Abstract
腸のリンパ系は、流体輸送、脂質吸収および免疫機能において重要な役割を果たしている。リンパは上腸間膜リンパ管に収束リンパ管と一連のノードを経由して小腸から直接流れます。腸間膜リンパ管のカニュレーションは、このように腸から流れる腸間膜リンパの収集を可能にします。腸間膜リンパは、免疫細胞(99%リンパ球)、水性画分(流体、例えばサイトカインおよび消化管ホルモンなどのペプチドおよびタンパク質)およびリポタンパク質画分(脂質、親油性分子とアポ蛋白質)の細胞画分で構成されています。腸間膜リンパ管カニュレーションモデルは、従って、リンパ系を介して濃度および腸からの因子の範囲の輸送速度を測定するために使用することができる。別の課題に応じて、これらの要因への変更( 例えば、ダイエット、抗原、薬物)と疾病( 例えば、炎症性腸疾患、HIVは、糖尿病)は、Bもできるeが決定。関心の拡大領域は、腸脂質吸収経路に関連付ける経口投与した親油性薬物およびプロドラッグの吸収のリンパ輸送の役割である。ここでは、詳細には、腸内送達後数時間リンパ系を介して脂質および薬物輸送の速度および程度を評価することができる腸間膜リンパ管カニューレ挿入ラットモデルを記述する。この方法は、リンパ内の他のパラメータの測定に容易に適合可能である。我々は、実験の成功を確認し、得られたデータを解釈する方法に関する指示を提供するために、この複雑な外科的方法を確立する際に遭遇することが困難の詳細な説明、ならびに失敗と成功した実験からの代表的なデータを提供する。
Introduction
リンパは各小腸絨毛1内に含まれているシングルlactealsから発信一方向のプロセスを経て小腸から流れ。 Lactealsこうして流体、巨大分子、細胞およびリンパ形成に比較的透過性であるlactealsにこれらの要因のエントリで始まる。 lactealsの初期のリンパはその後、(求心性)のリンパ管、腸間膜リンパ節、最終的にはポスト結節(遠心性)リンパ管のシリーズを集め、リンパ微小血管のネットワークを経由して腸から流入する。ノード内では、リンパ液は交換は、血液からノードに入るノード常駐免疫細胞だけでなく、材料に発生する髄洞の一連を通過する。小腸から流れるすべてのリンパ節は、最終的には遠心性上腸間膜リンパ管、その後槽のchyliに収束する。槽のchyliもINTEST、尾末梢組織に所属リンパを収集ノミナル、肝及び腰椎地域や縦隔と体の頭蓋部分からリンパ液と一緒に胸部リンパ管を結合します。胸部リンパ管は左内頸静と鎖骨下静脈の接合部で静脈系に直接リンパ液を空にします。ここに記載されているプロトコル、上腸間膜リンパ管から直接リンパの収集を可能にし、したがって、腸のリンパ系を介して全身(一般的な)循環への腸から直接遷移する様々な要因の分析を容易にします。
腸のリンパ系に割り当てる主な生理学的機能は、体液平衡を維持するために、脂質と、親油性分子の吸収を促進するために、1適切な免疫応答を可能にするためである。腫瘍細胞およびウイルスも2-4とキーの変更は、いくつかの炎症性および代謝病態5-7にリンパ管内で発生する腸リンパ管を経由して伝播する。缶腸間膜リンパ節内を収集する腸間膜リンパ管のnulation腸リンパ管を介してバルク流体の流れの解析ならびに様々な細胞および分子の濃度および輸送速度の定量化を可能にする。様々な課題( 例えば、食事、抗原、薬物)に応答して、疾患のモデルにおけるこれらの因子の濃度または輸送に変化( 例えば、大腸炎、HIV、糖尿病)も評価することができる。それは広範囲に分析し、ここで比較することができる各リンパコンポーネントを記述することは不可能であるが、腸間膜リンパは単純化して、水性、脂質と細胞のフェーズで構成。水相中の目的の構成要素は、抗原または寛容原8などのサイトカインおよび肥満細胞メディエーター9、及びそのようなインクレチン10のような代謝性メディエーターの免疫メッセンジャーとしてのペプチドおよびタンパク質を含む。ポスト結節腸間膜リンパ節の細胞画分は、ほぼ完全に(99%以上)lymphocytの構成されていES 11。さまざまな免疫細胞(樹状細胞、肥満細胞など ) は事前に結節腸間膜リンパ管に入りますが、ノード12内に残る。求心性リンパ節内の細胞に関心がある場合には、腸間膜リンパ節の除去を介してこれらの細胞を収集することが可能である腸間膜リンパ管12のカニューレ挿入の前に数日間ノード。このようにして、求心性および遠心性のリンパ管に直接接続され、輸入リンパリンパ細胞は、腸間膜リンパ管に直接渡す。腸リンパ管を通過する種々の免疫細胞の輸送および表現は、このように調べることができる。おそらく、これまでの腸間膜リンパを収集するために引用した最も一般的な理由は、しかし、食事性脂質および親油性分子10の腸の処理、吸収と輸送を研究することである。
摂取後、食事性脂質は、例えば、トリグリセリドからの脂肪酸とモノグリセリド、phospに(消化され脂肪酸およびリゾリン脂質、脂肪酸およびコレステロールなど )へのコレステロールエステルのholipid胆汁からの両親媒性物質の添加によって小さなミセルおよび小胞構造に腸管腔の内部に分散(リン脂質、コレステロールおよび胆汁塩)との作用膵酵素10,13。ここから彼らは腸細胞に吸収される。吸収された成分の割合は、吸収細胞(腸細胞)内のトリグリセリド、リン脂質及びコレステロールエステルを形成するために再エステル化されている。これらの再エステル化された脂質は、外因的に脂質成分および胆汁分泌、粘膜脂質プールまたは腸の血液供給13からの内因性脂質成分の摂取の組み合わせから組み立てられる。ここからエステル化脂質はどちら腸細胞内に格納されているか、一緒に様々なアポや他の親油性分子と腸のリポタンパク質(カイロミクロン、超低密度リポタンパク質(VLDL))(に組み立てる)10,13。腸のlactealsは腸の毛細血管よりも彼らのエントリに対してより透過性であるように、腸細胞を出た後、リポタンパク質は、特に腸間膜リンパ系を介して全身循環への腸から輸送される。吸収された脂質成分の割合はまた、関連した単一の非リポ蛋白質のような毛細血管および門脈を経由して全身循環への腸から運ば14を分子ている。しかしながら、一般的に、門脈搬送経路は短く、中鎖長の脂質の吸収の唯一の重要なプレーヤーである。
腸間膜リンパの集合は、このように腸からのリポタンパク質および関連コンポーネント(脂質、親油性分子、アポ蛋白質)の輸送の評価を可能にします。リポタンパク質は、腸間膜リンパリポタンパク質は、一般に、nascenであるという利点を用いて定量し、特徴付けることができるT状態彼らは広くそのようなリポタンパク質リパーゼ15などの全身の酵素によって変更されていないため。腸間膜リンパカニューレ挿入ラットモデルは、おそらく歴史的に最も広範に腸からの脂質/リポタンパク質輸送を分析するために記載されている一方で、関心の拡大領域は、親油性薬物、プロドラッグ及び他の生体異物13,16の輸送におけるリンパ管の役割であるそのここで説明したモデルの焦点である。 17,18(例外は明らかであるが、長鎖トリグリセリドのlog P> 5と溶解度が、一般的にそれらの> 50ミリグラム/ g)を、プロドラッグ19および他の生体異物13,16は、腸リンパ管のどちらか受動的かによるへのアクセスを親油性薬物を得ることができます積極的に腸のリポタンパク質輸送経路19への統合。
