Abstract
सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दोनों से ट्यूमर भागने के द्वारा होती प्रतिरक्षा प्रणाली, से बचने के लिए घातक कोशिकाओं की क्षमता अब कैंसर का एक महत्वपूर्ण बानगी के रूप में स्वीकार किया जाता है। स्तन कैंसर पर हमारे शोध ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों ट्यूमर प्रगति और रोगी परिणाम में खेलना है कि सक्रिय भूमिका पर केंद्रित है। इस लक्ष्य की ओर है, हम अपनी मूल अवस्था में उन्हें आसन्न का मूल्यांकन करने के प्रयास में सामान्य और असामान्य ऊतकों से बरकरार ल्य्म्फोइड कोशिकाओं का तेजी से अलगाव के लिए एक पद्धति विकसित की है। सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए एंजाइम-पच ऊतकों के संरक्षण, जबकि एक यांत्रिक dissociator शो दोनों में वृद्धि हुई व्यवहार्यता और सेल वसूली का उपयोग कर तैयार homogenates। इसके अलावा, शेष अघुलनशील सामग्री के enzymatic पाचन प्राथमिक homogenate में मात्रात्मक और गुणात्मक माप की संभावना सही मायने में ऊतक fragm में घुसपैठ उप-जनसंख्या को प्रतिबिंबित का संकेत है कि अतिरिक्त CD45 + कोशिकाओं को ठीक नहीं किया थाईएनटी। इन homogenates में ल्य्म्फोइड कोशिकाओं को आसानी से हो प्रतिरक्षाविज्ञानी (फेनोटाइप, प्रसार, आदि) या आणविक (डीएनए, आरएनए और / या प्रोटीन) का उपयोग कर विशेषता कर सकते हैं दृष्टिकोण। CD45 + कोशिकाओं भी उप-जनसंख्या शुद्धि, इन विट्रो विस्तार या cryopreservation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त लाभ homogenates से प्राथमिक ऊतक सतह पर तैरनेवाला सामान्य और घातक ऊतकों में साइटोकिन्स, Chemokines, इम्युनोग्लोबुलिन और वर्तमान एंटीजन विशेषताएँ और तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल कार्यों बहुत अच्छी तरह से करने के लिए मानव स्तन के ऊतकों और सामान्य और असामान्य ऊतकों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जाना चाहिए।
Protocol
नोट: सभी नमूनों प्रत्येक रोगी से प्राप्त लिखित सूचित सहमति के साथ संस्थान जूल्स Bordet का मेडिकल एथिक्स समिति द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल किया गया।
ऊतक homogenate की 1. तैयारी
- Resected ऊतकों (ऑपरेटिंग कमरे से resected घातक और सामान्य ऊतक) काटना तत्काल पिक के लिए प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा पैथोलॉजी प्रयोगशाला में हैं। ट्यूमर, NANT (संभव के रूप में ट्यूमर से दूर दूरी लिया) और सामान्य ऊतक टुकड़े नियमित तौर पर 1 के भीतर कार्रवाई कर रहे हैं - मानव ऊतकों के लिए मानक जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग एक BSL2 प्रयोगशाला में सर्जिकल छांटना के 3 घंटा। प्रोटोकॉल की एक प्रवाह चार्ट चित्रा 1 में सचित्र है।
- सभी ऊतक टुकड़े (सामान्य, NANT और ट्यूमर) वजन और लंबाई, चौड़ाई, और ऊंचाई (लम्बाई x चौड़ाई x ऊँचाई) को मापने। यह सेल उप-जनसंख्या के बाद सामान्य बनाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, निकाले शाही सेना, आदि है
नहीते: नमूना आकार की सीमा कोई मोटा यदि संभव हो तो साथ 100 से 10,000 3 मिमी है। - ऊतक वास्तव में ट्यूमर का हिस्सा है कि सत्यापित करने के लिए एच एंड ई धुंधला के लिए एक गिलास स्लाइड पर ट्यूमर टुकड़ा छाप।
- ट्यूमर टुकड़ा पर एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड दबाव और कुछ सेकंड के लिए अपनी उंगलियों के साथ कोमल दबाव लागू करने से यह मत करो।
- पानी में एक कपड़े धोने कदम से पीछा 2 मिनट के लिए isopropanol के साथ स्लाइड को ठीक करें। मेयर के hematoxylin के साथ 30 सेकंड के लिए ऊतक Counterstain।
