Abstract
doğal ve adaptif immün yanıtların hem tümör kaçış ile karakterize bağışıklık sistemini, kaçmak için malign hücrelerin yeteneği şimdi kanser önemli bir ayırt edici niteliği olarak kabul edilmektedir. Meme kanseri ile ilgili araştırma tümör infiltre lenfositleri tümör ilerlemesi ve hasta sonuç oynadığı aktif rolü üzerinde duruluyor. Bu hedefe doğru, biz onların yerli devlet onları yakın değerlendirmek için bir çaba, normal ve anormal dokuların sağlam lenfoid hücrelerin hızlı izolasyonu için bir metodoloji geliştirdi. Yüzey reseptörü ifadesi karşılaştırıldığında için enzim-sindirilmiş dokuları koruyarak mekanik ayıracı gösterisi hem artan canlılık ve hücre kurtarma kullanılarak hazırlanan Homojenatlar. Ayrıca, kalan çözünmeyen malzemenin enzimatik sindirim birincil homojenatında nicel ve nitel ölçümler olasılıkla gerçekten doku fragmanının içinde infiltre subpopülasyonunun yansıttığını belirten ek CD45 + hücreler geri vermedient. Bu homojenatlarında lenfoid hücreleri kolayca immünolojik (fenotip, proliferasyon, vs.) ya da moleküler (DNA, RNA ve / veya proteini) ile karakterize edilen yaklaşmaktadır. CD45 + hücreleri, alt popülasyonu saflaştırma in vitro genişlemesi veya iyileştirilmesi için de kullanılabilir. Bu yaklaşımın bir başka faydası da homojenatlarında birincil doku süpernatan normal ve habis dokular sitokinleri, kemokinleri immünoglobinlerin ve bu antijenleri karakterize etmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir olmasıdır. Bu protokol, son derece düzgün şekilde insan meme dokularında ve normal ve anormal doku çeşitli için geçerli olmalıdır.
Protocol
NOT: Tüm örnekler, her hastadan alınan yazılı bilgilendirilmiş onayı ile Enstitü Jules Bordet Tıp Etiği Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kullanılarak elde edildi.
Doku homojenatı hazırlanması 1.
- Rezeke dokular (ameliyathane gelen rezeke malign ve normal doku) teşrih hemen pikap için eğitilmiş personel tarafından patoloji laboratuarında vardır. Tümör, NANT (mümkün olduğunca tümör uzak mesafe alınmıştır) ve normal doku parçaları rutin 1 içinde işlenir - insan dokularında için standart biyogüvenlik prosedürleri kullanarak BSL2 laboratuarda cerrahi eksizyon 3 saat. Protokolün bir akış şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
- Tüm doku parçaları (normal NANT ve tümör) tartılır ve uzunluk, genişlik ve yükseklik (uzunluk x genişlik x yükseklik) ölçer. Bu hücre alt sonraki normalizasyonu için önemli bir adım, ekstre RNA, vb olduğunu
HAYIRTE: örneklem büyüklüğü aralığı hiç yağ mümkünse 100 10.000 mm 3. - Doku aslında tümör parçası olduğunu doğrulamak için, H & E boyama için bir cam slayt tümör fragmanı basar.
- Tümör fragmanı bir cam mikroskop lamı basarak ve bir kaç saniye için parmaklarınızla hafif baskı uygulayarak bunu yapın.
- Su içinde bir yıkama aşaması takip 2 dakika boyunca, izopropanol ile slayt sabitleyin. Mayer'in hematoksilen ile 30 saniye boyunca doku Counterstain.
- Su altı banyolarında slayt yıkayın. 15 sn için floksin B% 2 Leke.
- Suyun bir banyo ile izopropanol ve bitiş dört banyoları ve ardından bir su banyosu içinde yıkayın.
- 1 dakika ve drenaj için izopropanol içinde inkübe edin. Ksilen iki hamam Temizle.
- Ksilen bazlı montaj orta ile monte edin. Tümör selülarite (Şekil 2) için inceleyin.
