Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52397
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

Introduction

Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende primaire kwaadaardige hersentumor en is altijd fataal. Chirurgische resectie gekoppeld aan aspecifieke zorgstandaard chemotherapie en radiotherapie niet volledig te elimineren kwaadaardige cellen, resulterend in een sombere prognose van minder dan 15 maanden bij patiënten met deze ziekte 1. Daarentegen immunotherapie biedt een nauwkeurige benadering specifiek richten op tumorcellen, en heeft dus de potentie om te dienen als een zeer effectieve behandeling platform met verminderd risico van toxiciteit zekerheden 2-4. T-cellen ontwikkeld ex vivo te uiten chimeer antigen receptoren (auto's) bieden een veelzijdige strategie voor tumor immunotherapie. Auto's worden gegenereerd door het fuseren van het extracellulaire variabele gebied van een antilichaam met één of meer intracellulaire T-cel signalerende moleculen (s), in plaats van een full-length major histocompatibility complex (MHC) -beperkte T-cel receptor 5. Deze wijze van antilichaam-achtige antigeen erkennOp maakt reactieve antigen-specifieke T-cellen te herkennen en tumorantigenen in afwezigheid van MHC en kan worden aangepast voor een virtueel oneindig antigeen repertoire.

CAR T-cellen gemanipuleerd tegen diverse tumor antigenen aangetoond preklinische werkzaamheid en uitstekende belofte in de kliniek 6-9. Met name in de context van GBM, auto T cel targeting epidermale groeifactorreceptor variant III (EGFRvIII), een tumor-specifieke mutatie expressie op het celoppervlak 10, bleek de overleving verlengen-glioom dragende muizen 11. Ondanks hun veelzijdigheid, maar de klinische voordelen van CAR adoptieve therapie is nog niet volledig gerealiseerd, mede als gevolg van tumor-geassocieerde immunosuppressie en het immuunsysteem belastingontduiking 12-16 evenals uitdagingen bij het ​​opzetten en onderhouden van antigeen-specifieke T-cellen in vivo. Gebruik te maken van standaard van zorg (SOC) met immunotherapie kan mogelijk overwinnen een aantal van deze limitaties, resulterend in verhoogde werkzaamheid in zowel de preklinische en klinische setting.

SOC voor post-resectie GBM bestaat uit een hoge dosis temozolomide (TMZ), een DNA-alkylerende stof 17, en het hele brein bestraling (WBI) 1. Deze behandelingen worden geacht om synergie met tumor vaccins via opregulatie van tumor MHC expressie 18-20 en het loskomen van antigenen door dode tumorcellen 17,19,21,22. Inderdaad, de toevoeging van TMZ 20,23 of 18,24 WBI leidt tot verhoogde antitumorale werkzaamheid van immuun gebaseerde behandelingen in de preklinische omgeving. Bovendien, net als vele niet-specifieke cytotoxische chemotherapeutica, TMZ bekend systemische lymfopenie 25,26, die kan worden benut als middel gastheer-conditioning voor adoptieve therapie platforms 27-29 veroorzaken. TMZ-gemedieerde lymphodepletion is aangetoond dat de frequentie en de functie van de antigeen-specifieke T-cellen verbeteren, wat leidt tot verhoogde werkzaamheid van een Adoptieve therapie platform tegen intracraniële tumoren 30. In de context van CAR therapie lymphodepletion fungeert als middel gastheer-conditioning zowel vermindering van het aantal endogene suppressor-T-cellen 31 en induceren homeostatische proliferatie 32 via verminderde concurrentie voor cytokinen 33, waardoor antitumoractiviteit 11,34 verbeteren. Gezien de synergetische relatie tussen GBM SOC en immunotherapie platforms evalueren adoptieve nieuwe therapieën en vaccins platforms in de context van SOC is essentieel voor het trekken van zinvolle conclusies inzake werkzaamheid.

In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het genereren en intraveneuze toediening van muizen EGFRvIII specifieke CAR T-cellen naast TMZ en WBI in muizen met EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren (zie Figuur 1 voor de behandeling tijdlijn). In het kort worden AUTO T-cellen gemaakt door retrovirale transductie. Menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen worden getransfecteerd met een DNA / lipide-complex (met de CAR vector en PCL-Eco plasmiden) virus, die vervolgens wordt gebruikt om geactiveerde muriene splenocyten die zijn geoogst en gekweekt in parallel transduceren produceren. Tijdens CAR generatie, zijn murine gastheren dragen EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren toegediend gefractioneerde hele brein röntgenbestraling en systemische TMZ behandeling bij doses vergelijkbaar klinische SOC. AUTO T-cellen worden vervolgens intraveneus te lymphodepleted gastheren geleverd.

