Abstract
La capacité des cellules malignes à échapper au système immunitaire, caractérisé par l'échappement tumoral à partir des réponses immunitaires innées et adaptatives, est maintenant accepté comme une caractéristique importante de cancer. Notre recherche sur le cancer du sein se concentre sur le rôle actif que les lymphocytes infiltrant les tumeurs jouent dans la progression tumorale et les résultats des patients. Dans ce but, nous avons développé une méthodologie pour l'isolement rapide des cellules lymphoïdes intacts de tissus normaux et anormaux dans un effort pour les évaluer à proximité de leur état natif. Homogénats préparés en utilisant un spectacle de dissociateur mécanique à la fois la viabilité accrue et la cellule de récupération tout en préservant l'expression du récepteur de surface par rapport aux tissus digéré par une enzyme. En outre, la digestion enzymatique de la matière insoluble restante n'a pas récupéré CD45 + cellules supplémentaires indiquant que les mesures quantitatives et qualitatives dans l'homogénat primaire susceptibles reflètent véritablement sous-populations infiltrant dans le fragm de tissusent. Les cellules lymphoïdes dans les homogénats peuvent être facilement caractérisées en utilisant immunologique (phénotype, la prolifération, etc.) ou moléculaire (ADN, ARN et / ou protéine) approches. les cellules CD45 + peuvent également être utilisés pour la purification de la sous-population, l'expansion in vitro ou cryoconservation. Un autre avantage de cette approche est que le surnageant de tissu primaire à partir des homogénats peut être utilisée pour caractériser et de comparer des cytokines, des chimiokines, des immunoglobulines et des antigènes présents dans les tissus normaux et malins. Cette fonction de protocole extrêmement bien pour les tissus mammaires humains et doivent être applicables à une grande variété de tissus normaux et anormaux.
Protocol
REMARQUE: Tous les spécimens ont été acquis au moyen d'un protocole approuvé par le comité d'éthique médicale de l'Institut Jules Bordet avec le consentement éclairé écrit obtenu de chaque patient.
1. Préparation de l'homogénat de tissu
- Disséquer les tissus (résection de tissus malins et normal résection de la salle d'opération) sont dans le laboratoire de pathologie par du personnel qualifié pour la collecte immédiate. Tumeur, NANT (prise la plus grande distance de la tumeur que possible) et des fragments de tissus normaux sont régulièrement traitées dans 1-3 h de l'excision chirurgicale dans un laboratoire de BSL2 en utilisant des procédures de biosécurité standard pour les tissus humains. Un diagramme de flux du protocole est illustré sur la figure 1.
- Peser tous les fragments de tissus (normales, NANT et tumorales) et mesurer la longueur, la largeur et la hauteur (longueur x largeur x hauteur). Ce est une étape importante pour la normalisation ultérieure de sous-populations de cellules, l'ARN extrait, etc.
NOTE: La gamme de taille de l'échantillon est de 100 à 10 000 mm 3 sans gras si possible. - Imprimer le fragment de la tumeur sur une lamelle de verre de coloration H & E afin de vérifier que le tissu est en fait une partie de la tumeur.
- Pour ce faire, en appuyant sur une lame de microscope en verre sur le fragment de la tumeur et appliquant une légère pression avec les doigts pendant quelques secondes.
- Fixer la lame avec de l'isopropanol pendant 2 min, suivie d'une étape de lavage dans l'eau. Counterstain le tissu pendant 30 secondes avec l'hématoxyline de Mayer.
- Laver la lame dans six bains d'eau. Colorer dans la phloxine B 2% pendant 15 sec.
- Laver à un bain d'eau suivie de quatre salles de bains de l'isopropanol et la finition avec une salle de bain de l'eau.
- Incuber dans l'isopropanol pendant 1 min et le drain. Effacer dans deux bains de xylène.
- Montez avec un milieu de montage à base de xylène. Examinez pour cellularité tumorale (Figure 2).
REMARQUE: Principalement, les cellules tumorales collent à la diapositive impressionStylos - les cellules stromales, lymphoïde ou adipose cellules restent rarement, laissant des espaces entre les cellules tumorales (Figure 2).
- Placez le fragment de tissu dans une petite boîte de culture contenant 1 ml de, milieu de cellules hématopoïétiques sans sérum chimiquement défini (ci-après dénommé milieu) à la température ambiante et couper en petits morceaux (~ 1 à 2 mm 2) en utilisant une solution stérile scalpel.