NOT: - stromal, lenfoid veya reklam Temelde, tümör hücrelerinin baskılı slayt sopaipose hücreler nadiren tümör hücreleri arasındaki boşlukların (Şekil 2) kalır.
- Steril kullanılarak - kimyasal olarak tanımlanmış, serumsuz hematopoietik hücre ortamının 1 ml içeren küçük bir kültür kabı içinde doku parçasını yerleştirin küçük parçalar (2 mm 2 ~ 1) içine, oda sıcaklığında, (bundan sonra ortam olarak anılacaktır) ve zar Neşter.
- Mekanik ayıracı C tüpüne (doku parçaları + orta) her şeyi aktarın.
- Pasteur pipeti kullanarak ortam 2 ml petri kabı ve bir neşter durulayın ve C boru (ayrışması için ortamının hacmi = 3 mi) bunu ekleyin.
- Tek bir hücre süspansiyonu içine doku parçaları homojenize C tüpler için mekanik ayıracı programı A.01 (en nazik programı) kullanın. (Bir döngü = 25 sn) aparat C tüpü yerleştirin ve arka arkaya iki kez programı çalıştırın.
NOT: Bu homojenizasyon işlemi kurulmuş ve insan meme dokusu, diğer tum için valide edilmiştirda doku tipleri farklı bir program kullanmanız gerekebilir ilk test edilmelidir. - Aparat C tüpünü çıkarın ve bir 50 ml tüp üzerinde oturan 40 mikron hücre süzgecinden doğrudan Homojenat süzün. Adım 1.6 aynı Pasteur pipet kullanarak, hücre süzgecinden C tüp içinde kalan herhangi bir sıvı transferi.
- 1 ml mikropipet ucu kullanılarak 15 ml tüp içine süzülmüş sıvı aktarın. Geçici hücre süzgeç ve 50 ml'lik tüp tutmak.
- Ortamın, fazladan bir 3 ml Cı tüp yıkayın ve daha da iyisi 50 mi tübünün üzerine yerleştirilmiş hücre süzgecinden için, Aşama 1.6 ile aynı Pasteur pipeti kullanarak, bu aktarın. Yavaşça sonradan eluatının kirletmesini önlemek için atılır temiz Pasteur pipet veya 1 ml ucu ile süzgeç etrafında hareket ettirerek 50 ml tüp içine unhomogenized dokuda sıkışıp kalan sıvı maksimum miktarda sıkın.
- Ters t hücre süzgeç yerleştirino orijinal C boru ve unhomogenized doku geri C tüpüne düşer ve böylece orta 3 ml ile yıkayın.
- A.01 program iki döngü Aşama 1.7'de olduğu gibi yeniden homojen hale getirilir.
- 50 ml tüp üzerinde oturan hücre süzgecinden bu ikinci homojenatın dökün, (adım 1.10 gibi) 3 ml ortam ile tekrar C tüp durulayın ve tekrar maksimum sıkma 50 ml tüp oturan hücre süzgecinden Pasteur pipeti ile aktarmak hücre süzgecinden tutulan kalıntı bağ dokusu sıvı miktarı.
- Bu noktada, ~ 2.5 ml'lik bir hacim 15 ml tüp içinde ve ~ 50 ml tüp içinde 9 mi.
Doku yüzer madde ve Hücreler 2. Ayırma
- Oda sıcaklığında 600 x g'de 15 dakika boyunca 15 ml homojenatları ve 50 ml tüpler santrifüjleyin.
- Temiz bir tüp içine, 15 ml tüp SN süzün ve geçici olarak 4 ° C'de muhafaza edin. Bu yüzer = primer tümör, NANT veya normal tissue SN (nihai hacim 2.5 mi) daha sonra açıklık ve gelecekteki analizleri (aşağıya bakınız), -80 ° C'de saklama öncesi örnek olarak alındı.
- 50 ml tüpten atın.