- पानी के छह स्नान में स्लाइड धो लें। 15 सेकंड के लिए Phloxine बी में 2% दाग।
- पानी की एक स्नान के साथ isopropanol और खत्म कर के चार स्नान द्वारा पीछा पानी की एक स्नान में धो लें।
- 1 मिनट और नाली के लिए isopropanol में सेते हैं। Xylene की दो स्नान में साफ़।
- Xylene आधारित बढ़ते मध्यम के साथ माउंट। ट्यूमर cellularity (चित्रा 2) के लिए जांच करते हैं।
नोट: - स्ट्रोमल, ल्य्म्फोइड या विज्ञापन मुख्य रूप से, ट्यूमर कोशिकाओं अंकित स्लाइड करने के लिए छड़ीipose कोशिकाओं को शायद ही कभी ट्यूमर कोशिकाओं के बीच रिक्त स्थान छोड़ रहा है, (चित्रा 2) रहते हैं।
- एक बाँझ का उपयोग कर - रासायनिक परिभाषित, सीरम मुक्त hematopoietic सेल के माध्यम से 1 मिलीलीटर युक्त एक छोटे से संस्कृति डिश में ऊतक टुकड़ा जगह छोटे टुकड़े (2 मिमी 2 ~ 1) में यह कमरे के तापमान पर (इसके बाद माध्यम के रूप में करने के लिए कहा गया है) और पासा स्केलपेल।
- एक यांत्रिक dissociator सी ट्यूब (ऊतक टुकड़े + मध्यम) सब कुछ स्थानांतरण।
- पाश्चर विंदुक का उपयोग माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश और स्केलपेल कुल्ला और सी ट्यूब (हदबंदी के लिए माध्यम की मात्रा = 3 एमएल) के लिए इस जोड़ें।
- एक एकल कक्ष निलंबन में ऊतक टुकड़े homogenize सी ट्यूबों के लिए यांत्रिक dissociator कार्यक्रम A.01 (सबसे कोमल कार्यक्रम) का प्रयोग करें। (एक चक्र = 25 सेकंड) तंत्र में सी ट्यूब प्लेस और उत्तराधिकार में दो बार कार्यक्रम चलाते हैं।
नोट: इस homogenization के प्रक्रिया की स्थापना की और मानव स्तन के ऊतकों, अन्य Tum के लिए मान्य किया गया हैया या ऊतक प्रकार एक अलग प्रोग्राम का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है और पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। - तंत्र से सी ट्यूब निकालें और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर बैठा एक 40 माइक्रोन सेल झरनी में सीधे homogenate छानना। कदम 1.6 के रूप में ही पाश्चर विंदुक का प्रयोग, सेल झरनी के लिए सी ट्यूब में शेष कोई भी तरल हस्तांतरण।
- 1 मिलीलीटर micropipette टिप का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में फ़िल्टर तरल स्थानांतरण। अस्थायी रूप से सेल झरनी और उसके 50 मिलीलीटर ट्यूब रहते हैं।
- मध्यम के एक अतिरिक्त 3 मिलीलीटर के साथ सी ट्यूब कुल्ला और फिर अभी भी 50 मिलीलीटर ट्यूब पर बैठा सेल झरनी के लिए, कदम 1.6 के रूप में ही पाश्चर विंदुक का उपयोग, इस हस्तांतरण। धीरे बाद में eluate contaminating से बचने के लिए दूर फेंक दिया है कि एक साफ पाश्चर विंदुक या 1 मिलीलीटर टिप के साथ झरनी घूम से 50 मिलीलीटर ट्यूब में unhomogenized ऊतक में फंस अवशिष्ट तरल पदार्थ की एक अधिकतम राशि निचोड़।
- उल्टा टी पर सेल झरनी रखेंवह मूल सी ट्यूब और unhomogenized ऊतक वापस सी ट्यूब में चला जाता है तो यह है कि मध्यम से 3 मिलीग्राम से कुल्ला।
- A.01 कार्यक्रम के दो चक्रों के लिए कदम 1.7 में के रूप में पुन: homogenize।
- 50 मिलीलीटर ट्यूब पर बैठा सेल झरनी के माध्यम से इस दूसरे homogenate डालो, (कदम 1.10 के रूप में) 3 मिलीलीटर मध्यम के साथ फिर से सी ट्यूब कुल्ला और फिर एक अधिकतम निचोड़ 50 मिलीलीटर ट्यूब पर बैठा सेल झरनी के लिए पाश्चर विंदुक के साथ हस्तांतरण सेल झरनी में फंस अवशिष्ट संयोजी ऊतक से तरल की राशि।
- इस बिंदु पर, ~ 2.5 मिलीलीटर की मात्रा 15 मिलीलीटर ट्यूब में है और ~ 50 मिलीलीटर ट्यूब में 9 मिलीलीटर।