ラット腸間膜リンパカニューレ挿入技術は、このように多くの用途を有する。ボールマンらは、まずtechniqを説明したモデルのバリエーションその後数が記載されているので、UEは、1948年20ラットにおける腸間膜リンパ管にカニューレを挿入する。 15を拘束したり、自由に23,24を移動しながら、ラットを様々な麻酔薬21,22、または意識的な状態で麻酔されている場合たとえば、コレクションが発生する可能性があります。 ( - 5ミリリットル/時間、典型的には0)25ラットは異なる再水和溶液と、胃、腸、又は非経口的に異なる速度で脂質および薬物製剤のような他の物質を投与することができる。いくつかの研究において、胸管ではなく、胸管は、他のリンパ節を受信すると、これは、関心の要因に応じて、小腸の通過を過大評価してもよいが、腸間膜リンパ管は、リンパ管を経由して腸からの輸送を推定するためにカニューレを挿入する地域22,26。リンパカニュレーションモデルはまた、ミニパイ、マウス15,27を含むいくつかの他の種に記載されているGS 12、羊28,29、豚30と犬31。しかし、ラットモデルは、最も広くかつ一貫して引用されている。意識25内リンパの収集に続いて、または22ラットおよびマウス15,27を麻酔腸間膜リンパ管のカニューレ挿入のための詳細なプロトコールは、以前に公開されており、興味のある読者は、これらのプロトコルを対象とする。このプロトコルは、可視化された形式で技術を実証する最初のです。
リンパカニューレラットモデルは、費用の点で大きな動物モデル、外科的および倫理的考慮事項を容易に勝る利点を有する。マウスモデルと比較すると、マウスモデルは、トランスジェニック動物27でより詳細な研究が可能になりますが、腸間膜リンパカニュレーション手術はまた、ラットで簡単です。それにもかかわらず、ラットモデル、生理学の違いに関連した特に、そのリミットextrapolatのいくつかの制限があります他の前臨床および臨床状況にイオン。高い種食品又は脂質、胆汁の流れ32を刺激するのに対し、例えば、ラット胆汁流量が一定と食物摂取と無関係である。これは、より大きな種とヒトに見られるものを反映ラットにおける代表前と食後の環境を得るための課題を作成します。現実的な人間の剤形25の投与後のリンパ輸送を評価する場合、薬物送達研究のために、より大きな種が好ましい場合がある。最近の研究では、腸間膜リンパ節中の脂質輸送速度は、種27を横切っ脂質輸送データを外挿することで、いくつかの信頼性を提供する等価質量と脂質のタイプの投与後の種(マウス、ラット、イヌ)全体で同等であることが見出された。しかし、動物の大きさ( すなわち、犬>ラット>マウス)の順にランク付けモデル親油性薬物、ハロファントリンの輸送、。スケーリング係数は、このように元に必要とされ得る他の種にラットからのリンパ薬物輸送データをtrapolate。
リンパカニュレーションモデルの制限は、一般に、リンパ管は容器33にカニューレを挿入されると、変更された圧力勾配に対して作用するので、直接リンパ管から受動リンパコレクションはリンパ流および輸送を変更することができるということである。リンパカニュレーションモデルは、技術に精通していない研究室で確立することは困難である。代替モデルは、このように記載されている。例えば、このようなリポタンパク質および親油性分子腸リンパ系を介した因子の輸送は、間接的に採血を介して研究されている。一つのこのようなモデルは、リンパ輸送ブロック34腸リポタンパク質の産生の(シクロヘキシミドを、例えば、コルヒチン、プルロニックL81)を阻害剤の存在下および非存在下での経口投与後の脂質および/ または薬物の血中濃度を比較することを含む。利点血液サンプルの収集を介して間接的にリンパ輸送を定量化モデルの侵襲的手術が35を必要としないように、それは、ヒトにおけるリンパ輸送のいくつかの評価を可能にすることである。しかし、リンパ輸送の阻害剤は特異的ではないとリンパ管を介して輸送される要因は、そのような評価を複雑にし、全身循環中に希釈し、修飾されている。 インビトロ代替物も記載されている。例えば、Caco-2細胞または単離された腸細胞培養物は、より詳細にリンパ36-38に入る分子の腸分泌を研究するために利用されてきた。ヒト腸微小環境のより代表的である高度なin vitroモデルも最近39を説明した。このモデルにおいて、リンパ内皮細胞層は、リンパ管への腸からの物質の移動のより詳細な分析を可能にするのCaco-2細胞と共培養する。しかし、vitrでOセルシステムは、交換の流れを欠き、腸管腔、基礎となる血液とリンパ血管供給にすなわち相互接続を転送します。別のアプローチでは、Kassis ら血管収縮、リンパ流および腸間膜リンパ管33内の蛍光脂質濃度との定量比較を可能にする、その場イメージングシステムにおけるデュアルチャネル(高速明視野ビデオおよび蛍光)を確立した。 インビトロ系における上記に対するこのモデルの利点は、リンパ管を介して免疫細胞の継代の正確な追跡を可能にすることである。質量脂質(または薬物)の絶対測定輸送は、しかしながら、まだイメージング法を使用して確立されていない。 インビトロおよびインシリコ腸リンパ管も40-42公開されているを介して特異的に親油性の薬物輸送の程度を予測することに近づく。いくつかのcは、例えば、ex vivoでの親和性プラズマキロミクロンのためのompoundsは、生体内 41 でのリンパ輸送と合理的に相関することが見出された。その後、同グループは、複数の物理化学的性質40に基づいて、カイロミクロンのための薬物親和性を予測するためにシリコモデルに設立さ。ホルムらもあからさまな分子記述42に基づいて親油性化合物のリンパ輸送を予測するために、 インシリコモデルで比較的複雑なを設立しました。これらのモデルは、未知の薬物のリンパ輸送の程度を予測するための有用なアプローチを提供してもよい。薬物の広い範囲で、別の研究室全体でのモデルの妥当性は、しかし、それらの精度と再現性を確認するために必要とされる。
腸間膜リンパ管のカニューレ挿入は、このように直接小腸および因子(細胞、タンパク質の複雑な配列の走行速度を排出リンパのコンテンツを検査する唯一の手段で残るin vivoの状況でリンパ中のペプチド、脂質、薬物)。 】ここで我々を麻酔ラットから腸間膜リンパおよび全身の血液の収集を可能にする腸間膜リンパ管と頸動脈のカニューレ挿入するためのプロトコルについて説明します。代表的なデータは、モデルが腸間膜リンパ系を介して腸からの脂質および薬物輸送を調べるために使用することができる方法を示します。これは、モデルとトラブルシューティングガイドを確立する際に遭遇することができ困難の議論が続いている。確立された後は、モデルは、腸リンパ輸送を調査するための強力なツールです。
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Protocol
この原稿に記載された研究は、地元の動物倫理委員会によって承認されたと研究教育ガイドラインにおける動物の管理のためにオーストラリアとニュージーランド評議に従って行った。任意の動物手順を開始する前に、適切な許可がローカルの機関/団体を介して取得されていることを確認する。すべての動物の手術と同様に、手術は無菌条件下で、倫理的かつ成功した結果を確実にするために必要な場合に麻酔薬、鎮痛剤と抗生物質が投与されていることを、適切な訓練を受けた事業者によって行われていることを確認します。
1.準備の日の外科的処置の前に
- 必要に応じて、手術前の夜ラットを高速です。ラットが水に自由にアクセスを持っていることを確認します。
- 準備ソリューションは、ラットに投与される。
- 例えば、滅菌生理食塩水またはリンゲル液などの再水和溶液を準備します。
- 準備する必要に応じて審美的なソリューションを提供しています。ここに記載の実験で使用し、麻酔は「ケタミン100mg / mlの、キシラジン100 mg / mlの、アセプロマジン10 mg / mlの生理食塩水2.5mlを0.2mlの0.5mlを1.9mlのを組み合わせることによって調製 "カクテル1」からなり、そしてケタミン1mlの100mg / mlの0.1mlをアセプロマジン10mg / mlのからなるカクテル2 "。注:これは長時間の麻酔の外科的平面を提供することができるように吸入イソフルランまたはセボフルランが好ましい場合がある。