- Yavaşça 1 ml ortam içinde nihai hacimde iki hücre pelletleri yeniden süspanse edin. Kısaca, ilk yavaşça (sert bir yüzeye tüp dokunarak) her iki tüpler hücre pelet kırmak. Ortamının 500 ul, 50 ml gevşek hücre pelletini ve ikinci pelet tekrar süspansiyon 15 ml'lik bir tüpe, bu hücre süspansiyonu aktarın. Hücrelerin maksimum kurtarma için orta ikinci 500 ul kez bu adımı tekrarlayın.
- Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını ve: küçük bir tüp transfer hücre süspansiyonu, 10 ul, tripan mavisi 10 ul (1 seyreltme 1) ile karıştırın.
NOT: Bu noktada, hücre süspansiyonunun bir fraksiyonu, aynı zamanda, hücre boyutu, granüllü değerlendirmek için akış sitometrisi ile analiz edilebilir ve daha PREC için alt popülasyonu, belirteçlerin sınırlı sayıda arzu edildiği takdirdeönce kapsamlı analiz veya deneylere homojenatında göreceli hücre dağılımının imkb değerlendirmesi. Akışı ile tüm analizler sitometri alt popülasyonlar normalleşmesi için CD45 etiketleme dahil. - Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. tümör, NANT veya normal dokudan hücrelerin artık daha fazla arıtılmadan ya da analiz için hazırdır. Ameliyat ile aynı günde yapılan Bu ek adımlar en iyisidir.
Not: akış sitometrik analiz için derhal 1 saniye girdap hücre pelletine alyuvar lisiz tamponu 0.4 mi eklenmesi ve oda sıcaklığında 10 dakika, en az inkübe edilerek Antikor etiketleme işleminden sonra lize gereken Elde edilen kırmızı kan hücreleri sıralama baz istasyonu analizden önce sıcaklığı (ışıktan korumalı).
Doku süpernatan 3. Açıklama
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15,000 x g'de doku SN 1.5 ml tüpler santrifüjleyin.
- Dikkatle t kaldırmakO dokunmadan veya pelet bozmadan süpernatanlarına. Sayısı istenen alikotları hacmine bağlı olarak, temiz bir tüpe (veya borular) aktarın.
- Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de süpernatan saklayın.
4. Hasta Kan
- Heparinli tüplere Venipunktür tarafından kontrol ameliyattan önce günde her hastadan kan örneği toplayın. Plazma ve buffy coat elde etmek fren kapalı olan 20 ºC de 10 dakika boyunca 400 xg'de kan santrifüj.
- Plazma çıkarın ve 20 ° C'de 15 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile bir açıklık. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de kısım ve mağaza plazma. Orta buffy coat seyreltin
- Hemen analiz alt popülasyonu izole DNA / RNA / protein ekstraksiyonu veya dondurarak saklama önce, standart bir Ficoll-hipak gradyan santrifüjlemesi kullanılarak, tek çekirdekli hücreler ayırın.
5. Akış Sitometri
- Üretim göre etiket hücreleriışıksız bir ortamda 4 ° C 'de r' talimatları. Hücre pelletine hücre parçalama tamponu içinde 0.4 ml ilave etmek suretiyle Antikor etiketleme işleminden sonra, doku parçalarından hücre süspansiyonlarında Lyse kırmızı kan hücreleri.