De volgende procedure wordt beschreven in zeven afzonderlijke fasen: (1) Toediening van temozolomide tumordragende muizen, (2) Whole Brain Bestraling van tumordragende muizen, (3) transfectie (4) Splenectomie en T cel bereiding, (5 ) Transduction, (6) AUTO T-cel Cultuur en Harvest, en (7) AUTO T-cel toediening aan muizen met een tumor. Deze fasen bestaan ​​uit verschillende stappen die 6-7 dagen bestrijken en tegelijkertijd worden uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol is gebaseerd op experimentele ontwerp waarbij 10 muizen behandeld met 10 7 CAR T-cellen elk. Dit betekent dat 10 8 CAR T-cellen nodig zijn; de opbrengst moet worden overschat door 5 x 10 7 -1 x 10 8 om rekening te houden voor het verlies van de levensvatbaarheid. Het volgende protocol wordt geschaald tot ongeveer 200 x 10 6 cellen genereren. De cellen worden vervolgens intraveneus toegediend aan vrouwelijke C57BL / 6 muizen met 9 dagen vastgesteld syngene EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren, ontwikkeld uit de bestaande KR158B astrocytoma of B16 melanoma cellijnen. Gelijktijdig met CAR T cel generatie worden tumordragende muizen waaraan klinisch relevante doses lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) en WBI (16.5 Gy).

Muizen werden gehandhaafd en onder-pathogeen-vrije omstandigheden aan de Duke University Medical Center (DUMC) gefokt. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de protocollen van de Duke University Institution goedgekeurdal Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Toediening van Temozolomide to-muizen met een tumor

Dagen 0 tot 4:

  1. Bereken het totaal aantal muizen in te spuiten en vermenigvuldigen met 0,5 volume van TMZ oplossing nodig (bijvoorbeeld 30 muizen x 0,5 ml = 15 ml TMZ) bepalen en voeg 1,5 ml om deze hoeveelheid te verantwoorden overloop (16.5 ml TMZ ).
  2. Vermenigvuldig dit totaal volume van 3 mg / ml van het gewicht van gevriesdroogde TMZ benodigde bepalen (bijvoorbeeld 16.5 x 3 = 49.5 mg TMZ). Weeg deze in een 50 ml conische.
    LET OP: TMZ is giftig bij inademing, inslikken en contact met de ogen, huid en slijmvliezen. Overleggen met de veiligheid instelling beroeps- en / of milieu en gezondheid en wellness-afdeling voor aanbevelingen over het verminderen van het risico van blootstelling.
  3. Vermenigvuldig het totale volume met 0,15 om de hoeveelheid dimethylsulfoxide bepalen (DMSO) vereist (bijvoorbeeld 16.5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filter steriliseren dit volume DMSO (plus nog eens 2 ml te verantwoorden spill) door een 0,2 urn filter in een steriele buis. Voeg 2,475 ml steriel DMSO aan de TMZ poeder.
  4. Plaats de TMZ / DMSO oplossing in een bekerglas met water over een hete plaat bij 65 ° C gedurende 10-15 min. Zodra TMZ volledig is opgelost, moet de oplossing lichtgeel van kleur geworden; als de oplossing wordt roze, dan is de TMZ wordt afgebroken en een nieuwe oplossing moet worden bereid met een frisse veel TMZ.
  5. Bereken het juiste volume steriele zoutoplossing nodig door vermenigvuldiging 0.85 door het totale volume (0.85 x 16.5 ml = 14,025 ml zoutoplossing). Voeg 15 ml steriele zoutoplossing in een 50 ml conische. Terwijl TMZ oplossen in de DMSO, warmte zoutoplossing tot 65 ° C.
  6. Vortex de TMZ / DMSO-oplossing zodat de TMZ poeder volledig is opgelost en voeg langzaam opgewarmd fysiologische zoutoplossing om de TMZ / DMSO-oplossing.
  7. Direct na bereiding, volledig laden 15 x 1 ml tuberculine syringes met TMZ oplossing voor toediening tot 4 dagen gevestigde muizen met een tumor.
  8. Herhaal deze procedure op dagen 1 tot 4 voor een totaal van vijf TMZ besturen.