- 必要に応じて、例えば、脂肪乳剤の中に薬物を含有する製剤を調製する。貯蔵及び投与期間にわたって、製剤の安定性を確保するために適切な安定性研究を行う。
注:リンパ薬物輸送研究の目的は、処方の関数としてのリンパ薬物輸送の効率及び薬物adminiを評価するために最も頻繁にあるように投与される製剤および薬剤の正確な性質は、それぞれの研究に応じて変化するstered。- 先に説明したように43、ここで、図4及び5の代表的実験に利用製剤は、調製される。簡単に言えば、リン酸緩衝生理食塩水(pH 6.9)中の5mMタウロコール酸ナトリウムからなる水相5.6mlの分散の前に14 Cオレイン酸(2-5μCiの)及び40mgのオレイン酸へハロファントリン(200μgの)を組み込む。
- 2-モノオレインを含有する配合物については、オレイン酸相を含むハロファントリンと同時に水相に、他のコンポーネントと一緒に2-モノオレインの7.1 mgの追加。 2-モノオレインは比較的不安定であり、1-オレインにに異性化としてラットに投与する前に、すぐに2-モノオレインを含有する製剤を準備します。
- その後、室温で2分間超音波処理することによって製剤を乳化する。
注:EMULの第iによって製剤の安定性を監視する、43先に説明したように)視覚的検査調製直後、エマルションが相分離されていないことii)の粒子サイズ分析を確保するために、偏光下でシオンとの位相の変化および/または分離の指標を提供するために、動的光散乱を使用して投与後、及びiii)ハロファントリン濃度の分析を用いて検証済みHPLCアッセイ。
- 滅菌水またはリンパカニューレをフラッシュする生理食塩水で10 IU / mlのヘパリン10mg / mlのEDTAを含有する抗凝固剤溶液を調製する。頸動脈カニューレをフラッシュする生理食塩水に10 IU / mlのヘパリン - また2.5を含有する抗凝固剤溶液を調製。
- 腸間膜リンパ管(0.8mmのOD、内径0.5 mm)に挿入するためのポリエチレンカニューレを準備し、頸動脈(0.96ミリメートルの外径0.58 mmのIDまたは0.8mmのOD、内径0.5 mm)および十二指腸(0.96ミリメートルの外径0.58 mmのID )
- リンパキャンのために15センチメートル - 頸動脈および十二指腸カニューレのための30センチと10 - 必要な長さ(典型的には25にカニューレをカットULA)と( 図1参照)を滅菌外科刃を用いてカニューレの先端に斜面を置く。
注:これは、カニューレ挿入のしやすさを向上させ、カニューレの閉塞挿入後の発生率を低減します。 - ( 図1参照)、バック自体のカニューレの一部をループライターまたはホットプレートで加熱した後、大きさに切断して十二指腸カニューレ内にJ形状のアンカーポイントを置く。
- リンパキャンのために15センチメートル - 頸動脈および十二指腸カニューレのための30センチと10 - 必要な長さ(典型的には25にカニューレをカットULA)と( 図1参照)を滅菌外科刃を用いてカニューレの先端に斜面を置く。
- (ステップ1.3で調製)抗凝固剤溶液を含有する25 G針と注射器にリンパカニューレを取り付けます。抗凝固剤溶液とリンパカニューレを充填し、カニューレO中の溶液を残す/ Nは、リンパ収集中にリンパカニューレにおける血栓形成の発生率を減少させる。
- リンパと血液サンプル採取のためのチューブを準備します。リンパおよび血液サンプル採取のためにリンパ回収チューブ、ラベルチューブを予備秤量し、抗凝固剤溶液を加える。十分な抗凝固solutを追加収集リンパまたは血液中の20 IU / mlのヘパリン - イオン滅菌水で1 mg / mlのEDTAの最終濃度、または10を達成する。
手術手順を開始する直前に2.準備
- 彼らは特許であることを確実にするために滅菌生理食塩水または抗凝固剤溶液でフラッシュすることにより、すべてのカニューレを確認してください。
- 外科的処置のためにラットを準備します。
注:腸間膜リンパ管が食べているか、腸間膜リンパが乳白色と高い脂質負荷と不透明になるように油の用量を投与されたラットでより見やすくなります。例えばオリーブ油または大豆油のような0.5 - (1mlの0.1前後) - いくつかの事業者、手術への新しい特に、したがって、ラットを油で事前に投与する際にそれが簡単に腸間膜リンパ管にカニューレを挿入するために見つける2時間前に手術を開始する。しかし、投与前の油は、投与前の油に理想的ではないかもしれないような、リンパ内脂質、親油性薬物および他の因子のリンパ輸送に影響を与える実験の目的に応じて。- 手術とサンプル収集期間中のラットを麻酔。
- 例えば、カクテルの1.5ミリリットル/ kgを皮下注射を介して麻酔を開始I 25 G針に付着し1ミリリットル注射器を用いてラットの首の後ろの皮膚のひだに(ステップ1.2.2から)。 (ステップ1.2.2から)カクテル2の0.44ミリリットル/ kgの25のG針に取り付け1mlシリンジを使用して、必要に応じて約時間ごとの腹腔内注射により麻酔を維持。
- 手術は麻酔の深さは呼吸数、ウィスカの動き、筋肉の緊張や、足のピンチなどの刺激に対する反応を観察することによって十分であることを確認開始する前。必要に応じて追加の麻酔を管理します。
- 頸動脈カニューレのためのリンパ液や十二指腸カニューレ挿入のために腹部の右側を含む外科的地域、および首と左鎖骨領域から毛皮を剃るる。
- povidine - ヨウ素溶液またはクロルヘキシジン溶液と70%エタノールのスクラブを使用して無菌的外科領域を清掃してください。 70%エタノールで最終クレンジングで仕上げ、各地域のために、この3回繰り返します。
- 手術とサンプル収集期間中のラットを麻酔。
- 加熱された外科パッド(37℃)以上のクリーンシートに背側横臥で動物を置きます。
腸間膜リンパ管の3カニューレ挿入
- オペレータに向いたその右側で動物を置きます。必要に応じて、手術用顕微鏡の支援の有無にかかわらず手術を行う。
- ストレート4cmの切開は約2cm胸郭(肋骨マージン)下の右脇腹に正中線(剣状突起)から延びる滅菌メスの刃を使用して腹部の筋肉壁の最上層を開きます( 図2Bを参照)。
- 小さなペアで右脇腹に正中線に横4〜5ミリメートル腹筋壁の残りの層を開く外科用ハサミの( 図2Bを参照)。
- 左腹部の筋肉壁の下で小腸を撤回し、2を使用して場所に保管してください - 生理食塩水で飽和した滅菌ガーゼの3枚を。
- 腸間膜リンパ管の可視化を容易にするために、右の腎臓のレベルでのラットの背中の下に水平に置いた10ミリリットルプラスチック製の注射器の上にラットを埋める。
- - (; 図2Cを参照してください脈動暗赤色の血管)腸間膜動脈に右腎に垂直とすぐに吻側と平行であり、直径1mmの容器約0.5:上腸間膜リンパ管の位置を確認します。
注:非絶食または油事前に投与されたラットでは、容器は、白色不透明、それは非常に半透明である絶食したラットに比べて視覚化する方が簡単です。 - 第二、より小さなアクセサリーリンパ管があるかどうかを判断するために大規模な上腸間膜リンパ管および腸間膜動脈のすぐ尾側面積を点検存在。存在する場合、腸から流れるリンパ液の全体積は、腸間膜リンパ管から収集されることを保証するために、管を切断し、瞬間接着剤で閉塞、または管の周りに縫合糸を結ぶことにより、ダクトを介してリンパの流れを遮断する。
- 上腸間膜リンパ管と平行な方向に、右腎の下縁で、及び結合組織層を通ってすぐに大静脈の下ペリ腎脂肪床をストレートピンセットを渡します。