- Vorteks hemen 1 saniye ve ışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 10 dakika, en az, inkübe edilir. Yıkamadan veri toplama için bir akış sitometresinde etiketli hücreler geçirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ticari olarak temin edilebilen doku ayrılma çözeltiler ya da kollajenaz çeşitli laboratuar karışımları DNase ve / veya hiyaluronidaz önleyicileri ya da doku parçalarının enzimatik sindirim, hücre yüzeyi üzerindeki reseptörler çeşitli bölmektedir. Ilk olarak göğüs tümörlerini nüfuz eden CD4 + T hücreleri üzerinde duruldu Çalışmalarımız, hızlı bir şekilde bağlı standart enzimatik sindirim protokolleri 4-8 kullanılarak yüzey CD4 reseptör ayrılması için önemli bir teknik sorun sunulmuştur. Bu yüksek lemfosit canlılığı (Şekil 3A) rağmen, I ve II 'nin tamamıyla hücre yüzeyinden CD4 kaldırıldı kolajenaz bulma veya DNase ve hiyaluronidaz inhibitörsüz kolajenaz enzimler çeşitli test edilmiştir. Aynı hastadan sindirilmemiş kan ve kemik iliği (göre sindirilmiş lenf düğümü ve tümör dokusunda saptanan düşük CD4 antikoru etiketi ile - (2 saat 1) CD4 ile orta düzeyde bir etki kısa bekletme süreleri kolajenaz IV gözlenmiştirŞekil 3B; biz sindirilmiş ve sindirilmemiş lenf düğümü ve tümör dokusu) karşılaştırmak için koyamadık aldığınız nedeniyle doku üzerinde sınırlamalar unutmayın. CD4 kaybı, sağlıklı donor kanından izole sindirilmemiş ve sindirildi, CD4 + T hücreleri karşılaştırılarak kolajenaz IV sindirim teknik yan ürün olarak teyit edildi (veriler gösterilmemiştir). Bu CD4 lo T hücreleri manyetik taneler kullanılarak kolajenaz IV Sindirilmiş doku fragmanları izole edilebilir olsa da, arındırılmış popülasyonları sık tümörün mikro-ortamı diğer hücrelerin kontaminasyon değişen miktarlarda içeren ve bu nedenle deneysel amaçlar için optimal olmuştur.
Daha iyi bir yaklaşım için sürekli arama, 2008 yılında biz enzimleri kullanmadan yeni bir mekanik aynştıncı test. Bu cihaz hızlı ve yüzey reseptör bütünlüğü ile meme dokusu homojenatları üretti 9 yapılmaktadır. Tümör hücre homojenatları Follo dot sitometrisi lekeleri Örnek akımepitel hücreleri (EpCAM) ve lökositlerin (CD45) karşı özel antikorlar ile kanat ayırma ve etiketleme Şekil 3C'de gösterilmiştir. Bu görüntüler meme tümörü homojenatları için tipik rutin gözlemler. Bu protokol, önemli ölçüde CD45 + hücreler (% 4 ölü hücreler) canlılığını değiştirmez; (gösterilmemiş olan tümör% 38 ölü hücreler, tümörler arasında değişir), ancak uygun EpCAM + hücrelerinin önemli bir kaybı vardır. Bu azalmaya rağmen, uygulanabilir EpCAM + ve CD45 + alt büyük epitel hücreleri (tümör hücreleri), küçük epitel hücreleri ve büyük CD45 + hücreler ve küçük CD45 + hücrelerinin (hücrelerin çoğunluğunda içine boyutu ve yapısı temelinde ayrılmış olabilir başta lenfositler hangisinin Şekil 3C).
Bu yaklaşımı kullanarak elde edilen canlı CD45 + hücrelerinde önemli artış tekrarlanabilir çok renkli elde edilmesi ile (verilere akış sitometrisi izinen fazla on renkler) daha tam meme kanserinde Til alt kümelerini karakterize etmek. Büyük TIL alt kümelerinin nokta sitometrisi lekeleri Örnek akış son deneylerde standart T ve için hücre içi boyama dahil olmak üzere tümör 10-12 infiltre küçük T ve B hücreleri, alt kümeleri tespit etmek ve ölçmek için de mümkün olduğunu gösteren, Şekil 4'te gösterilmiştir B hücre transkripsiyon faktörleri 12. Lenfositler için Yolluk stratejileri canlılığı leke ile özdeşleşmiş canlı CD45 + hücreler dayanmaktadır (not:. Tümörler büyük ölçüde hücresel enkaz ve M.Ö. alt tipi, sınıf, vb bağlı olarak ölü epitel hücrelerinin miktarında değişebilir). Bu yaklaşım, mikrodiziler veya QRT-PCR 9 kullanarak gen ekspresyon analizi için sıralama manyetik boncuklar veya hücre ile homojenattan lenfosit alt-popülasyonunu saflaştırılması için kullanılmıştır. Sitokinler ve immünoglobulinler dahil SN, Çözünür arabulucular, bir bead- kullanılarak sayısal edilmiştir Doku fragmanının boyutuna normalize elde edilen verilerle göre immüno. Sitokin ifadesi (bir Th1 / Th2 / TH7 / Th9 / Th17 havuz) ya da normal göğüs dokusundan SN BC SN toplam immünoglobulinler (IgA, IgE, IgG ve IgM) karşılaştırılması tümör dokusu ile bağlantılı hem de artış ortaya koymaktadır (Şekil 5). Bu birincil doku SN da etkili antijenler 10-12 için analiz edilmiş ve deneysel olarak ve böylece normal hücrelerde 9 TIL fenotipi üreten, sağlıklı vericilerden lenfositleri tedavi etmek için kullanılmıştır.
Şekil 1. Protokol akış şeması. Taze insan doku ve daha sonra insan dokuları infiltre lenfositleri değerlendirmek için kullanılabilecek bazı analitik yaklaşımlar işlemek için bizim prosedür gösterilmektedir.
Şekil 2. H & E göğüs tümör dokusu künye imajını lekeli. Taze meme tümör dokusu fragmanı alınan bu künye, transfer değil alanları yansıtan açık alanlarda tümör hücrelerinin varlığını gösterir. büyük halini görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın.
. Lenfosit analizi için meme dokusu ayrışma Şekil 3. Optimizasyonu Akış sitometrik analizi: sindirilmemiş ve kollajenaz I / II lenfositler (A) CD4 yüzey ifade tümör dokusu sindirilmiş; (B) lenf nodu ve tümör dokusu sindirilmiş zekâ gelen lenfositler CD4 ifadesiAynı hastanın sindirilmemiş kan ve kemik iliği hücrelerine kıyasla h Kolajenaz IV ve; toplam lökositlerin (CD45 +) ve tümör dokusundan epitel hücreleri (EpCAM +) ve (C) analiz hızlı mekanik protokol burada açıklanan kullanılarak ayrıştırıldı. epitel hücreleri ve bizim protokolünü kullanarak CD45 + hücrelerin canlılığı düzeltilebilir canlılığı boya katılması yoluyla değerlendirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil homojenatında lenfosit alt grupları infiltre 4. Tümör. Çok renkli akım sitometri analizi burada açıklanan protokol kullanılarak mekanik ayrışma sonra ameliyat günü gerçekleştirildi. canlı hücreler ve büyük lenfosit alt popülasyonlar birgösterilen re: CD3 bir tava T hücre belirteci, CD4 ve CD8 büyük T hücre alt belirteçleri ve CD19 pan B hücre belirtecidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Üstte kalan sıvı kısımdaki Şekil 5. eriyebilir aracılar. Sitokinlerin bir panel (Th1 / Th2 / TH7 / Th9 / Th17) ve immünoglobülinler (IgA, IgE, IgG ve IgM) SN normal ve BC elde analiz Boncuk esaslı immün kullanılarak değerlendirildi Burada anlatılan protokolünü kullanarak dokular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, daha sonra hücre sıralama, ekstraksiyon, dondurarak saklama ve / veya CD45 + altgrupları fenotipik analizi için enzimatik sindirme, normal ve habis meme doku homojenatlarında hızlı hazırlanması için iyileştirilmiş bir yöntem tarif etmektedir. Bu deneysel yaklaşımın amacı yakından in vivo durumunu yansıtır ve ameliyathane taze dokuların az manipülasyon ile normal dokulara bunları karşılaştırmak TIL görüntüleri üretmektir. Bugüne kadar, bizim laboratuvar> 250 taze M.Ö. dokuları (tümör ve NANT),> meme azalışlar 35 normal meme dokuları analiz etmek için bu protokolü kullandı. Prensip olarak, bu protokol, diğer tümör veya doku tiplerine doğrudan uygulanabilir olmalıdır; Bununla birlikte, bazı optimizasyon gerekli olabilir (yani, mekanik bir ayırma programı döngü sayısı, ortam hacmi, vs.). Necess olabilir büyük bir doku parçası kullanılarak düşük lenfosit infiltrasyonu ile dokularda içinlenfosit sayısı düşük, normal dokular için ne olduğunu li. Seçenek olarak ise, bir yoğunluk gradyan santrifüjleme aşaması lökosit süspansiyonunun zenginleştirilmesi için ilave edilebilir. Meme tümörleri infiltre insan T ve B hücre alt Bu analiz flow sitometri> 100 belirteçlerin bir değerlendirmesini