ऊतक सतह पर तैरनेवाला और प्रकोष्ठों के 2. पृथक्करण
- कमरे के तापमान पर 600 XG पर 15 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर में homogenates और 50 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
- एक साफ ट्यूब में 15 मिलीलीटर ट्यूब से एस.एन. छानना और अस्थायी रूप से चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। इस सतह पर तैरनेवाला = प्राथमिक ट्यूमर, NANT या सामान्य तिवारीssue एस.एन. (अंतिम मात्रा 2.5 मिलीग्राम) बाद में स्पष्ट किया है और भविष्य का विश्लेषण करती है (देखें नीचे) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करने से पहले aliquoted है।
- 50 मिलीलीटर ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- धीरे 1 मिलीलीटर माध्यम की अंतिम मात्रा में दोनों सेल छर्रों resuspend। संक्षेप में, पहले धीरे (एक कठिन सतह पर ट्यूब दोहन से) दोनों ट्यूबों में सेल गोली तोड़ने। मध्यम के 500 μl के साथ 50 मिलीलीटर में ढीला सेल गोली Resuspend और दूसरी गोली resuspend करने के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब को इस सेल निलंबन हस्तांतरण। कोशिकाओं की अधिकतम वसूली के लिए माध्यम की दूसरी 500 μl के साथ एक बार इस चरण को दोहराएँ।
- एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनने और: एक छोटी ट्यूब पर स्थानांतरण सेल निलंबन के 10 μl, trypan नीले रंग के 10 μl (1 कमजोर पड़ने 1) के साथ मिश्रण।
नोट: इस बिंदु पर सेल निलंबन का एक अंश भी सेल आकार, विघटन का मूल्यांकन करने के फ्लो से विश्लेषण किया जा सकता है और अधिक prec के लिए उप-जनसंख्या मार्करों की एक सीमित संख्या अगर वांछितपूर्व व्यापक विश्लेषण या प्रयोग करने के लिए homogenate में रिश्तेदार सेल वितरण का आईएसई आकलन। प्रवाह से सभी विश्लेषण cytometry के उप-जनसंख्या को सामान्य बनाने के लिए CD45 लेबलिंग शामिल। - कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। ट्यूमर, NANT, या सामान्य ऊतक कोशिकाओं से अब आगे की शुद्धि या विश्लेषण के लिए तैयार हैं। सर्जरी के रूप में एक ही दिन पर प्रदर्शन किया जब ये अतिरिक्त कदम अच्छा कर रहे हैं।
नोट: प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए, लेकिन तुरंत एक सेकंड के लिए vortexing, सेल गोली लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 0.4 मिलीलीटर जोड़ने और कमरे पर 10 मिनट की एक न्यूनतम incubating द्वारा एंटीबॉडी लेबलिंग के बाद lysed किया जाना चाहिए अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं सेल छँटाई नहीं विश्लेषण से पहले तापमान (प्रकाश से सुरक्षित)।
ऊतक सतह पर तैरनेवाला के 3. स्पष्टीकरण
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 XG पर ऊतक एस.एन. के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
- ध्यान से टी को दूरवह छू या गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला। संख्या और इच्छित aliquots की मात्रा पर निर्भर करता है एक स्वच्छ ट्यूब (या ट्यूब) पर स्थानांतरण।
- भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला स्टोर।
4. रोगी के रक्त
- Heparinized ट्यूबों में venipuncture द्वारा एक नियंत्रण सर्जरी से पहले दिन के रूप में प्रत्येक रोगी से रक्त के नमूने ले लीजिए। प्लाज्मा और एक buffy कोट प्राप्त करने के लिए ब्रेक बंद के साथ 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर रक्त अपकेंद्रित्र।
- प्लाज्मा निकालें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifugation द्वारा यह स्पष्ट। भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान प्लाज्मा। मध्यम में Buffy कोट पतला