2. Whole Brain Bestraling van-muizen met een tumor

Dagen 2 tot 4:

  1. Schakel de X-ray bestraler en laat deze warm-up van de volledige spanning. Zorg ervoor dat de juiste filter is op zijn plaats en het invoeren van de juiste spanning en de huidige instellingen (Figuur 2A).
    OPMERKING: De dosimetrie van de bestraler moet vooraf worden vastgesteld op het juiste voltage instellingen en grid (Figuur 2A, B) te bepalen.
  2. Bereken de tijd die nodig is om te resulteren in 5,5 Gy röntgenstraling. Als bijvoorbeeld röntgenstralen worden geleverd met een snelheid van 2 Gy / min, vervolgens 2,75 min nodig om een ​​totaal van 5,5 Gy leveren. Voer de juiste tijdsduur.
    OPMERKING: Tabel 2 geeft de muis WBI doseert eennd hun klinische equivalenten mens. In het kader van hooggradig glioom, 60 Gy gefractioneerd WBI (2 Gy fracties, 5 dagen / week gedurende 6 weken) is de klinische kwaliteit van de zorg, en de muizen equivalente hier gebruikt wordt is 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Bereid een verse oplossing van ketamine / xylazine systemische verdoving door toevoeging van 2 ml ketamine en xylazine 1 ml tot 17 ml zoutoplossing zodat de eindoplossing 10 mg / ml ketamine en 1 mg / ml xylazine.
  4. Weeg muizen en beheren 10 pl ketamine / xylazine intraperitoneaal per gram lichaamsgewicht zodanig dat dieren krijgen een dosis ketamine 100 mg / kg en 10 mg / kg xylazine. Muizen moet volledig worden verdoofd en zichtbaar ademhaling binnen 2 min van ketamine / xylazine administratie.
  5. Om oogheelkundige vocht in verdoofd dieren te behouden, wrijf een kleine hoeveelheid van kunsttranen zalf op elk oog.
  6. Plaats verdoofde muizen op het net zodat koppen geplaatst in het gebied dat de hoogste X-ray in ontvangtintensiteit (Figuur 2B, C). Schild lichamen van de nek naar beneden met geschikte afmetingen lood slang aan systemische X-ray levering (figuur 2D) te blokkeren.
  7. Plaats gepositioneerd muizen onder de x-stralen zodat de laser duidt het middelpunt van de röntgenbundel is de coördinaat (0,0) op de grid. Begin X-ray levering.
  8. Als X-ray levering is voltooid, verwijdert dieren uit de bestraler en leg ze op een warme verwarming pad. Laat verdoofd dieren niet huis met dieren bij bewustzijn, totdat de dieren voldoende bewustzijn hebben herwonnen om borstbeen recumbence behouden. Zodra dieren borstbeen recumbence kan handhaven, plaats bewuste dieren terug in hun geschikte kooien.
  9. Herhaal deze procedure op dagen 3 en 4 voor een totaal van drie gefractioneerde doses straling.

3. Transfectie

Dag -1:

  1. Bereid D10 media door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum (FBS) tot 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  2. Bereid T cel media (TCM) door toevoeging van 5,5 ml L-Glutamine, 5,5 ml natrium pyruvaat, 5,5 ml niet-essentiële aminozuren, en 5,5 ml penicilline / streptomycine (pen / strep) tot 500 ml RPMI-1640 medium. Voeg vervolgens 550 pl 2-mercaptoethanol en 550 pl gentamicine. Tot slot, voeg 50 ml FBS.
  3. Oogst in vitro gekweekte HEK293T cellen en breng aan een concentratie van 7,5 x 10 6 cellen / ml in D10 media.
  4. Plaat 10 ml D10 medium en voeg 1 ml van HEK293T celsuspensie in elk van 16 x 10 cm poly-D-lysine (PDL) beklede platen.
  5. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2.

Dag 0:

  1. Vervang medium met 10 ml verse D10 tenminste 30 minuten voor het transfecteren van cellen.
  2. Bepaal de hoeveelheid plasmide, PCL-Eco vector en liposomaal transfectiereagens vereist voor transfectie door het totale aantal platen vermenigvuldigen + 1 (16 + 1 = 17) met 14,1 ugvector plasmide (14,1 x 17 = 239,7 g), 9,9 ug PCL-Eco vector (9,9 x 17 = 168.3 pg), en 60 pi liposomaal transfectiereagens (60 x 17 = 1020 pi). Alle reagentia moeten bij kamertemperatuur voor het bereiden van oplossingen.
  3. Label twee buizen A en B. In buis A, voeg 239,7 ug vector plasmide en 168,3 ug PCL-Eco vector tot (1,5 x 17) ML verlaagde serum gemodificeerd Eagle's medium (RS-MEM). In buis B, voeg 1020 ul liposomaal transfectiereagens naar (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Incubeer A en B afzonderlijk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Mix A en B samen zachtjes (vortex gedurende 1-2 seconden of invertsuiker meerdere malen) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur lipide / DNA complex.
  6. Voeg lipide / DNA-complex druppelsgewijs naar HEK293T cellen in 10 cm schotel.
  7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 6-8 uur of overnacht (niet meer dan 24 uur).
  8. Na 6-8 uur incubatie, vervangen medium met 12 ml vers TCM voor virale productie. Deze vergulde mediaworden gebruikt op dag 2 virale supernatant voor T-cel transductie.

