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Immunology and Infection

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

Published: December 6, 2014 doi: 10.3791/52392
* These authors contributed equally

Abstract

両方の自然免疫と適応免疫応答から腫瘍回避することを特徴とする免疫系を回避するために、悪性細胞の能力は、現在、癌の重要な特質として受け入れられている。乳癌に関する我々の研究は、腫瘍浸潤リンパ球は、腫瘍の進行および患者の転帰に果たす積極的な役割に焦点を当てています。この目標に向けて、我々は彼らの本来の状態にそれらが近接し、評価するための努力で正常と異常な組織から無傷のリンパ細胞の迅速な単離のための方法論を開発しました。酵素で消化された組織と比較して表面の受容体の発現を維持しながら、ホモジネートを、機械的解離のショーを使用して増加した生存率および細胞の回復の両方を用意しました。さらに、残りの不溶性物質の酵素消化は、プライマリホモジネートにおける定量的および定性的測定が可能性が高い純粋に組織fragmで浸潤亜集団を反映していることを示す追加のCD45 +細胞を回復しませんでしたENT。これらのホモジネート中のリンパ球様細胞は容易に免疫学(表現型は、増殖など )または分子(DNA、RNAおよび/ ​​またはタンパク質)に近づく使用して特徴付けることができる。 CD45 +細胞は、亜集団の精製、in vitro増殖または凍結保存のために使用することができる。このアプローチのさらなる利点は、ホモジネートから一次組織の上清を、サイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリンおよび正常および悪性組織中に存在する抗原を特徴付け、比較するために使用することができることである。このプロトコルは、ヒト乳房組織に極めてよく機能し、正常と異常組織の多種多様に適用可能であるべきである。

Protocol

注:すべての標本は、各患者から得た書面によるインフォームドコンセントを得て研究所ジュール·ボルデの医学倫理委員会によって承認されたプロトコルを使用して取得した。

組織ホモジネートの調製

  1. 切除組織(手術室から切除悪性および正常組織)を解剖即時のピックアップのために訓練を受けた者が病理学研究室である。腫瘍は、NANT(できるだけ腫瘍から最も遠い距離を撮影したもの)と正常組織断片を日常的に1内で処理される - ヒト組織のための標準的なバイオセーフティ手順を使用してBSL2実験室で外科的切除の3時間。プロトコルのフローチャートを図1に示されている。
  2. すべての組織片(通常NANTおよび腫瘍)を秤量し、長さ、幅、および高さ(長さ×幅×高さ)を測定する。これは、細胞集団のその後の正規化のための重要なステップは、抽出されたRNA である
    NOTE:可能な場合はサンプルサイズの範囲は、無脂肪と100〜10,000 mm 3である。
  3. 組織が実際に腫瘍の一部であることを確認するために、H&E染色のためにスライドガラス上の腫瘍断片をインプリントする。
    1. 腫瘍断片上のガラス顕微鏡スライドを押すと数秒間指で穏やかな圧力を適用することによってこれを行います。
    2. 水中での洗浄工程に続いて2分間イソプロパノールでスライドを修正。マイヤーのヘマトキシリン​​で30秒のための組織を対比。
    3. 水の6浴にスライドを洗ってください。フロキシンBで15秒間、2%を染色する。
    4. 水1浴でイソプロパノールと仕上げの4風呂の水、続いて1浴で洗ってください。
    5. 1分およびドレイン用のイソプロパノール中でインキュベートします。キシレンの2浴場でクリア。
    6. キシレンベースマウント培地にマウントします。腫瘍細胞充実度( 図2)のために調べます。
      注:主に、腫瘍細胞が刻印スライドに固執 - 間質、リンパ系または広告ipose細胞はほとんどの腫瘍細胞( 図2)の間にスペースを残して、残っていない。
  4. 滅菌を使用して-化学的に規定された、無血清造血細胞培地1mlを含む小さな培養皿で組織片を配置小片(2mmの2〜1)にそれを室温で(以下、媒体と呼ぶ)とダイス外科用メス。
  5. 機械的解離のCチューブにすべてのもの(組織片+媒体)を転送します。
  6. パスツールピペットを用いて培地2mlでペトリ皿とメスをすすぎ、Cチューブ(解離のための媒体の体積= 3ミリリットル)にこれを追加します。
  7. 単一細胞懸濁液に組織片を均質化するために、C管の機械的解離プログラムA.01(最も穏やかなプログラム)を使用します。装置内でCチューブを配置し、2回続けてプログラムを実行する(1サイクル= 25秒)。
    注:この均質化手順は、他のTUM、ヒト乳房組織のために設立され、検証されているまたはまたは組織タイプは、別のプログラムを使用する必要があるかもしれませんし、最初にテストする必要があります。
  8. 装置からCチューブを外し、50ミリリットルチューブに座った40μmのセルストレーナーに直接ホモジネートをデカント。 工程1.6と同様のパスツールピペットを用いて、セルストレーナーにC管に残っている液体を移す。
  9. 1ミリリットルマイクロピペットチップを用いて15ミリリットルチューブに濾過された液体を転送します。一時的にセルストレーナーとその50ミリリットルチューブを保つ。
  10. メディアの追加の3ミリリットルでCチューブをすすぎ、再びまだ50ミリリットルチューブに座ったセルストレーナーに、 ステップ1.6と同様にパスツールピペットを用いて、これを転送します。優しくクリーンなパスツールピペットまたはその後溶出液を汚染を避けるために捨てられる1ミリリットルチップでストレーナーのまわりでそれを移動して50ミリリットルチューブにunhom​​ogenized組織に閉じ込められた残液の最大量を絞る。
  11. 逆さT上のセルストレーナーを配置彼元のC管とunhom​​ogenized組織がバックC管に降下するように、培地の3ミリリットルで洗い流し。
  12. A.01プログラムの2つのサイクルのためのステップ1.7のように再均質化する。
  13. 再び最大圧搾50mlのチューブに着座細胞ストレーナーを通してこの第ホモジネートを入れ( ステップ1.10のように)培地3mlで再びCチューブをすすぎ、50mlチューブに着座セルストレーナーにパスツールピペットで移すセルストレーナー中に閉じ込め残留結合組織から液体の量。
  14. この時点で、〜2.5ミリリットルの容積は、15mlチューブ中で、約50 mlチューブ9 mlである。