- तत्काल विश्लेषण, उप-जनसंख्या अलगाव, डीएनए / आरएनए / प्रोटीन निकासी या cryopreservation करने से पहले मानक Ficoll-hypaque ढाल centrifugation का उपयोग मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग।
5. फ्लो
- विनिर्माण के अनुसार लेबल कोशिकाओंप्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस पर आर के निर्देशों,। सेल गोली सेल बफर के 0.4 मिलीलीटर जोड़कर एंटीबॉडी लेबलिंग के बाद ऊतक टुकड़े से सेल निलंबन में lyse लाल रक्त कोशिकाओं।
- भंवर तुरंत एक सेकंड के लिए और प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 10 मिनट की एक न्यूनतम, सेते हैं। धोने के बिना डाटा अधिग्रहण के लिए एक प्रवाह cytometer में लेबल कोशिकाओं से गुजरती हैं।
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Representative Results
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक हदबंदी समाधान या collagenase के विभिन्न प्रयोगशाला मिश्रण, DNase और / या hyaluronidase अवरोधकों के साथ या तो ऊतक टुकड़े के enzymatic पाचन, कोशिकाओं की सतह पर रिसेप्टर्स की एक विस्तृत विविधता फोड़ना। शुरू में स्तन ट्यूमर घुसपैठ सीडी 4+ टी कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित हमारे अध्ययन, जल्दी की वजह से मानक enzymatic पाचन प्रोटोकॉल 4-8 का उपयोग कर सतह सीडी 4 रिसेप्टर्स की दरार के लिए एक प्रमुख तकनीकी समस्या के साथ प्रस्तुत किए गए। हम उच्च लिम्फोसाइट व्यवहार्यता (चित्रा 3 ए) के बावजूद, मैं और द्वितीय पूरी तरह से कोशिका की सतह से सीडी 4 हटा दिया कि कोलैजिनेज खोजने के साथ या DNase और hyaluronidase अवरोधकों के बिना कोलैजिनेज एंजाइमों की एक किस्म का परीक्षण किया। एक ही मरीज से पचाया रक्त और अस्थि मज्जा (की तुलना में पचा लिम्फ नोड और ट्यूमर के ऊतक में पाया कम सीडी 4 एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ - (2 घंटा 1) सीडी 4 पर एक उदारवादी प्रभाव कम ऊष्मायन समय पर collagenase चतुर्थ के साथ मनाया गया3B चित्रा; हम हम से पचता है और पचाया लिम्फ नोड और ट्यूमर के ऊतक) की तुलना करने में असमर्थ थे प्राप्त होने के कारण ऊतक पर सीमाओं का ध्यान रखें कि। सीडी 4 का यह नुकसान स्वस्थ दाता रक्त से अलग पचाया और पच सीडी 4+ टी कोशिकाओं की तुलना द्वारा collagenase चतुर्थ पाचन की एक तकनीकी प्रतिफल होने की पुष्टि की गई थी (डेटा) नहीं दिखाया। इन सीडी 4 लो टी कोशिकाओं चुंबकीय मोती का उपयोग collagenase चतुर्थ पचा ऊतक टुकड़े से अलग किया जा सकता है, जबकि शुद्ध आबादी अक्सर ट्यूमर microenvironment से अन्य कोशिकाओं द्वारा संक्रमण की मात्रा अलग होते हैं और इस प्रकार हमारे प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए suboptimal थे।
एक बेहतर दृष्टिकोण के लिए एक सतत खोज में, 2008 में हम एंजाइमों का उपयोग किए बिना एक नया यांत्रिक dissociator का परीक्षण किया। इस तंत्र को तेजी से और सतह रिसेप्टर ईमानदारी के साथ स्तन ऊतक homogenates उत्पादित 9 बनाए रखा। ट्यूमर सेल homogenates follo की डॉट भूखंडों cytometry के प्रतिनिधि प्रवाहउपकला कोशिकाओं (EpCAM) और ल्यूकोसाइट्स (CD45) के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ विंग हदबंदी और लेबलिंग चित्रा -3 सी में दिखाए जाते हैं। इन छवियों को स्तन ट्यूमर homogenates के लिए विशिष्ट दिनचर्या अवलोकन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में काफी CD45 + कोशिकाओं (4% मृत कोशिकाओं) की व्यवहार्यता को बदल नहीं है; (दिखाया ट्यूमर में 38% मृत कोशिकाओं, ट्यूमर के बीच होती है) हालांकि, व्यवहार्य EpCAM + कोशिकाओं के एक काफी नुकसान होता है। इस नुकसान के बावजूद, व्यवहार्य EpCAM + और CD45 + कैंपेन्स बड़े उपकला कोशिकाओं (= ट्यूमर कोशिकाओं), छोटे उपकला कोशिकाओं और बड़े CD45 + कोशिकाओं और छोटे CD45 + कोशिकाओं (कोशिकाओं के बहुमत में आकार और संरचना के आधार पर अलग किया जा सकता है मुख्य लिम्फोसाइटों जो कर रहे हैं, चित्रा -3 सी)।
इस दृष्टिकोण का उपयोग कर प्राप्त व्यवहार्य CD45 + कोशिकाओं में उल्लेखनीय वृद्धि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बहुरंगा के अधिग्रहण का उपयोग कर (डाटा प्रवाह cytometry परमिटदस रंग) और पूरी तरह से स्तन कैंसर में तिल कैंपेन्स चिह्नित करने के लिए। प्रमुख तिल कैंपेन्स के डॉट भूखंडों cytometry के प्रतिनिधि प्रवाह हमारे हाल के प्रयोगों यह विहित टी और के लिए intracellular धुंधला सहित ट्यूमर 10-12 घुसपैठ नाबालिग टी और बी कोशिकाओं कैंपेन्स का पता लगाने और यों भी संभव है कि प्रदर्शन के साथ, 4 चित्र में दिखाए जाते हैं बी सेल प्रतिलेखन 12 कारकों। लिम्फोसाइटों के लिए gating रणनीतियों एक व्यवहार्यता दाग के साथ की पहचान व्यवहार्य CD45 + कोशिकाओं के आधार पर कर रहे हैं (नोट:। ट्यूमर बहुत सेलुलर मलबे और ईसा पूर्व उप-प्रकार, ग्रेड, आदि के आधार पर मृत उपकला कोशिकाओं की राशि में अलग-अलग हो सकते हैं)। यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक प्रोटीन या qRT- पीसीआर 9 का उपयोग जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए छँटाई चुंबकीय मोती या सेल के साथ homogenate से लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। साइटोकिन्स और इम्युनोग्लोबुलिन सहित एस.एन., घुलनशील में मध्यस्थों, एक bead- का उपयोग मात्रा किया गया है ऊतक टुकड़ा के आकार के लिए सामान्यीकृत परिणामी डेटा के साथ आधारित Immunoassay। साइटोकाइन अभिव्यक्ति (एक Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17 पूल) या सामान्य स्तन के ऊतकों से एस.एन. साथ ई.पू. एस.एन. में कुल इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी ऐ, आईजीई, आईजीजी, आईजीएम) की तुलना से ट्यूमर के ऊतक के साथ जुड़े दोनों में वृद्धि का पता चलता है (चित्रा 5)। इन प्राथमिक ऊतक एस.एन. की भी प्रभावी ढंग से एंटीजन 10-12 के लिए विश्लेषण और प्रयोगात्मक जिससे सामान्य कोशिकाओं 9 में तिल फेनोटाइप reproducing, स्वस्थ दाताओं से लिम्फोसाइटों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया है।
चित्रा 1. प्रोटोकॉल प्रवाह चार्ट। ताजा मानव ऊतकों और बाद में मानव ऊतकों में घुसपैठ लिम्फोसाइटों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कुछ विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के प्रसंस्करण के लिए हमारी प्रक्रिया दिखाए जाते हैं।
चित्रा 2. एच ई एक स्तन ट्यूमर के ऊतक छाप की छवि पर दाग। एक ताजा स्तन ट्यूमर के ऊतक टुकड़ा से लिया इस चिह्न, हस्तांतरित नहीं किए गए क्षेत्रों को दर्शाती खुली जगह के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति को दर्शाता है। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की।