4. Splenectomie en T Celbereiding

Dag 0:

  1. Giet 10 ml van TCM in een 50 ml conische en plaats op ijs milt collectie.
  2. Offer het juiste aantal dieren CO 2 stikken en secundaire onthoofding: Place dieren in een kooi ontvangende CO 2 bij een stroomsnelheid van 10-30% kooi / minuut, per American Veterinary Medical Association richtlijnen (niet meer dan 5 dieren worden tegelijkertijd opgeofferd) tot ademhaling eindigt en twee minuten daarna. Verwijder dieren uit de CO 2 kamer en onthoofden.
    OPMERKING: Een milt van een 6-12 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muis zal ongeveer 4,5-5 x 10 7 splenocyten opleveren. Hier vindt 4 milt worden geoogst voor ongeveer 200 x 10 6 cellen.
  3. Leg de muis zodanig dat de juiste zijde naar boven is gericht, enspuiten met 70% ethanol. Met de tang, pak een dunne huidplooi onder het linker ribbenkast en snijd een kleine incisie met de schaar. Trek de huid, voorzichtig pak een dunne plooi van het buikvlies met een tang, en snijd een kleine holte.
  4. De milt is een klein, langwerpig, donkerrood orgaan dat een afgeplatte boon lijkt; delicaat pak de milt met de tang en accijnzen door het wegsnijden van het omringende bindweefsel. Plaats de uitgesneden milten in de conische 10 ml TCM op ijs.
  5. Giet milten over een 70 urn maas zeef en splitsen door stampen met het stompe uiteinde van de binnenkant van een spuit 5 ml van een enkele celsuspensie te genereren. Er kunnen maximaal twee milt moeten worden uitgesplitst per zeef.
  6. Gebruik een kleine hoeveelheid TCM zorgvuldig wassen zeef volgende uitsplitsing voor resterende splenocyten verzamelen. Bundelen alle uitgesplitste milt in een eencellige suspensie. Breng uiteindelijke volume op 50 ml met TCM voor een wasbeurt van eend draaien bij 300 xg gedurende 10 min.
  7. Bereid een oplossing van 1x lysebuffer door toevoeging van 5 ml 10x lyseerbuffer tot 45 ml steriel water. Als rode bloedcellen, resuspendeer pellet in 5 ml van 1 x lysisbuffer per milt in 50 ml conische, goed mengen door voorzichtig pipetteren en neer te elimineren. Als meer dan 5 milt, gebruik maken van een 250 ml centrifugebuis. Plaats conische of centrifugebuis in een 37 ° C waterbad gedurende 5 min.
  8. Verwijder de lysis reactie van het waterbad en voeg TCM bij een 1: 1 verhouding met lysis buffer om de reactie te neutraliseren. Was door centrifugeren bij 300 g gedurende 10 min.
  9. Zuig supernatant en resuspendeer pellet volledig in TCM (2 ml / milt, 8 ml totaal 4 milten) door en neer te pipetteren.
  10. Tellen cellen door toevoeging van 10 ui celsuspensie 190 pi trypan blauw (1:20 verdunning). Vermenigvuldig het aantal in één van de vier gerasterde vierkanten verkregen door 20 x 10 x 4 totaal volume (8 ml) aan het totale aantal cellen te verkrijgen (bijvoorbeeld 125 cellen x 20 x 10 4 6 splenocyten).
  11. Verdun cellen tot een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml in TCM, gesupplementeerd met 2 ug / ml concanavaline A (ConA) en 50 IU / ml recombinant humaan interleukine-2 (rhIL-2). Aldus, 200 x 10 6 splenocyten, voeg 92 ml medium 8 ml cellen 200 ug ConA en 5000 IU rhIL-2.
  12. Voeg 2 ml cellen aan elk putje van 24-well weefselkweek behandelde platen, zodanig dat 4 x 10 6 cellen in elk putje (bijvoorbeeld 100 ml cellen ongeveer 4 platen nodig).
  13. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2.