- 鉗子の先端を使用して、リンパカニューレの保持を取り、腸間膜リンパ管に直接隣接する一端ペリ腎脂肪床を介して引き出し、他方は右腎のレベルで動物から体外に出し。
- 鈍的切開によって結合し、脂肪組織の層の上にあるから腸間膜リンパ管を分離します。刺しまたはリンパ管を損傷しないように注意してください。
- リンパ管を単離した後、小さな鎬を作るマイクロはさみ、宝石商の鉗子の鋭い先端または25 G針のいずれかとリンパ管のル。完全に血管を切断しないように注意してください。
- リンパカニューレが完全に無エアギャップを持つ抗凝固剤溶液(注射器を使用し、25 G針)で満たされていることを確認します。鉗子の小さなペアの助けを借りて小さな穴を経由して腸間膜リンパ管の内側4ミリメートル - リンパカニューレ約2を挿入します。
- 数分のカップルのためのリンパカニューレを観察します。カニュレーションが成功した場合、カニューレの自由収集端から腸管リンパ液の緩やかな流れを観察します。 3.12 - カニュレーションが成功しない場合、繰り返しは3.8を繰り返します。
- カニュレーションが成功した場合、リンパ管への入口穴の上獣医接着剤の小滴を配置することによってカニューレを固定する。過剰獣医接着剤のアプリケーションを介して血管を閉塞しないように注意してください。
- 設定するには、獣医接着剤を待っている間、obserカニューレ挿入手順が成功したことを確実にするために、数分間、リンパの流れをVEの。カニューレ挿入の成功を特定したら、慎重に腹腔内に配置されたガーゼ片を除去し、元の位置で小腸を置く。
- 抗凝固剤を含むリンパコレクションチューブを配置し、自由流動性リンパ節を収集するためにカニューレの終わりに(ステップ1.6参照)。
- 次に、再水和溶液および/または製剤の注入のための十二指腸にカニューレを挿入。
十二指腸4.カニューレ挿入
- 再水和溶液で満たされた注射器( 例えば、10ミリリットル)に十二指腸カニューレを取り付けます。
- 引っ張っ穏やか下向きの時に胃を明らかに小腸の部分、(多くの血管を持つ)明るいピンクなどの十二指腸を特定します。
- 約2cm胃と十二指腸(幽門)を使用しての接合部の下に十二指腸に小さな穿刺孔を作る無菌の23 G針。
- 穿刺孔を通して十二指腸カニューレのJ字型フックの端を挿入します。シアノアクリレート接着剤1滴の所定の位置に固定します。
- 輸液ポンプに装填された再水和シリンジにカニューレを装着することにより、ラットの水和を開始する。文献によると、再水和率の範囲は0.5〜3ミリリットル/時15,25。
- リンパ液および十二指腸カニューレ挿入が完了した後、縫合糸で腹部の筋肉壁に切開を閉じます。その後、切開部の側面に沿って組織接着剤(シアノアクリレート)の数滴を適用し、一緒に切開の両側の皮膚をつまんで皮膚切開を閉じる。
頚動脈の5カニューレ挿入
頸動脈のカニューレ挿入は、腸間膜リンパ管のカニューレ挿入の前または後に行ってもよい。いくつかの事業者は、前のpoを低減するようにリンパ管にカニューレを挿入し、頸動脈にカニューレを挿入することを好む動物を移動するときtentiallyリンパカニューレを追い出し。
- 動脈に挿入するチューブの部分を識別するために、ベベル先端から2.5センチメートル頸動脈カニューレにマークを置きます。抗凝固剤溶液で満たされた注射器に取り付け23または25 G針に(ベベルなしすなわち、)カニューレのもう一方の端を接続し、抗凝固ソリューションにはエアギャップが存在しないことを確認することでカニューレを埋める。
- 挿管を容易にするために、オペレータの方を向い伸ばし首と頭を背側横臥で麻酔したラットを置く。いくつかの事業者は、ラットの尾がオペレータ側に向けて、この手法を実行することを好むことに注意してください。
- 矢状面における気管の左上の皮膚層を介して1.5センチメートル縦切開 - 1を配置します。
- 基盤となるペア首の筋肉を露出させるために鈍い先端鉗子を用いて皮下結合組織を解剖。
- 首の筋肉tを引っ込めでo(〜1センチメートル皮膚表面とパルスの下にある)左頸動脈を明らかにする。鈍的切開による動脈から上を覆う結合組織を清掃してください。
- 隣接する迷走神経トラックを損傷しないように注意しながら、慎重に鈍い組織鉗子を用いて、動脈の〜1cmの部分を分離します。周囲の組織と迷走神経からそれを解放するために、動脈のいずれかの側に沿って垂直に鈍い先端鉗子を開閉することでこれを実行します。
- 先端の細い鉗子を使用して、頸動脈の下に2絹縫合糸を通し、孤立した動脈部分の両端に配置します。ラットの心臓と鎖骨( 図3A)からオペレータと遠いに最も近い縫合糸をオフに接続します。
- 動脈( 図3B)の下ストレート先端の細いピンセットを配置することによって、動脈を通る血流を閉塞する。
- 微細な先端虹彩はさみを使用して、動脈(約1/3の上面に小切開を置く道ダウン孤立領域の上部から)。ヘパリン化生理食塩水で動脈の表面上の任意のこぼれた血液をフラッシュし、静かに綿のヒントを使用して拭いてください。
- 湾曲した先端鉗子一対の動脈にカニューレの先端を挿入します。一旦挿入されると、血流を閉塞ストレート先端の細い鉗子を除去し、カニューレを挿入するために、前後の他漏れる血液を停止するために、動脈の内側カニューレを保持するために鉗子2対のいずれかを使用して動脈にカニューレ2.5センチ進める。
- 動脈の内側カニューレを保持し、血流を閉塞するためにステップ5.8で動脈の下に置かれたストレート細い先端鉗子を除去するための小動脈クランプを使用してください。
- カニューレ内に抗凝固剤溶液を注入し、少量の血液( 図3C)をバック描画することにより、カニューレの開通性を確認してください。その後、抗凝固剤溶液でカニューレをフラッシュし、ライターの炎またはカニューレプラグを使用してエンドをシール。
- タイ番目ステップ5.8で動脈下に置かれた2本の縫合糸のある場所での電子カニューレ。
- 動脈クランプを外し、動脈とカニューレの周りに第三の縫合糸を固定します。縫合糸で巻かれ、首を閉じます。
6.ポスト外科期間および製剤輸液
- 麻酔下で加熱したパッドの上にラットを維持し続ける。
- カニューレ挿入が完了した後、少なくとも0.5時間十二指腸内再水和溶液の注入により、ラットを再水和する。挿管後の初期期間の間 - (0.5ミリリットル/時間〜0.1)とすぐに安定したベースラインに増加リンパ流量の減少を観察する(0.4 - 再水和速度に応じて、2.5ミリリットル/時間)。
- 回復期間の後、カニューレを介して十二指腸に(脂質、薬物等を含む)、目的の製剤を注入する。場合によっては、製剤の流量を調節するために注入ポンプを使用する。注:プロトコルではここに記載された動物はanaes残る手術およびリンパ収集期間を通してthetisedおよび追加鎮痛を必要としないように、麻酔下で安楽死させる。プロトコルが変更され、動物は意識を取り戻すために有効になっている場合は、適切な鎮痛と術後のケアが必要となります。
- 製剤注入の完了時に、脱水を防ぐために、十二指腸内に生理食塩水で1.5〜3ミリリットル/時の速度でラットを再水和し続ける。
- ステップ2.2に従って(必要に応じて下腹部に優しい下向きのプッシュを経由して膀胱から、(ステップ2.3による)の温度を維持するために、37℃に加熱外科パッドの上に急行尿をラットを維持し続け、眼軟膏1時間ごとを再適用します。 3)。動物は手順の後に意識を取り戻すのであれば正規の身体位置の変更が推奨されている。
7.脂質を評価するためにリンパと血液サンプルの収集と薬物吸収
- に連続的にリンパ液を収集抗凝固剤を含む管。必要な時間間隔で変更管( 例えば、毎時)。
- 設定された時点で血液サンプルを収集する。