組織上清と細胞の2の分離

  1. 室温で600×gで15分間15ml中ホモジネートを50 mlチューブを遠心する。
  2. きれいなチューブに15ミリリットルチューブからSNをデカントし、一時的に4℃で保存する。この上清=原発腫瘍、NANTまたは通常のTIssue SN(最終容量2.5ml)を、続いて清澄化し、将来の分析(下記参照)のために-80℃で保存する前に分注する。
  3. 50ミリリットルチューブから上清を捨てる。
  4. 静かに1ミリリットル中の最終容量の両方で細胞ペレットを再懸濁します。簡単に言えば、最初の優しく(ハード面上にチューブをタップして)両方の管に細胞ペレットを破る。培地500μlで50ミリリットルで緩い細胞ペレットを再懸濁し、第二のペレットを再懸濁し15ミリリットルチューブにこの細胞懸濁液を転送します。セルの最大回復のための媒体の第2の500μlの一回、この手順を繰り返します。
  5. 小さなチューブに移すの細胞懸濁液10μlを、トリパンブルー10μlのミックス(希釈1:1)と血球計数器を用いて生細胞の数を数える。
    注:この時点で、細胞懸濁液の一部は、細胞サイズを評価するためにフローサイトメトリーによって分析することができ、粒度よりprecのための亜集団のマーカーの数が限られて、所望の場合事前の広範な分析や実験にホモジネートにおける相対的な細胞分布の伊勢評価。流れによる全ての分析は、フローサイトメトリー亜集団の正規化のためにCD45のラベルを組み込む。
  6. 室温で10分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。腫瘍由来の細胞、NANT、または正常組織は今、さらに精製または分析のために準備ができている。手術と同じ日に行われたときにこれらの追加のステップは最高です。
    注:フローサイトメトリー分析のために、すぐ1秒間ボルテックスし、細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液0.4mlを添加し、室温で10分間の最小値をインキュベートすることにより抗体標識後に溶解されるべき残留赤血球を選別細胞ではない分析前の温度(光から保護)。

組織上清の3明確化

  1. 遠心機で4℃で15分間15000×gで組織SN 1.5 mlチューブに。
  2. 慎重にTを削除彼が触れたり、ペレットを乱すことなく、上清。希望する分量の数やボリュームに応じて、清潔なチューブ(またはチューブ)に移す。
  3. 将来の使用のために-80℃で上清を保管してください。