içerir ve belirli lenfosit saflaştırılması (74 belirteçleri için veri akış sitometri ek Gu-Trantien verilerine ark. 9 mevcuttur) sonraki immünolojik ve moleküler analizler için subpopülasyonunun. Ayrıca, primer tümör SN sitokinler, kemokinleri immunglobülinler ve tümör antijenleri değerlendirdik tümör mikroçevresinin bu moleküler aracıların bir yansıması olarak 10,11 (NANT ve normal doku SN kıyasla). Bu aynı zamanda tümör SN sağlıklı vericilerden alman periferal kan lemfositlerinin tedavisi ve TIL saptanan gen sentezleme pek çok değişikliği, özellikle yeniden göstermiştir etkisini test ettik <sup> 9.
Bunların mikro tümör ve stromal hücreler daha sıkı karakteristik göçmen olan bağışıklık hücreleri, daha doku matriksinin tutulur. Burada tarif edilen yöntem, izole edilmesi ve enzimatik sindirme olmadan TIL analiz etmek için basit ve hızlı bir yol temin etmektedir. Bizim sayısız girişimleri başarısız olmuştur, aynı tümör fragmanından canlı ve reseptör pozitif lenfoid ve epitel hücreleri üretmek için kısa bir enzimatik sindirim ile bu mekanik homojenizasyon yaklaşımı katılmak için. Doku homojenleştirme etkili bir lenfositleri serbest ancak tümör hücre canlılığı önemli bir kayıp ile sonuçlanır. Doku kısa bir enzimatik sindirim, yaşayan tümör hücrelerinin (sindirim, zamanın bir fonksiyonu olarak toplam sayısı arttıkça) açığa çıkarır, ancak lenfositler üzerinde, özellikle belirgin bir çok yüzey reseptörleri, ekspresyonunda paralel bir azalma sonucuna sahiptir. Böylece, aynı tum tümör hücreleri ve TIL karşılaştırmalı analizi içinya da ayrı ayrı, iki ardışık tümör fragmanları işlemek için hala gereklidir.
Şu anda, TIL karakterize için tasarlanmış çalışmaların çoğunluğu sıklıkla mekanik diseksiyon 4-8 çeşit ile birleştiğinde enzimatik sindirim (O / N saat) kullanmışlardır. Daha fazla analiz ve tedavisi için TIL Genişleme genellikle (günler, haftalar) TIL veya uyarıcı maddeler ile tümör doku parçalarının sonraki ex vivo ekimi 13-15 içerir. Burada tarif edilen doku ayrılması için hızlı, enzimatik olmayan bir yöntem öncesinde genişleme ya da analiz için normal ve anormal doku fragmanları bozulmamış CD45 + hücreleri ayıklamak için basit ve tekrarlanabilir bir araç temin etmektedir. Tümörektomi geçiren hastaların CD45 + hücrelerinin bu hızlı alım muhtemelen prognostik biyomarker tahlilinde kullanım için geliştirilebilir. Buna ek olarak, bu ex vivo artışı için daha büyük bir potansiyel ile TIL verebilir immunothe EVLAT EDİNEN öncetedavisi stratejilerine yönelmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Hibe tarafından desteklenen bu çalışma Bilimsel Araştırma (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Belçika Planı Kanser, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson ve Fonds Barsy Belçika Fonu verdiğinde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
- Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
- Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
- Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
- Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
- Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).