- 密封端からフィードバックさ約2cmのカニューレを曲げることによって、カニューレを通る血流を閉塞する。密封された端部を切断またはカニューレプラグを除去することにより、カニューレを開封。
- 血液が全体カニューレを満たすまで、空の注射器を使用して、カニューレからヘパリン生理食塩水を撤回。
- 新しい空のシリンジを使用して、抗凝固剤を含むチューブに血液や場所の所望の体積を引き出す。
- 第1のシリンジを使用して、不必要な血液の損失を減らすために、サンプリングの前に採取された血液を交換してください。それは直立保持した状態で注入する前に、気泡がカニューレを入力しないことを確認するために注射器をフリック。
- 注射器を用いて、抗凝固剤溶液を用いてラットから取り出し、血液の量を交換してください。残留血液が残っている月血栓などのカニューレ内に表示されていないことを確認してくださいとカニューレをブロックします。
- 曲げはカニューレシールされていない端から約2cmの血流を遮断し、シリンジを除去した。ライターの炎またはカニューレプラグを使用して、カニューレを再シール。
- ラットからの血液やリンパ収集の完了時に、> 100mg / kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与によってラットを安楽死させる。
- 各期間中に収集されたリンパ節の質量を測定することにより、リンパ流量を決定する。
- 脂質および薬物の吸収効率を評価するために、例えば、HPLC、HPLC-MSまたは市販のキットを使用するための、リンパ、血液を使用して、薬物および脂質の濃度を測定する。
- 収集された測定された濃度とリンパ液の体積の積からリンパ液中の薬物と脂質の大量輸送を計算します。
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Representative Results
腸間膜リンパカニュレーションモデルを使用して、腸送達の後リンパ系を介して脂質および薬物輸送の累積範囲および速度を定量するための代表的な実験の結果を図4および図5に示す。この実験では、モデルの親油性200μgのとリン酸緩衝5 mMのタウロコール酸ナトリウムの5.6ミリリットル中に分散7.1 mgの2-モノオレイン-薬物ハロファントリンは、40mgの(5μCiの14 C-オレイン酸2を含む)のオレイン酸を含有する製剤中に2時間かけてラットの十二指腸内に投与した生理食塩水のpHは6.9。製剤投与後のラットは、2.8ミリリットル/十二指腸内に注入生理食塩水と時間の速度で再水和した。リンパは10時間毎時間を変更したチューブ内に連続して採取した。すべて同じCOMPONを含有する製剤について前述したプロトコルに従って、配合物を調製し、実験を行っそれを除くエントは2-モノオレイン43を含んでいませんでした。
1.3ミリリットル/時- 図4に示すように、これらの実験条件下で正常にカニューレを挿入したラットの平均リンパ流量は0.4であった。挿管後3時間、次いで増加 - いくつかのラットではリンパ流量は、第1のわずかに低かった。これは、一般的に、リンパ挿管後に見ている。また、失敗した実験のリンパ流量は、図4に示されている。この場合、流量は、収集期間中に成功した実験で見られたものよりも実質的に低いままであった。同様に、トリグリセリドおよびハロファントリンの累積リンパ輸送が不成功実験( 図5AおよびB)が実質的に低かった。成功した群では平均累積ハロファントリン輸送は投与量の15.1%だった、累積トリグリセリド輸送は61 10時間以上のmgの投与Rの割合だったリンパ液で輸送adiolabelled外因性脂質用量は、54%( 図5C)であった。これらの値は、2-モノオレイン43( 表1)が存在しないこと以外は同じ成分を含有類似の製剤のために以前に見られたものと有意に異ならない。これは、モノグリセリドの源の非存在下で脂肪酸を含有する製剤は、モノグリセリドを含有して行うものにリンパに類似した脂質及び薬物輸送をサポートできることを示唆している。この結果は、議論の項でさらに説明する。
図5Dは、投与後の時間をかけてリンパ液中にハロファントリン及びトリグリセリド輸送の速度のための代表的なデータを示しています。リンパ液への両方のトリグリセリドと薬物の輸送速度は、脂質と薬物投与後の数時間をピークした後、ベースラインレベルに戻ります。薬物ボートを輸送率腸リンパ脂質および薬物輸送実験において典型的であるように薬物としてのトリグリセリド輸送に見各期間ミラーの間リンパにおけるtは、トリグリセリドに富むリポタンパク質に関連してリンパ節に輸送される。
図1頚動脈またはリンパカニューレのベベル先端の形状の図的表現、および十二指腸カニューレのJ字形のベベルチップ。
(A)は図2の写真のリンパ管にカニューレを挿入するための準備として、剃毛腹部は、(B)腹筋壁が真っ直ぐ4cmの切開リンパ管にアクセスするために右脇腹に正中線から延び、および(Cで開か黄色の円内)上腸間膜リンパ管()右腎に垂直。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
(A)は図3写真結紮操作者に最も近い2つの絹縫合糸を用いて単離し、頸動脈、(B)頸動脈を単離し、血流が動脈の下に配置ストレート先端の細いピンセットで閉塞、と(C)所定の位置にカニューレと頸動脈とバック少量の血液を描画することによってチェックされる開存。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg" />
時間をかけて腸間膜リンパ流量(μL/時)図4.代表的なデータを。ラットを200μgのハロファントリンを含有する製剤を投与された、40mgの(2μCiの14 C-オレイン酸を含む)オレイン酸と5.6で7.1 mgの2-モノオレイン2時間 - リン酸5 mMのタウロコール酸ナトリウムの溶液を0から生理食塩液(pH 6.9)で緩衝化。示されたデータは、n = 3成功した実験(黒丸、●)のための平均±SEMであり、n = 1失敗した結果(白三角、Δ)である。
腸間膜リンパ節への脂質および薬物輸送のための図5の代表的なデータを、(A)は、モデル薬物ハロファントリン(Hfで、%用量)の累積輸送、(B)、トリグリセリド(TG、mg)および(C)外因性の脂肪酸(%ドスe)は、2μCiの14を200μgハロファントリンを含有する製剤の投与後の経時的な腸間膜リンパ節への(D)TG量(mg /時間)及びHf(%用量/時間)の輸送速度、40mgのオレイン酸( C-オレイン酸)と0からリン酸緩衝生理食塩水(pH 6.9)、5 mMのタウロコール酸ナトリウム5.6mlの7.1 mgの2 - オレイン - 2時間。示されたデータは、n = 4成功した実験(黒丸、●)のための平均±SEMであり、n = 1失敗した結果(白三角、Δ)である。外因性脂肪酸輸送は不成功の実験で測定されたが、失敗した実験では、一般的に低いされませんでした。失敗した実験のデータは、わかりやすくするためにパネルDから省略されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
なしMonoolein | 2-モノレイン付 | |||
意味する | SEM | 意味する | SEM | |
ハロファントリン(%用量) | 15.1 | 0.8 | 15 | 1.6 |
トリグリセリド(mg)を | 67 | 4 | 61 | 6 |
総脂肪酸(マイクロモル) | 261 | 16 | 248 | 23 |
外因性オレイン酸(マイクロモル) | 82 | 5 | 65 | 6 |
内因性脂肪酸(マイクロモル) | 180 | 17 | 183 | 28 |