4.患者の血液

  1. 手術前に、ヘパリン化チューブに静脈穿刺による制御の日として各患者から血液サンプルを収集する。血漿と軟膜を得るために、ブレーキをオフにして20ºCで10分間400×gで血液を遠心。
  2. 血漿を除去し、20ºCで15分間万×gで遠心分離することにより、それを明確にする。将来の使用のために-80℃でアリコートとストアプラズマ。培地中のバフィーコートを希釈
  3. 前の即時分析を標準フィコール - ハイパック勾配遠心分離を用いて単核細胞を分離し、亜集団の単離、DNA / RNA /タンパク質抽出または凍結保存。

5.フローサイトメトリー

  1. ラベル細胞の製造に応じて光から保護して4℃でのr命令。細胞ペレットを細胞溶解緩衝液0.4 mlで添加することによって抗体標識後の組織片由来の細胞懸濁液中に溶解赤血球。
  2. 渦はすぐに1秒間、光から保護し、室温で10分間の最小値を、インキュベートする。洗浄することなく、データ取得のためのフローサイトメーターで標識細胞を渡します。

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Representative Results

市販の組織解離溶液またはコラゲナーゼの様々な実験用混合物は、DNaseおよび/またはヒアルロニダーゼ阻害剤のいずれかと組織断片の酵素消化は、細胞の表面上の受容体の多種多様を切断する。最初に乳房腫瘍浸潤CD4 + T細胞に焦点を当てた我々の研究は、急速による標準的な酵素消化プロトコル4-8を用いた表面CD4受容体の切断に大きな技術的な問題を提示した。我々は、高いリンパ球の生存率( 図3A)にもかかわらず、細胞表面からコラゲナーゼIおよびIIを完全に除去CD4を見つける、またはDNaseおよびヒアルロニダーゼを阻害することなく、コラゲナーゼ酵素の様々な試験を行った。同じ患者からの未消化の血液および骨髄(と比較して消化されたリンパ節および腫瘍組織で検出されたより低いCD4抗体標識と - (2時間1)CD4に対する適度な効果は、短いインキュベーション時間でコラゲナーゼIVで観察された図3B。我々は消化し、未消化リンパ節と腫瘍組織)を比較することができませんでした受信により組織上の制限のためにあることに注意。 CD4のこの損失は、健康なドナーの血液から単離した未消化及び消化されたCD4 + T細胞を比較することにより、コラゲナーゼIV消化の技術的な副産物であることを確認した(データは示さず)。これらのCD4 見よ T細胞は、磁気ビーズを使用して、コラゲナーゼIVで消化された組織片から単離することができる一方で、精製された集団は、しばしば、腫瘍微小環境からの他の細胞による汚染の様々な量を含有し、したがって、我々の実験の目的のために準最適であった。

より良いアプローチのための継続的な検索では、2008年には酵素を使用せずに新たな機械的解離をテストした。この装置は、急速に乳房組織ホモジネートを製造し、表面受容体の完全性と9を維持した。腫瘍細胞ホモジネートフォッロのドットプロット代表的なフローサイトメトリー上皮細胞(EpCAMの)および白血球(CD45)に対する特異的抗体を用いた翼解離標識は、 図3Cに示されている。これらの画像は、乳房の腫瘍ホモジネートの典型的な定常観測である。このプロトコルは、大幅にCD45 +細胞(4%死細胞)の生存能力が変更されることはありません。しかし、実行可能なのEpCAM +細胞のかなりの損失がある(図示腫瘍で38%死細胞は、腫瘍が間で変動する)。この損失にもかかわらず、生存のEpCAM +およびCD45 +サブセットは大上皮細胞(=腫瘍細胞)に大きさと構造に基づいて分離することができ、小上皮細胞および大CD45 +細胞および小CD45 +細胞(細胞の大部分、その主にリンパ球である; 図3C)。