5. Transduction

Dag 1:

  1. Bereken het aantal niet-weefselkweek behandelde platen met 24 putjes die nodig is voor transductie door het aantal milten geoogst 2 (8 platen nodig voor 4 milten) te vermenigvuldigen.
  2. Bereken vervolgens de vereiste hoeveelheid recombinant humaan fibronectine fragment (RHFF) oplossingmoest coat platen door vermenigvuldiging (totaal aantal putten + 3) x 0,5 ml (8 x 24 wells platen = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Bereid 97,5 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die RHFF in een concentratie van 25 ug / ml van het totale volume te vermenigvuldigen met 25 ug (97,5 x 25 = 2437,5 g). Voeg deze hoeveelheid RHFF tot 97,5 ml PBS.
  4. Coat niet met weefselkweek behandelde platen met 24 putjes door het toevoegen van 0,5 ml PBS / RHFF oplossing per put.
  5. Incubeer overnacht bij 4 ° C.

Dag 2:

  1. Dump PBS / RHFF oplossing van niet-weefselkweek behandelde platen met 24 putjes.
  2. Voeg 1 ml / putje 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  3. Verwijder BSA door stevig upending plaat. Was door toevoeging van 2 ml PBS.
  4. Verzamel viraal supernatant door de overdracht van de media uit elke HEK293T PDL plaat in een 250 ml centrifugebuis en spin 10 min bij 500 x g.
  5. Breng zorgvuldig virale supernatant in een frisse 250 ml centrifugebuis, het zijn zeker niet naar de cel pellet die zich kunnen gevormd verstoren.
  6. Voeg verse TCM aan de virale supernatant zodanig dat het uiteindelijke volume is 3 ml meer dan de hoeveelheid die nodig is voor RHFF-beklede putjes. Bijvoorbeeld, voor 192 RHFF beklede putjes, breng het volume van virale supernatant 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Verwijder gekweekte splenocyten uit de incubator en resuspendeer door voorzichtig pipetteren en neer 2-3 keer in elk putje. Over te dragen aan een 250 ml conische. Bij gebruik van een multichannel pipet, met behulp van een steriele reservoir vóór de overdracht zal helpen bespoedigen deze stap. Telling zoals eerder beschreven en rotatie bij 300 xg gedurende 10 min.
  8. Voeg rhIL-2 virale supernatant bij een concentratie van 50 IE / ml. Voeg bijvoorbeeld 50 x 195 = 9750 IU rhIL-2-195 ml viraal supernatant.
  9. Resuspendeer splenocyten virale supernatant bij 1 x 10 6 cellen / ml
  10. Voeg 1 ml / putje van splenocyten suspensie RHFF-beklede platen met 24 putjes.
  11. Spin voor 90 min op basis van de volgende instellingen: 770 xg, acceleratie = 4, rem / vertraging = 0, 32 ° C.
  12. Bereid een TCM oplossing met 50 IU / ml rhIL-2. Bijvoorbeeld, bereiden 200 TCM door toevoeging 10.000 IE rhIL-2. Voeg 1 ml rhIL-2 / TCM aan elk putje na centrifugeren.
  13. Kweek overnacht bij 37 ° C in 5% CO2.

6. AUTO T-cel Cultuur en Oogst

Dag 3 en 4:

  1. Als T-cellen te bereiken> 80% samenvloeiing, kunnen cellen worden gesplitst (dit gebeurt meestal op dag 3 of dag 4). Cellen splitsen voorzichtig pipetteren en neer in elk putje 2-3 keer, en beweeg 1 ml van elk putje naar nieuwe putjes van een verse 24-well weefselkweek behandelde plaat. Vervolgens voeg 1 ml vers TCM met 50 IU / ml IL-2 aan elk putje zodat uiteindelijk volume 2 ml in alle putjes.
  2. Als cellen niet> 80% samenvloeiing bereiken, het uitvoeren van een half media verandering door langzaam pipetteren off 1 ml van media vanaf de bovenkant van elk putje. Vermijd disturbing cellen vestigden zich op de bodem tijdens het verwijderen van de media. Voeg 1 ml vers TCM met 50 IE / ml rhIL-2.

Dag 5:

  1. Resuspendeer CAR T-cellen door voorzichtig pipetteren en neer 3 keer in elk putje overgebracht in een 250 ml centrifugebuis. Spin-cellen bij 300 xg gedurende 10 min.
  2. Volledig aspireren supernatans zonder verstoring van pellet. Eenmaal met PBS, tellen cellen zoals eerder beschreven, en wassen met PBS nogmaals. Een typische AUTO T-cel-opbrengst is ongeveer 1 x 10 6 cellen per putje (8 platen x 24 putten = 192 x 10 6 CAR T-cellen).
  3. Resuspendeer cellen in PBS bij een concentratie van 5 x 10 7 / ml voor een injectie van 1 x 10 7 in een volume van 200 pg (bijvoorbeeld voor 192 x 10 6 CAR T-cellen, resuspendeer pellet gewassen in 3,84 ml PBS).