- Transférez tout (fragments de tissus + moyenne) à un tube mécanique dissociateur C.
- Rincer la boîte de Pétri et scalpel avec 2 ml de milieu à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter ceci à tube C (volume du milieu de dissociation = 3 ml).
- Utilisez le A.01 de programme de dissociateur mécanique pour tubes C (le programme le plus doux) pour homogénéiser les fragments de tissus dans une suspension cellulaire unique. Placer le tube de C dans l'appareil et exécuter le programme deux fois de suite (un cycle = 25 sec).
NOTE: Cette procédure d'homogénéisation a été établi et validé pour le tissu mammaire humain, autre tumou tissus ou types peuvent avoir besoin d'utiliser un autre programme et devraient être testés en premier. - Retirer le tube de l'appareil C et l'homogénat décanter directement dans un tamis cellulaire de 40 pm assis sur un tube de 50 ml. En utilisant la même pipette Pasteur comme à l'étape 1.6, transférer le liquide restant dans le tube de C au tamis cellulaire.
- Transférer le liquide filtré dans un tube de 15 ml en utilisant une pointe de micropipette 1 ml. Temporairement maintenir le tamis cellulaire et son tube de 50 ml.
- Rincer le tube de C avec un 3 ml supplémentaires de milieu et transférer ce, encore une fois en utilisant la même pipette Pasteur comme à l'étape 1.6, à l'tamis cellulaire encore assis sur le tube de 50 ml. Pressez un montant maximum de liquide résiduel piégé dans le tissu non homogénéisé dans le tube de 50 ml en déplaçant doucement autour de la crépine avec une pipette Pasteur propre ou une pointe ml qui est ensuite jeté pour éviter de contaminer l'éluat.
- Placez le filtre cellulaire à l'envers sur til tube d'origine C et rinçage avec 3 ml de milieu de sorte que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C.
- Re-homogénéiser comme à l'étape 1.7 pour deux cycles du programme A.01.
- Pour cette deuxième homogénat à travers le tamis cellulaire assis sur le tube de 50 ml, rincer le tube de C de nouveau avec 3 ml de milieu (comme à l'étape 1.10) et transférer à la pipette Pasteur au tamis cellulaire assis sur le tube de 50 ml à nouveau serrant au maximum quantité de liquide à partir du tissu conjonctif résiduel piégé dans le filtre à cellule.
- À ce stade, un volume de ~ 2,5 ml est dans le tube de 15 ml et ~ 9 ml dans le tube de 50 ml.
2. Séparation du surnageant de cellules et de tissus
- Centrifuger les homogénats à 15 ml et les tubes de 50 ml pendant 15 min à 600 x g à température ambiante.
- Décanter le SN du tube de 15 ml dans un tube propre et stocker temporairement à 4 ° C. Ce surnageant = tumeur primaire, NANT ou ti normalessu SN (de volume final de 2,5 ml) est ensuite clarifié et aliquotée avant le stockage à -80 ° C pour les analyses futures (voir ci-dessous).
- Jeter le surnageant à partir du tube de 50 ml.
- Resuspendre doucement les deux culots de cellules dans un volume final de 1 ml de milieu. En bref, la première briser doucement le culot cellulaire dans les deux tubes (en appuyant sur le tube sur une surface dure). Remettre en suspension le culot cellulaire en vrac dans les 50 ml avec 500 ul de milieu et transférer cette suspension de cellules dans le tube de 15 ml pour remettre en suspension le culot secondes. Répétez cette étape une fois avec les secondes 500 pi de milieu pour une récupération maximale des cellules.
- Transfert 10 ul de la suspension cellulaire dans un petit tube, mélanger avec 10 pi de bleu trypan (dilution 1: 1) et compter le nombre de cellules viables à l'aide d'un hémocytomètre.
REMARQUE: À ce stade une fraction de la suspension de cellules peut également être analysée par cytométrie de flux pour évaluer la taille de la cellule, la granularité et si on le désire un nombre limité de marqueurs de sous-populations de plus precise évaluation de la distribution des cellules par rapport à l'homogénat avant l'analyse ou expérimentation extensive. Toutes les analyses par cytométrie flux intègrent étiquetage CD45 pour la normalisation des sous-populations. - Pellet les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Les cellules de la tumeur, NANT, ou un tissu normal sont maintenant prêts pour une autre purification ou d'analyse. Ces étapes supplémentaires sont les mieux lorsqu'elles sont effectuées le même jour que la chirurgie.