このアプローチを用いて得られた実行可能なCD45 +細胞の有意な増加は、再現多色の取得が使用して(フローサイトメトリーデータを許可する10色)までのより完全乳癌におけるTILサブセットを特徴付ける。主要なTILサブセットのドットプロット代表的なフローサイトメトリーは、それが標準的なTための細胞内染色を含む腫瘍10-12浸潤マイナーTおよびB細胞サブセットを、検出および定量化することも可能であることを実証する我々の最近の実験によって、 図4に示されており、 B細胞転写因子12。リンパ球のためのゲーティング戦略は生存能力染色で識別可能なCD45 +細胞に基づいています( 注:腫瘍は、細胞破片と死んだ上皮細胞の量BCサブタイプに応じて、学年などで大きく異なります )。このアプローチは、正常にマイクロアレイまたは定量RT-PCR 9を用いた遺伝子発現解析のために選別した磁気ビーズまたは細胞とのホモジネートからのリンパ球亜集団を精製するために使用されている。サイトカインおよび免疫グロブリンを含む、SN、中の可溶性メディエーターは、bead-を用いて定量化されてきた組織断片の大きさに正規化された結果のデータに基づくイムノアッセイ。サイトカイン発現(のTh1 / Th2の/ TH7 / TH9 / Th17のプール)または正常な乳房組織のSNとBC SN総免疫グロブリン(IgA、IgE、IgG、IgM抗体)との比較は、腫瘍組織に関連する両方の増加を明らかにした( 図5)。これらの一次組織SNのも効果的に抗原10-12について分析し、それによって正常細胞9 TIL表現型を再生し、実験的に健康なドナーからのリンパ球を治療するために使用されてきた。

図1
図1プロトコルフローチャート。新鮮なヒト組織およびその後のヒト組織を浸潤リンパ球を評価するために使用できるいくつかの分析的アプローチを処理するための我々の手順が示されている。

YS "> 図2
乳房腫瘍組織のインプリントの図2. H&E染色された画像。新鮮な乳房腫瘍組織片から採取したこのインプリントは、転送されなかった領域を反映したオープンスペースを持つ腫瘍細胞の存在を示している。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。

図3
リンパ球の分析のための乳房組織の解離の、図3の最適化のフローサイトメトリー分析未消化およびコラゲナーゼI / II由来のリンパ球上の(A)CD4の表面発現は、腫瘍組織を消化。 (B)リンパ節および腫瘍組織消化ウィットからのリンパ球上のCD4発現同じ患者からの未消化の血液および骨髄細胞と比較して時間のコラゲナーゼIV;および急速に機械的にここに記載したプロトコルを用いて解離腫瘍組織から全白血球(CD45 +)および(C)分析及び上皮細胞(のEpCAM +)。私たちのプロトコルを使用して上皮細胞およびCD45 +細胞の生存率は、固定可能な実行可能性色素の取り込みによって評価する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図ホモジネートにおけるリンパ球サブセットの浸潤4腫瘍。マルチカラーフローサイトメトリー分析は、ここに記載されたプロトコルを使用して、機械的解離後の手術の日に行った。生存細胞および主要なリンパ球亜集団A示さRE:CD3はパンT細胞マーカー、CD4とCD8は、主要なT細胞サブセットマーカーであるとCD19は、パン、B細胞のマーカーである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5可溶性上清中のサイトカインのメディエーター。パネル(のTh1 / Th2の/ TH7 / TH9 / Th17細胞)および免疫グロブリン(IgA、IgE、IgG、IgM抗体)を、正常から誘導SNとBCを分析するために、ビーズに基づく免疫アッセイを用いて評価した。ここに記載されたプロトコルを使用して組織。

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Discussion

この研究は、その後の細胞選別、抽出、凍結保存および/ ​​またはCD45 +集団の表現型分析のために酵素消化せず、正常および悪性の乳房組織ホモジネートの迅速な調製のために最適化された方法を記載している。この実験アプローチの目的は、密接にそれらのインビボ状態を反映し、手術室からの新鮮な組織の最小限の操作で、正常組織と比較しますTILの画像を生成することである。現在までに、私たちの研究室では> 250新鮮BC組織(腫瘍およびNANT)、>乳房の削減から35正常乳房組織を分析するために、このプロトコルを使用しています。原則として、このプロトコルは、他の腫瘍または組織型に直接適用可能であるべきである。しかしながら、いくつかの最適化が必要であり得る( すなわち、機械的解離プログラム、サイクル数、培地容量など )。 necessすることができる、より大きな組織片を用いた低リンパ球浸潤を有する組織に対する我々はリンパ球数が低い正常組織のために何をすべきかです進、。あるいは、密度勾配遠心分離工程は、白血球懸濁液を濃縮するために添加することができる。乳房の腫瘍浸潤ヒトTおよびB細胞亜集団のこの分析は、フローサイトメトリーによる> 100マーカーの評価が含まれており、特定のリンパ球の精製(74マーカーフローサイトメトリーデータは、補助的なGU-Trantienのデータ 9で利用可能です)その後の免疫学的および分子分析のための亜集団。さらに、我々は、原発腫瘍SN中のサイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリン及び腫瘍抗原を評価し、腫瘍微小環境におけるこれらの分子メディエーターの反映として10,11(NANTと正常組織のSNと比較して)。我々はまた、腫瘍のSNを有する健康なドナーからの末梢血リンパ球を治療し、TILに検出される遺伝子発現の変化の多くは、具体的に再現することができることを示すの効果を試験した<SUP> 9。