7. AUTO T-cel Administratie-muizen met een tumor

Dag 5:

  1. Transport cellen op ijs dierenverblijf voor intraveneuze injectie. Load 500-1.000 ul in insuline spuit met 27-31 G naald, ervoor te zorgen dat alle luchtbellen worden uitgestoten.
  2. Pak een muis aan de basis van de staart en plaats in buis restrainer.
  3. Trek de staart strak met de ader naar boven en glijden de naald ongeveer 1-2 mm onder de huid in de ader door deze evenwijdig aan de staartader. Langzaam verdrijven 200 ul in de ader. Als de naald correct is geplaatst in de ader, zal het volume gemakkelijk stromen; anders zal er weerstand en de naald zal nodig hebben van de staart worden verwijderd en correct opnieuw geplaatst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AUTO T-cellen worden gegenereerd door transductie met de EGFRvIII CAR retrovirale vector 11. Deze vector, MSGV1, werd ontwikkeld op basis van de SFGtcLuc_ITE4 vector 35, waarin de muizen stamcellen virus (MSCV) lange terminale herhalingen, de uitgebreide gag regio en envelop splice site bevat (splitsingsdonor, sd, en splice acceptor, nv), en virale verpakkingssignaal (ψ). De EGFRvIII CAR die het humane anti-EGFRvIII variabel fragment enkele keten (scFv) 139, samen met murine CD8TM, CD28, 4-1BB, en CD3ζ intracellulaire gebieden, werd gekloneerd in de retrovirale vector stroomafwaarts van de NcoI-plaats (figuur 3) .

Na transductie, kan AUTO T-cellen worden gekwantificeerd en gefenotypeerd door flowcytometrie. EGFRvIII CAR T-cellen kunnen worden gevisualiseerd met een 2-kleuren panel bestaande uit een streptavidine-phycoerythrine (SA / PE) geconjugeerd biotynlated-EGFRvIII afgeleide multimeer en anti-CD3 FITC. Met behulp van de cultuur en transductie protocols beschreven hier, we regelmatig observeren CAR expressie tussen 55-70% van de muizen splenocyten (figuur 4A) 11. Alternatief kunnen auto ook gekleurd voor expressie met behulp van geit-anti-humaan F (ab ') 2-biotine primaire en SA / PE secundaire antilichamen die eerder beschreven 36. CAR T-cellen kunnen verder worden fenotype door toevoeging van andere fluorescent gelabelde antilichamen tegen de tweekleurige CAR paneel. Bijvoorbeeld, kleuring voor CD8 en CD4 blijkt dat 70% van getransduceerde wagens CD8 + T-cellen, terwijl 20% CD4 + T-cellen (Figuur 4B). CAR T-cellen met dit expressiepatroon is aangetoond gemakkelijk verkeer naar de hersenen en behandelen intracraniale tumoren.

Tabel 1:. Temozolomide dosis op basis diergewicht Temozolomide doses werden berekend op basis van een totale dosis van 60 mg / kg.

Lichaamsgewicht Volume
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0,46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0,42 ml
20 g 0.40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0.36 ml
17 g 0.34 ml
16 g 0.32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0,28 ml
13 g 0.26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0.22 ml
D d # Breuken BED SOC
16,5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52.5 LGA
12 3 4 30 Ontmoette
16 2 8 32 Ontmoette

Tabel 2:. Klinisch relevante biologisch equivalente stralingsdosis Radiation doses werden berekend volgens BED D = [1 + d / (α / β)], waarbij D = totale dosis, d = gefractioneerde dosis en α / β = 2). De totale toegediend als WBI de murine gastheer dosis wordt in termen van the fractionele doses geleverd en de dosis voor de mens die wordt gemodelleerd door deze dosis fracties. Voor model doeleinden, wordt de maligniteit waarvoor het bed is standaard van zorg ook getoond.

Figuur 1
Figuur 1:. Tijdlijn voor de behandeling van tumordragende muizen en gelijktijdige ex vivo generatie CAR Zorgnorm chemotherapie en bestraling van de gehele hersenen begint 4 dagen na tumor implantatie (A). Gedurende deze tijdsinterval, worden AUTO T-cellen geproduceerd en gekweekt ex vivo (B) en afgeleverd na een volledige verloop van de host-conditioning.