NOTE: Pour l'analyse par cytométrie de flux mais pas le tri cellulaire des globules rouges résiduels doivent être lysées après marquage de l'anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse de globules rouges au culot cellulaire, vortex immédiatement pendant 1 seconde et l'incubation d'un minimum de 10 min à manger température (abri de la lumière) avant l'analyse.
3. Clarification du surnageant tissulaire
- Centrifuger les tubes de 1,5 ml avec SN tissulaire à 15 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
- Retirez délicatement til surnageant sans toucher ni déranger le culot. Transférer dans un tube propre (ou tubes) selon le nombre et le volume des aliquotes souhaités.
- Stocker le surnageant à -80 ° C pour une utilisation future.
4. sang du patient
- Prélever un échantillon de sang de chaque patient, en tant que témoin par ponction veineuse dans des tubes héparinisés le jour avant la chirurgie. Centrifuger le sang à 400 g pendant 10 min à 20 ° C avec le frein, pour obtenir le plasma et une couenne.
- Retirez le plasma et la clarifier par centrifugation à 10 000 g pendant 15 min à 20 ºC. Aliquoter et magasin plasma à -80 ° C pour une utilisation future. Diluer la couche leuco-plaquettaire en milieu
- Séparer les cellules mononucléaires en utilisant la centrifugation en gradient de Ficoll-Hypaque norme avant l'analyse immédiate, l'isolement des sous-populations, / ARN / extraction de protéines ou d'ADN cryoconservation.
5. cytométrie en flux
- cellules d'étiquetage selon la fabricationles instructions r à 4 ° C à l'abri de la lumière. Lyser les globules rouges dans les suspensions cellulaires à partir de fragments de tissus après le marquage de l'anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse cellulaire au culot cellulaire.
- Vortexer immédiatement une seconde et incuber un minimum de 10 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Passez les cellules marquées dans un cytomètre de flux pour l'acquisition de données sans lavage.
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Representative Results
La digestion enzymatique de fragments de tissus disponibles dans le commerce avec des solutions de dissociation des tissus ou divers mélanges de laboratoire de la collagénase, la DNase et / ou des inhibiteurs de la hyaluronidase, cliver une large gamme de récepteurs à la surface des cellules. Nos études, d'abord axées sur les cellules T CD4 + infiltrant les tumeurs du sein, ont été rapidement présentés à un problème technique majeur dû au clivage des récepteurs CD4 de surface en utilisant des protocoles de digestion enzymatiques norme 4-8. Nous avons testé une variété d'enzymes de la collagénase avec ou sans DNase et des inhibiteurs de la hyaluronidase, constatant que la collagénase I et II complètement enlevé CD4 de la surface cellulaire, en dépit de la viabilité des lymphocytes haut (figure 3A). Un effet modéré sur CD4 n'a été observée avec la collagénase IV à court temps d'incubation (1-2 hr) avec CD4 inférieur marquage d'anticorps détectées dans les ganglions lymphatiques et digéré le tissu tumoral par rapport à du sang non digérée et de la moelle osseuse provenant du même patient (Figure 3B; noter qu'en raison de limitations sur le tissu que nous recevons, nous ne avons pas pu comparer les ganglions lymphatiques digérés et non digérés et les tissus de la tumeur). Cette perte de CD4 a été confirmé comme étant un sous-produit de la collagénase IV technique digestion par comparaison des cellules T CD4 + non digérés et digérés isolés à partir de sang de donneurs en bonne santé (données non présentées). Bien que ces cellules T CD4 lo peuvent être isolés à partir de fragments de tissus de la collagénase IV digéré en utilisant des billes magnétiques, les populations purifiées contiennent fréquemment des quantités variables de contamination par d'autres cellules dans le microenvironnement tumoral et ainsi étaient sous-optimal pour les fins expérimentales.
Dans une recherche continue pour une meilleure approche, en 2008, nous avons testé un nouveau dissociateur mécanique sans l'aide d'enzymes. Cet appareil produit des homogénats de tissus du sein rapidement et avec intégrité de récepteur de surface maintenue neuf. Représentant flux cytométrie tracés de points de la tumeur homogénats de cellules Follodissociation de l'aile et le marquage avec des anticorps spécifiques contre des cellules épithéliales (EpCAM) et les leucocytes (CD45) sont présentés sur la figure 3C. Ces images sont des observations régulières typiques pour les homogénats de tumeur du sein. Ce protocole ne modifie pas de façon significative la viabilité des cellules CD45 + (4% de cellules mortes); Cependant, il existe une perte considérable de EpCAM + cellules viables (38% de cellules mortes dans la tumeur à consulter; varie entre les tumeurs). Malgré cette perte, la EpCAM viable + et CD45 + sous-ensembles peuvent être séparés sur la base de la taille et de la structure en grandes cellules epitheliales (= cellules tumorales), les petites cellules épithéliales et les grandes CD45 + cellules et petit CD45 + des cellules (la majorité des cellules , qui sont principalement des lymphocytes; Figure 3C).