। लिम्फोसाइट विश्लेषण के लिए स्तन ऊतक हदबंदी की चित्रा 3. अनुकूलन प्रवाह cytometric विश्लेषण के: पचाया और Collagenase मैं / द्वितीय से लिम्फोसाइटों पर (ए) सीडी 4 सतह अभिव्यक्ति ट्यूमर के ऊतक पच; (बी) लिम्फ नोड और ट्यूमर के ऊतक पच बुद्धि से लिम्फोसाइटों पर सीडी 4 अभिव्यक्तिएक ही मरीज से पचाया रक्त और अस्थि मज्जा कोशिकाओं की तुलना में एच Collagenase चतुर्थ और; कुल ल्यूकोसाइट्स (CD45 +) और ट्यूमर के ऊतक से उपकला कोशिकाओं (EpCAM +) के और (सी) विश्लेषण तेजी से यंत्रवत् प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित का उपयोग कर अलग। उपकला कोशिकाओं और हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग CD45 + कोशिकाओं की व्यवहार्यता फिक्स व्यवहार्यता डाई के समावेश के माध्यम से मूल्यांकन किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा homogenate में लिम्फोसाइट कैंपेन्स घुसपैठ 4. ट्यूमर। बहुरंगा प्रवाह cytometric विश्लेषण यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग यांत्रिक हदबंदी के बाद सर्जरी के दिन पर प्रदर्शन किया गया था। व्यवहार्य कोशिकाओं और प्रमुख लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या एकदिखाया पुन: CD3 है एक पैन टी सेल मार्कर, सीडी 4 और CD8 प्रमुख टी सेल सबसेट मार्करों हैं और CD19 एक पैन बी सेल मार्कर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सतह पर तैरनेवाला में चित्रा 5. घुलनशील मध्यस्थों। साइटोकिन्स के एक पैनल (Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) और इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी ऐ, आईजीई, आईजीजी, आईजीएम) एस.एन. सामान्य और ईसा पूर्व से निकाली गई विश्लेषण करने के लिए मनका-आधारित immunoassays का उपयोग मूल्यांकन किया गया यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग ऊतकों।
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Discussion
इस अध्ययन के बाद सेल छँटाई, निकासी, cryopreservation और / या CD45 + उप-जनसंख्या के प्ररूपी विश्लेषण के लिए enzymatic पाचन के बिना सामान्य और घातक स्तन ऊतक homogenates का तेजी से तैयार करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन है। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लक्ष्य के निकट उनके vivo में राज्य को प्रतिबिंबित और ऑपरेटिंग कमरे से ताजा ऊतकों की न्यूनतम हेरफेर के साथ सामान्य ऊतकों को उनकी तुलना कि तिल की छवियों का उत्पादन होता है। तिथि करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला> 250 ताजा ई.पू. ऊतकों (ट्यूमर और NANT),> स्तन कटौती से 35 सामान्य स्तन के ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया गया है। प्रिंसिपल में, इस प्रोटोकॉल अन्य ट्यूमर या प्रकार के ऊतकों को सीधे लागू किया जाना चाहिए; हालांकि, कुछ अनुकूलन आवश्यक हो सकता है (यानी, यांत्रिक हदबंदी कार्यक्रम, चक्रों की संख्या, मीडिया मात्रा, आदि)। Necess हो सकता है एक बड़ा ऊतक टुकड़ा का उपयोग कम लिम्फोसाइट घुसपैठ के साथ ऊतकों के लिएहम लिम्फोसाइट गिनती कम है, जहां सामान्य ऊतकों के लिए क्या कर रहा है, जो आरे,। वैकल्पिक रूप से, एक घनत्व ढाल centrifugation कदम ल्युकोसैट निलंबन को समृद्ध करने के लिए जोड़ा जा सकता है। स्तन ट्यूमर घुसपैठ मानव टी और बी सेल उप-जनसंख्या के इस विश्लेषण फ्लो द्वारा> 100 मार्कर के एक आकलन भी शामिल है और विशिष्ट लिम्फोसाइट की शुद्धि (74 मार्करों के लिए डेटा प्रवाह cytometry अनुपूरक गुजरात-Trantien का डेटा, एट अल। 9 में उपलब्ध है) बाद में प्रतिरक्षाविज्ञानी और आणविक विश्लेषण के लिए उप-जनसंख्या। इसके अलावा, हम प्राथमिक ट्यूमर एस.एन. में साइटोकिन्स, Chemokines, इम्युनोग्लोबुलिन और ट्यूमर एंटीजन का मूल्यांकन किया ट्यूमर microenvironment में इन आणविक मध्यस्थों का एक प्रतिबिंब के रूप में 10,11 (NANT और सामान्य ऊतकों एस.एन. की तुलना में)। हम यह भी ट्यूमर एस.एन. के साथ स्वस्थ दाताओं से परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों के इलाज और तिल में पाया जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के कई विशेष रूप से reproduced किया जा सकता है कि दिखाया गया के प्रभाव का परीक्षण किया है <समर्थन> 9।