Figuur 2
Figuur 2: Lay-out en instellingen voor straling levering.X-stralen worden geleverd volgens een dosimetrie van 320 kV en 10 mA met een variabele tijdsduur volgens de gewenste dosis (A) gekozen. De focale gebied van röntgenstraling is een smal 2,5 cm gebied. Verdoofde dieren worden gerangschikt volgens het rooster (B) zodanig dat de kop in het gebied van hoogste röntgenintensiteit ligt; (C) toont het aanzicht van het ene uiteinde van de röntgenbundel. Ongeveer 4 dieren kunnen worden onder de bestraler tijdens een cursus van X-ray administratie volgens deze grid (B, D). Lood buis wordt gebruikt om het lichaam te beschermen, waardoor alleen het hoofd blootgesteld WBI (D).

Figuur 3
Figuur 3: Het gemodificeerde SFGtcLuc_ITE4 retrovirale vector, MSGV1, werd gebruikt voor transductie en genereren van CAR T-cellen The.EGFRvIII CAR insert met het humane anti-EGFRvIII variabel fragment van een enkele keten (scFv) 139, in tandem met muizen CD8TM, CD28, 4-1BB en CD3ζ intracellulaire regio's, wordt geflankeerd door muizen stamcellen virus (MSCV) long terminal repeats (LTR ). Stroomopwaarts van de CAR insert zijn de uitgebreide gag regio en envelop splicingplaats (splitsingsdonor, sd, en splice acceptor, nv), en de virale verpakkingssignaal (ψ).

Figuur 4
Figuur 4: EGFRvIII CAR uitgedrukt op het oppervlak van T-cellen 48 uur na transductie werden de T-cellen gekleurd voor oppervlakte-expressie van EGFRvIII auto's gebruiken multimeer uit LEEKKGNYVVTDHC-K (biotine) -NH2 / streptavidine-PE.. Getransduceerde T-cellen van dezelfde donor werden gekleurd als een negatieve controle. Gegevens blijkt het aantal auto-T-cellen (y-as) positief voor stazoekvan door de PE-geconjugeerde EGFRvIII multimeer (x-as), gated op CD3 + cellen als T-cel merker, waarbij de expressie bleek 60,9% (A) te zijn. CAR T-cellen gekleurd voor CD4-PerCP-Cy5.5 en CD8-APC tonen een expressieprofiel van 21.7% en 70.9%, respectievelijk (B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De behandeling tijdlijn hier beschreven is ontworpen voor het modelleren klinische kwaliteit van de zorg en het benutten ervan bij de CAR adoptieve therapie. CAR T cel doses TMZ regimes en radiotherapie toediening kan worden gemodificeerd ter verbetering van in vivo T-cel activiteit lymphodepletion en tumor doden. TMZ regimes kan worden verhoogd tot gastheer myeloablatie en verhoogde expansie van adoptief overgedragen cellen 30 verkregen. Bovendien kan de lymphodepletive effecten van TMZ worden geïncorporeerd door een lage dosis (4-6 Gy) single-fractie totale lichaamsbestraling (TBI), waardoor het omzeilen van de tumoricide eigenschappen van SOC. De straling regime hier toegepast bootst een biologisch equivalente dosis van 60 Gy; echter kan het aantal fracties en fractionele doses worden afgestemd andere klinische doses (Tabel 2) nabootsen. Belangrijker nog, ons model van SOC maakt gebruik van biologisch equivalente doses van WBI, in plaats van externe bestraling focaal geleverd aan de tumor en margins, zoals vaak gebruikt in de kliniek, en dus kan leiden tot een geringere dosis straling geleverd aan de tumor en een verhoogd risico van toxiciteit voor gezonde muizenhersenen. Ondanks deze beperkingen echter WBI is een aanvaarde methode voor het modelleren klinische radiotherapie in een preklinische omgeving.