40mgのオレイン酸を含有する製剤におけるリンパ管にカニューレを挿入したラット腸間膜する200μgのハロファントリンの投与後10時間の累積リンパ輸送データの表1の比較(containinとし、7.1 mgの2-モノオレイン。データのないリン酸緩衝生理食塩水(pH 6.9)で5 mMのタウロコール酸ナトリウム中で乳化G1μCiの14 C-オレイン酸)は、n = 4匹のラットのための平均±SEMを表す。統計的有意差は2群間に見られない。
これは2-モノオレイン骨格に結合し、オレイン酸などの内因性脂肪酸輸送の正確な尺度ではない2-モノオレインを投与した群ではリンパに測定された外因性のオレイン酸輸送に計上されていません。
B 2-モノオレインずに投与された群ではハロファントリン、総脂肪酸輸送のためのデータは、以前に参照43の図5に出版されたと表形式でここに再現される。
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Discussion
ラット腸間膜リンパカニュレーションモデルは、直接リンパに腸から(例えば脂質および薬物のような)種々の細胞および分子の輸送の濃度及び割合の定量化および種々の物質の投与に応答して発生し、これらの変化(食事を可能に、抗原、薬物、配合物など ) を 10,27および疾患(癌、ウイルス、大腸炎、インスリン抵抗性、 等 )5-7。リンパ収集コンポーネントは、さらに追加の実験において使用され得る。例えば、細胞は、44分画し、リポタンパク質およびリンパまたはそのようなリポタンパク質または細胞のようなその成分は、薬物、放射性標識、蛍光プローブを含むマーカーを装填培養することができる。次いで、これらを、より直接的に、それらの機能、代謝、クリアランスおよび/ または組織の配置パターン45-47を評価するためにレシピエント動物に再注入することができる。ラットリンパカニュレーションモデルはothの上にいくつかの利点を有するえーインビトロ 、 インサイチュで 、 インシリコで 、およびin vivoモデルで導入で説明したよう。最も重要なのは、カニュレーションは、リンパ液中の成分の全体積への直接アクセスを可能にする唯一の方法です。経験豊富なオペレータの手で行われる場合に、モデルは、> 80%の、強固な再現性の実験的な成功率を達成することが可能である。しかし、外科技術は、特に技術に精通していない実験室で、最初に習得することは困難である。
いくつかのステップが腸間膜リンパカニュレーションモデルの成功に不可欠です。最初は、手術器具とカニューレの種類と準備の正しい選択である。私たちの研究室では、寸法が外径0.8×ID 0.5ミリメートルでPEカニューレを使用しています。しかし、他のラボは同じ次元15のPVCカニューレの成功を経験している。カニューレの先端を面取りし、抗凝固剤でそれを予め浸漬することも防ぐことができの閉塞、及び内血栓の形成、カニューレ挿入後(ステップ3.13)。いくつかの事業者が特に重要で見つける外科的処置の最初のステップは、リンパ管(ステップ3.10)上記結合および脂肪組織の層を洗浄するために世話をしている。これは、組織やリンパ管の間ではなく、リンパ管へのカニューレの挿入を回避するのに役立ちます。リンパ管は壊れやすく、損傷に容易であるが、この洗浄工程は、困難である。他の顕微鏡が必要ではないが、いくつか見つけるために、この段階およびカニューレの挿入は、最も成功し、手術用顕微鏡を用いて完成される。管にカニューレを挿入するときに面取り先端に対する挿入方向と深さは、血管壁(ステップ3.12)によって塞がれているカニューレを防止するために、いくつかの考慮を必要とする。各オペレータは、自分の個人の好みを見つける傾向にある。また、重要では、ca内の気泡形成の回避であるnnula挿入の間の空隙は、リンパ液の自由な流れ(ステップ3.12)に圧力をバック適用するように。最後に、所定の位置にカニューレを確保する獣医接着剤の塗布は、ダクトの上に直接置かれ、接着剤としてダクト内に挿入点未満であるべきである血管がカニューレ先端(ステップ3.14)を崩壊し、閉塞することがあります。
手術が成功したかどうかの最も簡単な初期のガイドは、リンパの流量である。カニューレが所定の位置リンパになると、一般的に最初の30分以内にゆっくりと流れ始め、その後増加する。典型的には、ラットにおける成功カニューレ挿入のための流量> 250gを最初の1時間> 0.1ミリリットル/時であり、 図4に示されるように、その後、定常状態で> 0.4ミリリットル/時間に増加する。もちろん、これはによって異なるが。実験条件のトラブルシューティングに関しては、全くリンパカニューレ流れていないか、流量が低い場合、このことができるので。
- カニューレは、ダクト内に正しく挿入されませんでした
- カニューレは、ダクト内であるが、血管壁の側面により閉塞
- カニューレは、ダクト内にあるが、間違った位置に塗布された接着剤により閉塞
- カニューレは、ダクト内で、カニューレ内の気泡は、流れを遅くしている
- 血栓は、カニューレ内に形成されている
入念な検査は通常、基礎となる要因を明らかにする。オペレータはカニューレが最初の場所で正しく配置されていなかったと考えている場合( つまり、リンパ液が流れることはなかった)、その後、再挿入が必要です。カニューレが正しい場所にあるように思われる場合は、チェックするために第1の要因は、気泡または血栓が存在するかどうかである。気泡は、一般に、リンパの流れを一時的に遅い流れとしてカニューレを通過することになる。これは、例えば、に取り付け25 G針を使用してカニューレに戻って描画することで1mlシリンジに気泡や血栓を除去することが可能な場合がある。空気の泡または凝塊がない場合には、ラットを再位置決め及び/又は回転またはわずかにカニューレを引っ張って試して有用であり得る。これは時々、それが血管壁に対してブロックされないように、カニューレを再調整することができます。時折カニューレの小さな動きの有無にかかわらず、接着剤を除去しても再び流れるようにリンパ液が可能になります。他のすべてが失敗した場合は、カニューレを再挿入する必要がある。カニューレは最初の試みで正しく挿入されなかったとき我々の経験での実験は、あまり成功している。しかしながら、外科救済が可能である。生じ得る別の合併症は、ラットの間の解剖学的差異による挿管が困難なことである。例えば、腸間膜リンパ管は時折厄介な方向に通過以上腸間膜リンパ管への腸間膜動脈の反対側の付属リンパ管が存在する。そうであるように(小腸から流れるリンパ液の全体積の収集を必要とする実験では)、リンパ管を経由して腸から総脂質および薬物輸送を評価する際に、付属リンパ管は、すべてのリンパが優れたリンパ管に向けられるように閉塞する必要がある。これを達成することは困難であるが、付属ダクトの周りに縫合糸を結ぶか、付属管を切断および獣医接着剤(ステップ3.6)でそれを閉塞することによって試みることができる。付属リンパ管の存在は、リンパ薬物輸送実験において、実験の失敗をもたらす主な要因の一つである。付属品容器が完全に閉塞されていない場合は、リンパ流および脂質および薬物輸送が予想よりも有意に低い。
ここで紹介するプロトコルでは、動物は、リンパの収集期間を通じて麻酔したまま。手術実験一つではなく、数日および外科成功rをかけて行うことができるように(むしろ後述の意識モデルより)麻酔したラットモデルは、実験的なスループットが増加それは、固定化した動物にカニューレの開通性を維持することが容易であるように食べたが大きい。麻酔は、理論的には、胃内容排出、腸の脂質処理やリンパの流れと輸送を減少させることができる。我々の経験では、しかし、リンパ脂質および薬物輸送は、(予め消化し 、予備分散車両内(胃排出をバイパスする)の界面活性剤で分散させ、例えば、脂肪酸モノグリセリドミセル系十二指腸に直接薬剤を投与した麻酔ラットにおいて類似している)同等のトリグリセリド21,23,27で胃に強制経口薬を投与した意識のあるラットと比較した場合。確かに、過去10年間で私たちの研究室で腸リンパ薬物輸送実験の大半を達成することができ、より高いスループットのために麻酔をかけたモデルで行われている。これらの実験において、我々は、ほとんどの場合、脂肪酸( 例えば、オレイン酸)および界面活性剤43を含有する製剤中の薬物を投与している。脂肪酸は腸リンパリポタンパク質に組み込む前にトリグリセリドに合成され、これはトリグリセリドのグリセロール骨格(すなわち2-モノグリセリドまたはグリセロール-3-リン酸)を形成する成分の供給源を必要とする。これは、グリセロール源の非存在下での脂肪酸の投与は減少リンパ輸送をもたらし得ることを示唆している。脂肪酸の投与は、しかしながら、外因性の投与脂肪酸及びリンパ脂質および薬物輸送43に対して内因性脂質の寄与の直接計算を可能にする。さらに、2-モノグリセリドは、高価で、それが容易に腸管腔にグリセロールに消化された1-モノグリセリドとに異性化として一般的に不安定である。ここに報告された研究において、我々はさらにリンパ脂質および薬物輸送は、脂肪酸( 例えば、オレイン酸)とモデル薬物のハロファントリンの管理とPRどちら中の界面活性剤(胆汁塩)製剤以下と等価であることを証明しているグリセロールソース2-モノオレイン( 表1)のesenceまたは不在。グリセロールの内因性の源は、このように等価なリンパ流および脂質およびグリセロール源の非存在下での脂肪酸( 例えば、オレイン酸)、このモデル薬物の投与後の薬物輸送をサポートするのに十分現れる。これは、代表的なリンパ輸送データは、単純な脂肪酸製剤を得ることができるという確信を提供する。
必要に応じて麻酔をかけたモデルが容易に配慮したモデルに拡張される。意識モデル製剤が胃に直接強制経口投与または静脈内または十二指腸内に注入することが可能で、直接の比較は、非リンパ液中で行わ薬物動態試験を行うことができ、意識のある動物、結果はより生理学的に関連すると考えることができるカニューレを挿入。意識のある動物で許容されるより長い期間もdrのためのより完全な薬物動態プロファイルの収集を可能にするという利点を有する麻酔された実験において、血液プロファイルは、特に長い半減期薬物について、しばしば不完全であり、一方、血液中のUGの濃度。しかし、上述したように、意識リンパカニューレ挿入の研究のための成功率が低く、実験が完了するまでに時間がかかる。文献に記載された意識のリンパカニュレーションモデルの2種類がある。意識的に抑制モデル15では、リンパカニュレーション手術後、動物は、単にその前面になっているとコレクションチューブに外面化と挿入リンパカニューレと実験の残りのために適切な拘束に入れた。次いで、動物を意識を取り戻し、外科的手順O / Nから回復させる。このモデルでは成功率は経験オペレータの手の中に非常に良好であるが、それは、リンパ収集に必要な長期間動物を拘束する倫理クリアランスを得ることが困難であることができる。代替モデルは、リンパ液が収集される場所です意識して自由に動くラットから。このモデルは、以前に25に詳述されている。このモデルでは長いカニューレは、腸間膜リンパ管、十二指腸および頸動脈に挿入される。カニューレは、その後、首の後ろで体外とスイベルシステムを介して置かれ、皮膚の下にトンネリングされる。ラットは、スイベルに取り付けハーネスに入れ、意識を取り戻すために外科処置O / Nから回復させる。動物を代謝ケージ及びリンパ内の自由運動を有し、血液サンプルは、ケージの外外在カニューレから採取することができる。
腸間膜リンパカニュレーションは、その発生期状態のリンパコンポーネントの直接評価を可能にする唯一のツールのまま。手術は、大型動物、結果は種27にわたって合理的に匹敵現れるよりモデルは安価で、小さく、大型動物よりも複雑であるようにリンパカニュレーションは、ほとんどの場合、ラットにおいて記載されている。ラットのモードlは、実験の必要性に応じて変更することができ、成功率は、経験豊富なオペレータの手に高い。モデルはまた、詳細には、腸リンパ成分の代謝または機能を調べるために、in vitroまたはin vivo試験で互いに結合することができる。一度腸間膜リンパカニューレ挿入ラットモデルを確立し、従って、リンパ系(多くの場合、全身循環に最終的に流れる)の腸から直接通過する様々なパラメータの濃度、輸送、機能および代謝を評価するための強力なツールである。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sterile saline | Baxter healthcare | AHB 1307 | Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50 |
70 % ethanol in water | Any | Any brand can be used | |
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) | Livingstone International | JJ60243L | Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L |
Betadine solution | Livingstone International | BU0510 | Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510 |
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) | PROVET VICTORIA | KETA I 1 | http://www.provet.com.au/ |
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) | PROVET VICTORIA | TRO-3828 | http://www.provet.com.au/ |
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) | PROVET VICTORIA | VTG-DACP010020 | http://www.provet.com.au/ |
Sodium pentobarbitone | PROVET VICTORIA | 24529 | Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au |
Heparin (35000I.U. in 35 mL) | Sigma Pharmaceuticals | 337220 | http://sigmaco.com.au/ |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E1644 | Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. |
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm | Microtube extensions | PE8050 | Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m |
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm | Microtube extensions | PE9658 | Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m |