L'augmentation significative de CD45 + cellules viables obtenus en utilisant cette approche permet l'acquisition de multicolore reproductible cytométrie de flux de données (à l'aidejusqu'à dix couleurs) pour caractériser plus en détail dans les sous-ensembles TIL cancer du sein. Écoulement représentatif cytométrie tracés par points des principaux sous-ensembles TIL sont présentés dans la figure 4, avec nos expériences récentes démontrent qu'il est également possible de détecter et de quantifier mineures des sous-ensembles de cellules T et B infiltrant la tumeur 10 à 12, comprenant la coloration intracellulaire T canonique et Facteurs de transcription des cellules B 12. stratégies de déclenchement pour les lymphocytes sont basés sur les cellules CD45 + viables identifiés avec une tache de viabilité (note:. tumeurs peuvent varier grandement de la quantité de débris cellulaires et les cellules épithéliales mortes selon le sous-type de la Colombie-Britannique, de qualité, etc.). Cette approche a été utilisée avec succès pour purifier des sous-populations de lymphocytes à partir de l'homogénat cellulaire avec des billes magnétiques ou de tri pour l'analyse de l'expression génique en utilisant des puces ou 9 qRT-PCR. Médiateurs solubles dans le SN, y compris des cytokines et des immunoglobulines, ont été quantifiés en utilisant un bead- immunodosage sur des données obtenues normalisée à la taille du fragment de tissu. Une comparaison de l'expression des cytokines (une piscine Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) ou le total des immunoglobulines (IgA, IgE, IgG, IgM) à BC SN SN à partir de tissu mammaire normal révèle des augmentations à la fois associées avec le tissu de la tumeur (Figure 5). Ces tissus primaires de SN ont également été analysés efficacement antigènes 10-12 et utilisée pour traiter expérimentalement lymphocytes de donneurs sains, reproduisant ainsi le phénotype TIL dans les cellules normales neuf.
Figure organigramme 1. Protocole. Notre procédure de traitement des tissus humains fraîches et certaines approches analytiques qui peuvent ensuite être utilisés pour évaluer lymphocytes infiltrant les tissus humains sont présentés.
L'image d'une empreinte de tissu tumoral du sein figure 2. H & E colorées. Cette empreinte, prises à partir d'un fragment de tissu tumoral mammaire frais, montre la présence de cellules tumorales avec les espaces ouverts reflétant les zones qui ne ont pas été transférés. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
. Figure 3. Optimisation de dissociation du tissu mammaire pour l'analyse des lymphocytes analyse cytométrique de flux de: (A) l'expression de surface CD4 sur les lymphocytes non digérée et de la collagénase I / II digéré le tissu tumoral; (B) d'expression de CD4 sur les lymphocytes de ganglions lymphatiques et de tissu tumoral digéré esprith collagénase IV et par rapport au sang et la moelle osseuse des cellules non digérées provenant du même patient; et (C) l'analyse des leucocytes totaux (CD45 +) et les cellules épithéliales (EpCAM) à partir de + tissu tumoral dissocié mécaniquement rapidement en utilisant le protocole décrit ici. La viabilité des cellules épithéliales et CD45 + cellules en utilisant notre protocole est évaluée par incorporation de fixable colorant de viabilité. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. infiltrant la tumeur sous-ensembles de lymphocytes dans l'homogénat. Multicolor analyse par cytométrie de flux a été effectuée le jour de l'intervention chirurgicale après dissociation mécanique selon le protocole décrit ici. Le cellules viables et des principaux sous-populations lymphocytaires unere montré: CD3 est un marqueur de cellules T pan, CD4 et CD8 sont les principaux marqueurs T de sous-ensembles de cellules et CD19 est un marqueur pan de cellules B. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. médiateurs solubles dans le surnageant. Un panel de cytokines (Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) et les immunoglobulines (IgA, IgE, IgG, IgM) ont été évalués en utilisant des immunoessais à base de billes d'analyser SN dérivé de la normale et BC tissus en utilisant le protocole décrit ici.