AUTO T-cel doses kan worden verhoogd of verlaagd om de dosis effecten op de tumor te doden en de totale overleving 11 in acht te nemen. Bovendien kan de timing van de behandeling en route van bezorging worden aangepast om verschillen in werkzaamheid zien. Zo kan CAR T-cellen intracraniaal worden afgeleverd activiteit mogelijk op de tumorplaats. De opbrengst van CAR-positieve T-cellen kan variëren afhankelijk van de efficiëntie van transductie. Een manier om een ​​succesvolle transductie door het uitvoeren een groen fluorescerend eiwit (GFP) -Regeltechniek gehele procedure. Om dit te doen, kan 1 HEK293T 10 cm PDL plaat worden toegewezen voor GFP transfectie en transductie van een enkele bron van T-cellen te screen voor GFP op dagen 3-5. Een kritische factor bij transductie efficiëntie is de mate van T-cel activatie en proliferatie na toevoeging van viraal supernatant. We merken een belangrijke discrepantie tussen onze werkwijze van T-cel activatie, die wordt bereikt door toevoeging van ConA aan het kweekmedium en die in de klinische omgeving, bereikt door CD3 en CD28 agonistische monoklonale antilichamen. Hoewel deze wordt routinematig gebruikt voor het genereren patiënt retroviraal getransduceerde CAR T-cellen en is ook met succes in transductie van muizen T-cellen, we eerder vastgesteld dat ConA stimulatie leidde tot betere en consistentere transductie 37. We hebben ook vastgesteld dat de totale AUTO T-cel opbrengst kan variëren, afhankelijk van wanneer stap 5.18 wordt uitgevoerd. Als je slechte AUTO T-cel opbrengst raden we aan het uitvoeren van stap 5.18 onmiddellijk na stap 5.17 in plaats van te wachten op de 5-6 uur incubatie. Hoewel dit de efficiëntie van transductie van invloed kunnen zijn, hebben we aanzienlijke dif niet waargenomenschillen in CAR oppervlakte-expressie in onze studies.

Na transductie, kan AUTO T-cellen worden gekwantificeerd en gefenotypeerd door flowcytometrie; We vlek onze EGFRvIII CAR T-cellen met 2-kleuren panel bestaande uit een streptavidine-phycoerythrine (SA / PE) geconjugeerd biotynlated-EGFRvIII afgeleide multimeer en anti-CD3. Alternatief kunnen auto ook gekleurd voor expressie met behulp van geit-anti-humaan F (ab ') 2-biotine primaire en SA / PE secundaire antilichamen die eerder beschreven 36. We regelmatig observeren CAR expressie onder 55-70% van de muizen splenocyten 11. We hebben eerder aangetoond dat de levering van T-cellen met deze CAR expressieprofiel gemakkelijk verkeer naar de hersenen en behandelen tumoren. TMZ- of TBI geïnduceerde lymfopenie verbetert klonale expansie van adoptief overgedragen cellen, de frequentie van CAR-positieve cellen en hun algemene antitumor respons. CAR T-cellen kunnen in vivo worden gevolgd door kleuring perifeer bloed met eenppropriate tetramer; Dit is een nuttige techniek voor het begrijpen CAR T cel overleving in de tijd en de effecten van gastheer-conditioning op CAR T-celfunctie en persistentie. Alternatief, indien geen tetrameer is beschikbaar voor de antigeen receptor, een fluorescerende reporter kunnen in de CAR vector construct of CAR T-cellen kunnen worden gelabeld ex vivo met carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) voorafgaand aan toediening in vivo volgen.

Afhankelijk van de tumor model, immunotherapie platform, en SOC regime, kan klinische SOC naast adoptieve therapie of vaccins toegediend leiden tot toxiciteit. TMZ is een DNA-alkylerend middel dat leidt tot niet-specifieke celdoding en verhoogde doses kan leiden tot gewichtsverlies en morbiditeit in murine gastheren. Hoge doses en langdurig fracties van WBI kan leiden hydrocephalus. Verder kan inflammatoire effecten van de sterke vaccin en / of adoptief overgedragen T-cel responsen leiden tot morbiditeit als gevolg vantoxische cytokine storm. Het is ook belangrijk om de effecten van systemische verdoving morbide dieren mee. Als TMZ en WBI leiden tot significante toxiciteit, dan ketamine / xylazine doses kan worden verminderd met 20-25% om het risico van mortaliteit, zoals dieren alleen nodig verdoofd en geïmmobiliseerd gedurende 10 min voor afgifte van kleine stralingsdoses (2- 8 Gy).

Host-conditioning is van cruciaal belang voor alle immunotherapie platforms die adoptieve overdracht bevatten. Zoals immunotherapie proeven vaak geëvalueerd in de context van SOC dient preklinische evaluatie van immuuntherapie gebeuren binnen deze instelling de klinische scenario recapituleren. Wij presenteren hier een voorbeeld van gebruik te maken van de lymphodepletive en tumoricide effecten van SOC met adoptieve therapie met behulp van CAR-T-cellen. Dit schema is een krachtig instrument dat kan worden toegepast op andere immunotherapie platforms om de effecten van gecombineerde SOC evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

Tags

Cancer Biology Tumor immunotherapie glioblastoom chimeer antigeen receptor adoptieve overdracht temozolomide radiotherapie
Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Riccione, K., Suryadevara, C. M.,… More

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter