisplatin, og injiseres i den venøse sirkulasjon av CAM (figur 2A). Ni dager etter injeksjon, celler behandlet med BRCA2 ASO og cisplatin oppviste en 77% lavere hyppighet av metastaser sammenlignet med celler behandlet med kontroll ASO og cisplatin, eller BRCA2 ASO alene (figur 2B). Dette tyder på at BRCA2 ASO og cisplatin behandling har potensial til å redusere eller forhindre metastatisk belastning hos pasienter med solide tumorer.
Figur 1. Real-time overvåkning av svulst celle tilslutning, respirasjon, og forsuring. A549 celler ble transfektert med BRCA2 ASO, platet på biosensor chips, og behandlet med cisplatin for 24 timer ved hjelp av Bionas Discovery System. Målinger av (A) respirasjon, (B) tilslutning, og (C) surgjøring ble utført hvert 4 min over en periode på 72 timer. Pink = kontrollere ASO, blå = BRCA2 ASO, grønn = kontrollere ASO + cisplatin, rød = BRCA2 ASO + cisplatin. Figur tilpasset fra publiserte arbeider med tillatelse 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. opplisting metastatisk frefrekvens ved hjelp av en kyllingembryo CAM-modellen. A549-celler transfektert med BRCA2 ASO ble behandlet med cisplatin i 6 timer, og deretter injiseres i den venøse sirkulasjon av en 9 dagers gamle kyllingembryo (A). Metastaser (B) (visualisert ved hjelp av et konfokalt mikroskop med et 40x objektiv) ble tellet ni dager etter injeksjon (C). Figur tilpasset fra publiserte arbeider med tillatelse 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av den iboende kostnader og risiko knyttet til kliniske studier, er det behov for å utvikle bedre og mer grundig pre-klinisk testing metodikk å tilstrekkelig evaluere nye anti-kreft behandlingsregimer. Dagens mest brukte teknikker alle utstillingen svakheter som kan begrense deres evne til å diskriminere mellom potensielt lovende terapeutiske mål / agenter, og de som kan være mindre effektive. Vi utviklet en protokoll for å evaluere nye anti-kreft tilnærminger som løser mange av svakhetene ved tradisjonelle metoder.
En særlig viktig funksjon i den beskrevne protokollen er muligheten til å måle cellulære responser i sanntid, og for å spore endringer i stoffskiftet og etterlevelse minutt for minutt. Dette gir mulighet for identifisering av peak narkotika effekter, optimal dosering og en mer detaljert forståelse av samspillet mellom komponentene av narkotika kombinasjonsbehandling. Samtidig gir det innsikt i discrete metabolske endringer i kreftceller, som er informasjon som ikke er levert av celletelling, apoptose, eller fargestoff-konverterings analyser. En begrensning av denne analysen er den manglende evne til nøyaktig å bestemme typen av celledød som oppstår under behandling. Endringer i levedyktighet vil bli reflektert av endringer i tilslutning til biosensor chip, men dette gir ikke informasjon om den måten av celledød. Det er også mulig å bruke fluorescens-mikroskopi og lever celleavbildningsteknikker for å fastsette lignende metabolske data, og dette kan brukes i tillegg til de forsøk som er beskrevet i denne protokollen 20,21.
Videre vil bruk av kylling embryo CAM-modellen studere metastatisk frekvens etter behandling er en effektiv måte til å bestemme hvorvidt et nytt mål, legemiddel eller legemiddelkombinasjon reduserer hyppigheten av kreftceller som ekstravasere og / eller invaderer omgivende vev. Dette er en spesielt relevant spørsmål fra en cliniske synspunkt, fordi metastatisk sykdom fører til en høy andel av dødelighet blant kreftpasienter. En potensiell begrensende faktor er at selve behandling ikke skjer i CAM. I stedet oppstår det ex vivo, og de forhåndsbehandlede celler blir deretter injisert i CAM. Derfor betyr denne analysen ikke gi informasjon om narkotika opptak eller distribusjon in vivo. I tillegg har de intravenøse CAM injeksjoner er teknisk utfordrende og krever betydelig praksis / erfaring.
Vi brukte denne protokollen for å evaluere evnen til en BRCA2-målretting ASO for å sensibilisere tumorceller for DNA-ødeleggende medikament cisplatin. Resultatene av våre eksperimenter identifisert BRCA2 som et lovende mål for terapeutisk angrep, og også gitt begrunnelsen for ytterligere pre-klinisk utvikling av BRCA2 ASO som kandidat narkotika. Vi ser for denne protokollen blir brukt for å identifisere nye mål for kombinasjonsbehandling, spesielt i den voksende feltet DNEn reparasjon hemming. Vi føler denne protokollen vil bli best brukt i tillegg til de mer vanlige teknikker i kreft biologi, i et forsøk på å strengere vurdere nye anti-kreft tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble gjort mulig med tilskudd til JK fra Ontario Centres of Excellence og Ontario forskningsfond.
Vi vil gjerne takke Siddika Pardhan og Dr. Peter Ferguson for teknisk assistanse under filming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