उनके microenvironment में, ट्यूमर और stromal कोशिकाओं और अधिक मजबूती से विशेषतया प्रवासी हैं जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तुलना में, ऊतक मैट्रिक्स में आयोजित की जाती हैं। यहाँ वर्णित विधि अलग और enzymatic पाचन बिना तिल का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और तेजी साधन प्रदान करता है। हमारे कई प्रयास असफल रहा है एक ही ट्यूमर टुकड़ा से व्यवहार्य और रिसेप्टर सकारात्मक ल्य्म्फोइड और उपकला कोशिकाओं के निर्माण के लिए एक छोटी enzymatic पाचन के साथ इस यांत्रिक homogenization के दृष्टिकोण शामिल होने के लिए। ऊतक homogenization कुशलतापूर्वक लिम्फोसाइटों विज्ञप्ति लेकिन ट्यूमर सेल व्यवहार्यता का एक महत्वपूर्ण नुकसान में परिणाम है। ऊतक का एक छोटा enzymatic पाचन व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं (पाचन समय के एक समारोह के रूप में कुल संख्या बढ़ जाती है) मुक्त लेकिन लिम्फोसाइटों पर विशेष रूप से स्पष्ट कई सतह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति में एक समानांतर कमी का परिणाम है। इस प्रकार, एक ही Tum से ट्यूमर कोशिकाओं और तिल का तुलनात्मक विश्लेषण के लिएया यह अलग-अलग दो अनुक्रमिक ट्यूमर के टुकड़े को प्रोसेस करने के लिए भी आवश्यक है।
वर्तमान में, तिल चिह्नित करने के लिए डिज़ाइन किया गया अध्ययन के बहुमत अक्सर मैकेनिकल विच्छेदन 4-8 के कुछ फार्म के साथ युग्मित enzymatic पाचन (ओ / एन घंटे) कार्यरत है। आगे के विश्लेषण या चिकित्सा के लिए तिल का विस्तार आम तौर पर (सप्ताह के दिन) तिल या उत्तेजक एजेंटों के साथ ट्यूमर के ऊतक के टुकड़े के बाद पूर्व vivo खेती 13-15 शामिल है। यहाँ वर्णित ऊतक हदबंदी के लिए तेजी से, गैर एंजाइमी विधि से पहले उनके विस्तार या विश्लेषण करने के लिए सामान्य और असामान्य ऊतक टुकड़े से बरकरार CD45 + कोशिकाओं को निकालने के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साधन प्रदान करता है। Tumorectomy के दौर से गुजर रोगियों से CD45 + कोशिकाओं की यह शीघ्र अधिग्रहण संभवतः एक शकुन बायोमार्कर परख में उपयोग के लिए विकसित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह पूर्व vivo विस्तार के लिए अधिक से अधिक क्षमता के साथ तिल उपज हो सकती है immunothe दत्तक करने से पहलेrapy।
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Acknowledgments
अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था इस काम साइंटिफिक रिसर्च (FNRS), लेस एमिस De L'Institut Bordet, FNRS आपरेशन Télévie, बेल्जियम की योजना कैंसर, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds जे.सी. Heuson और Fonds Barsy के लिए बेल्जियम के फंड fromthe।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
- Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
- Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
- Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
- Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
- Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).