それらの微小環境は、腫瘍および間質細胞は、より密に特徴的に遊走された免疫細胞、より組織マトリックス内に保持されている。ここで説明する方法は、単離および酵素消化なしTILを分析するための簡単​​かつ迅速な手段を提供する。私たちの多くの試みは成功していない同じ腫瘍断片から生存可能レセプター陽性リンパ系および上皮細胞を産生するために、短い酵素消化、この機械均質化アプローチに参加する。組織の均質化を効率的にリンパ球を放出するが、腫瘍細胞の生存率の有意な損失をもたらす。組織の短い酵素消化は、生存腫瘍細胞を遊離させる(総数は、消化時間の関数として増加する)が、リンパ球で特に明らかなように、多数の表面受容体の発現の並列減少の結果を有する。したがって、同じタムからの腫瘍細胞とTILの比較分析のためにまたは別途つの連続腫瘍断片を処理することが必要である。

現在、TILを特徴付けるために設計された研究の大部分は、しばしば、機械的解離4-8の何らかの形で連結された(O / N時間)酵素消化を使用している。さらなる分析または治療のためのTILの拡大は、一般的に(数日から数週間)TILまたは刺激剤による腫瘍組織フラグメントのその後のex vivoでの培養13〜15を含む。ここで説明する組織解離のための迅速な、非酵素的方法は、従来、その膨張や分析に正常と異常組織断片から無傷のCD45 +細胞を抽出するための簡単で再現性のある手段を提供する。腫瘍摘出術を受けた患者からのCD45 +細胞のこの迅速な取得は、おそらく予後バイオマーカーアッセイにおける使用のために開発することができる。また、前に養子immunotheにTIL ex vivoでの拡大のための大きな可能性をもたらすことができるrapy。

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Acknowledgments

この作品は、科学研究費(FNRS)、レス·エイミスドゥ研究所Bordetおよび、FNRS-操作Télévie、ベルギーのプランがん、フォンランボー-Marteaux、フォンJC HeusonとフォンBarsyベルギー基金をfromtheの補助金によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GentleMacs Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R Eppendorf or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R Eppendorf or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet ESCO global or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope Nikon eclipse TS100 or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield  640210 or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer Beckman Coulter or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube Miltenyi Biotec 130-096-344 BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish Sarstedt 72,710 or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel Swann-Morton 0510 or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm Becton Dickinson 734-0002 or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml Becton Dickinson 352070 or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml Becton Dickinson 352097 or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml Becton Dickinson 352008 or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml VWR 612-1685 or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml Eppendorf 7805-00 or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20 Lonza BE04-448Q serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline Lonza BE17-516F standard physiological PBS
Trypan blue VWR 17942E or other vital stain
VersaLyse Beckman Coulter A09777 for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780 eBioscience 65-0865-14 for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC BD Biosciences 345763 for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue Miltenyi Biotec 130-094-363 for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE BD Biosciences 345769 for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC Miltenyi Biotec 130-091-232 for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD Beckman Coulter 737659 for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP BD Biosciences 345774 for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770 Miltenyi Biotec 130-096-643 for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen Miltenyi Biotec 130-096-906 for flow cytometry experiments

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References

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免疫学号94、腫瘍免疫学、腫瘍浸潤リンパ球、CD45
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Garaud, S., Gu-Trantien, C.,More

Garaud, S., Gu-Trantien, C., Lodewyckx, J. N., Boisson, A., De Silva, P., Buisseret, L., Migliori, E., Libin, M., Naveaux, C., Duvillier, H., Willard-Gallo, K. A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes. J. Vis. Exp. (94), e52392, doi:10.3791/52392 (2014).

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