Ruler | Any | Any brand can be used | |
Markers | Any | Any brand can be used | |
Cigarette lighter | Any | Any brand can be used | |
Veterinary adhesive | Any | Any brand can be used | |
23 gauge needles | Livingstone International | DN23GX0.75LV | Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV |
25 gauge needles | Livingstone International | DN25GX1.0LV | Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV |
1 ml syringe | Livingstone International | T3SS01TA | Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA |
10 ml syringe | Livingstone International | T3SS10SA | Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA |
Gauze swabs | Livingstone International | GSC075 | Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075 |
Cotton buds | Livingstone International | CTAST075DP | Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP |
Heating pad | Ratek | WT1 | Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray. |
Surgical light | Harvard Apparatus | 72-0215 with 72-0267 | Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail and http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___ |
Surgical microscope | Zeiss | 495005-0014-000 | Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143 |
Silk suture | Livingstone International | DTSK163019F4 | Any brand can be used. Example here is 3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4 |
Scalpel blades | Fine Science Tools (FST) | 10020-00 | Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191 |
Scalpel handle | Fine Science Tools (FST) | 10004-13 | Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51 |
1 x Small surgical scissors | Fine Science Tools (FST) | 14060-09 | Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17 |
2 x Forceps with serrated curved tip | Fine Science Tools (FST) | 11001-13 | Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32 |
1 x Iridectomy scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-08 | Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 |
1 x Forceps with straight serated tip | Fine Science Tools (FST) | 11650-10 | Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32 |
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-10 | Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29 |
1 x Forceps with smooth fine curved forceps | Fine Science Tools (FST) | 11063-07 | Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360 |
2 x Hemostats | Fine Science Tools (FST) | 13010-12 | Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33 |
1 x Suture needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12001-13 | Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70 |
1 x Artery clamp | Fine Science Tools (FST) | 18050-28 | Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82 |
Oleic acid | Sigma Aldrich | O1008 | When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU |
14C-oleic acid | Perkin | NEC317050UC | Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC |
Sodium taurocholate | Sigma Aldrich | T4009 | Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU |
Halofantrine | Glaxo Smith Kline | Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71507 | Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | 71643 | Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU |
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