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Discussion
Cette étude décrit un procédé optimisé pour la préparation rapide d'homogénats de tissus du sein normaux et malins sans digestion enzymatique pour le tri ultérieur de la cellule, l'extraction, la cryoconservation et / ou l'analyse phénotypique de CD45 + sous-populations. L'objectif de cette approche expérimentale est de produire des images de la TIL qui reflètent étroitement leur état in vivo et de les comparer aux tissus normaux avec une manipulation minimale des tissus frais de la salle d'opération. À ce jour, notre laboratoire a utilisé ce protocole pour analyser> 250 tissus de la Colombie-Britannique frais (tumorales et NANT),> 35 tissus mammaires normaux de réductions mammaires. En principe, ce protocole devrait être directement applicable à d'autres types de tumeurs ou de tissus; Toutefois, une certaine optimisation peut être nécessaire (ce est à dire, le programme de dissociation mécanique, nombre de cycles, le volume des médias, etc.). Pour les tissus à faible infiltration lymphocytaire, en utilisant un fragment de tissu plus grand peut être nécessAry, qui est ce que nous faisons pour les tissus normaux où le nombre de lymphocytes est faible. En variante, une étape de centrifugation à gradient de densité peut être ajouté à enrichir la suspension de leucocytes. Cette analyse des sous-populations de cellules T et B humaines infiltrant les tumeurs du sein comprend une évaluation de> 100 marqueurs par cytométrie de flux (cytométrie de flux de données pour 74 marqueurs est disponible dans les données supplémentaires de Gu-Trantien, et al. 9) et la purification des lymphocytes spécifiques pour les analyses immunologiques sous-populations moléculaires et suivantes. En outre, nous avons évalué les cytokines, les chimiokines, les immunoglobulines et les antigènes tumoraux dans le SN de la tumeur primaire (par rapport à NANT SN et de tissu normal) 10,11 comme le reflet de ces médiateurs moléculaires dans le microenvironnement tumoral. Nous avons également testé l'effet du traitement de lymphocytes du sang périphérique de donneurs sains avec SN de la tumeur et montré que bon nombre des changements d'expression des gènes détectés dans le TIL peuvent être spécifiquement reproduit <sup> 9.
Dans leur micro-environnement, les cellules tumorales et stromales sont plus fermement maintenus dans la matrice de tissu que les cellules immunitaires, qui sont typiquement migratoire. Le procédé décrit ici fournit un moyen simple et rapide pour l'isolement et l'analyse de TIL sans digestion enzymatique. Nos nombreuses tentatives pour joindre cette approche d'homogénéisation mécanique avec une digestion enzymatique courte pour produire des cellules viables et récepteur lymphoïdes positive et épithéliales de la même fragment de la tumeur ont été infructueuses. homogénéisation des tissus libère efficacement les lymphocytes mais entraîne une perte significative de viabilité des cellules tumorales. Une digestion enzymatique courte du tissu libère les cellules tumorales viables (le total augmente de nombre en fonction des temps de digestion) mais a la conséquence d'une diminution parallèle dans l'expression de nombreux récepteurs de surface, en particulier apparentes sur les lymphocytes. Ainsi, pour l'analyse comparative des cellules tumorales et des TIL de la même tumou encore il est nécessaire de traiter séparément deux fragments de tumeur séquentielles.
Actuellement, la majorité des études visant à caractériser TIL ont employé digestion enzymatique (heure à O / N) souvent couplées avec une certaine forme de la dissection mécanique 4-8. L'expansion de TIL pour une analyse ultérieure ou la thérapie implique généralement l'ex vivo la culture subséquente de TIL ou des fragments de tissus tumoraux avec des agents stimulants (jours ou semaines) 13-15. La méthode rapide et non-enzymatique pour la dissociation des tissus décrite ici fournit un moyen simple et reproductible permettant d'extraire des cellules CD45 + intact à partir de fragments de tissus normaux et anormaux avant leur extension ou d'analyse. Cette acquisition rapide des cellules CD45 + à partir de patients subissant une tumorectomie pourrait être développé pour être utilisé dans un essai de biomarqueur pronostique. En outre, il peut donner des TIL avec un plus grand potentiel pour l'expansion ex vivo avant adoptifs immunotherapie.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions fromthe Fonds belge pour la recherche scientifique (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Plan Cancer de la Belgique, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson et le Fonds Barsy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
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