Introduction
Глиобластома (GBM) является наиболее распространенной первичной злокачественной опухоли головного мозга и приводит к летальному исходу. Хирургическая резекция в сочетании с неспецифической стандарт медицинской помощи химиотерапии и лучевой терапии не удается полностью устранить злокачественные клетки, в результате чего плохим прогнозом менее 15 месяцев у пациентов с этим заболеванием 1. В отличие от этого, иммунотерапия предлагает точный подход специально для ориентации опухолевые клетки, и, таким образом, имеет потенциал, чтобы служить в качестве весьма эффективного лечения платформе с уменьшенным риском побочного токсичности 2-4. Т-клетки инженерии экс естественных условиях, чтобы выразить химерных рецепторов антигена (автомобили) предлагают универсальный стратегии иммунотерапии опухолей. ЦАР формируются путем слияния внеклеточный вариабельный участок антитела с сигнальной молекулы одного или более внутриклеточный Т-клеток (ов), вместо полноразмерного главного комплекса гистосовместимости (MHC) -ограниченных Т-клеточный рецептор 5. Этот режим антитело-антиген, как ждут победитна позволяет реактивные антиген-специфические Т-клетки, чтобы распознавать и реагировать на опухолевых антигенов в отсутствие МНС и может быть адаптирована для практически бесконечного антигена репертуара.
CAR Т-клетки инженерии против различных опухолевых антигенов показали доклинические эффективность и высокую обещание в клинике 6-9. В частности, в контексте GBM, ориентации АВТОМОБИЛЯ Т платформа клеток рецептор эпидермального фактора роста вариант III (EGFRvIII), мутация опухоли конкретных экспрессируется на клеточной поверхности 10, как было показано, продлить выживание в глиомы мышей, несущих 11. Несмотря на универсальность, однако, клиническая польза CAR приемной терапии не были полностью реализованы, отчасти из-за опухоли связано иммуносупрессии и иммунной уклонения 12-16, а также проблемы в установлении и поддержании антиген-специфические Т-клетки в живом организме. Используя стандарт медицинской помощи (SoC) с иммунотерапии потенциально может преодолеть некоторые из этих лимитации, приводит к повышению эффективности в обоих доклинических и клинических условиях.
SOC для Пострезекционные GBM состоит из высоких доз темозоломида (ТМЗ), ДНК алкилирующим агентом 17, и облучения всего головного мозга (ИВБ) 1. Эти процедуры, как предполагается, быть согласованы с противоопухолевых вакцин с помощью повышающей регуляции опухолевого МНС выражения 18-20 и пролития антигенов мертвых опухолевых клеток 17,19,21,22. Действительно, добавление ТМЗ 20,23 или 18,24 ИВБ приводит к повышенной противоопухолевой эффективности иммунных основе процедуры в доклинических настройки. Кроме того, как много неспецифических цитотоксических химиотерапевтических, ТМЗ, как известно, вызывают системное лимфопения 25,26, которые могут быть использованы в качестве средства принимающей кондиционирования для приемных платформ терапии 27-29. ТМЗ-опосредованной lymphodepletion было показано, что повышение частоты и функцию антиген-специфических Т-клеток, что приводит к увеличению эффективности в adopный платформа терапия против внутричерепных опухолей 30. В контексте CAR терапии, lymphodepletion служит в качестве средства для кондиционирования принимающей стороны и уменьшения количества эндогенного супрессоров Т-клеток 31 и индуцирующий пролиферацию гомеостатической 32 с помощью пониженном конкуренции за цитокинов 33, таким образом, повышение противоопухолевой активностью 11,34. Учитывая синергетический отношения между GBM ШОС и иммунотерапии платформ, оценивая новые приемных терапии и платформы вакцины в контексте ШОС имеет решающее значение для привлечения значимых выводов относительно эффективности.
В этом протоколе мы опишем метод генерации и внутривенного введения мышиных EGFRvIII-конкретного автомобиля Т-клеток наряду с TMZ и ИВБ в мышей, несущих EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей (рис 1 для лечения сроки). Вкратце, CAR Т-клетки сделаны экс естественных условиях на ретровируса трансдукции. Человек эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки трансфицируют с использованием ДНК / липидный комплекс (содержащий вектор машину и PCL-Eco плазмиды), чтобы получить вирус, который затем используется для трансдукции активированных мышиных спленоцитов, которые собирали и культивировали в параллель. В ходе поколение автомобиля, мышиные хозяева, несущие EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей вводят фракционированного всего головного мозга рентгеновского излучения и системное лечение ТМЗ в дозах, сопоставимых с клинической SOC. CAR Т-клетки затем доставляются внутривенно lymphodepleted хозяев.
Следующая процедура описана в семи отдельных фаз: (1) Администрация Темозоламид для мышей с опухолями, (2) весь мозг Облучение опухоли мышей (3) трансфекции, (4) спленэктомия и Т-клеток Подготовка, (5 ) трансдукция, (6) Культура CAR Т-клеток и урожай, и (7) управление CAR Т-клеток в опухоли мышей. Эти фазы состоят из нескольких этапов, которые охватывают 6-7 дней и выполняются одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол основан на экспериментальной конструкции, где 10 мышей обрабатывают 10 7 CAR Т-клеток в каждой. Это означает, что 10 8 АВТОМОБИЛЯ Т-клетки будут необходимы; выход должен быть завышены 5 х 10 7 -1 × 10 8 для учета потери жизнеспособности. Следующий протокол масштабируется для получения примерно 200 х 10 6 клеток. Затем клетки вводили внутривенно женского C57BL / 6 мышей с 9-й день, установленных сингенных EGFRvIII-положительных внутричерепными опухолями, разработаны на основе существующих KR158B астроцитомы или В16 линий клеток меланомы. Одновременно с автомобилем Т поколения клеток, опухоль мышей вводят клинически значимых доз lymphodepletive ТМЗ (60 мг / кг) и Институтом Всемирного банка (16,5 Гр).
Мыши были сохранены и выращивают в свободных от патогенов условиях в Университете Дьюка Медицинского центра (DUMC). Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными Университета Дьюка институтааль Уход за животными и использование комитета (IACUC).
1. Администрация Темозоламид для мышей с опухолями
Дни от 0 до 4:
- Рассчитать общее количество мышей, который будет введен и умножить это на 0,5, чтобы определить объем ТМЗ решения, необходимого (например, 30 мышей х 0,5 мл = 15 мл ТМЗ) и добавить 1,5 мл до этого объема для учета перетекания (16,5 мл TMZ ).
- Умножьте это общий объем на 3 мг / мл для определения веса лиофилизированного TMZ необходимости (например, 16,5 х 3 = 49.5 мг ТМЗ). Взвешивание это в 50 мл коническую.
ВНИМАНИЕ: ТМЗ является токсичным при вдыхании, попадании внутрь и контакте с глазами, кожей и слизистой оболочки. Проконсультируйтесь с охраны труда учреждения и / или окружающей среде, здоровья и благополучия отдела рекомендаций по снижению риска заражения. - Умножьте общий объем на 0,15, чтобы определить объем диметилсульфоксида (ДМСО), которые необходимы (например, 16,5 х0,15 = 2,475 мл ДМСО). Фильтр стерилизовать такой объем ДМСО (плюс дополнительные 2 мл для учета трансмиссионные) через 0,2 мкм фильтр в стерильную пробирку. Добавить 2,475 мл стерильной ДМСО к порошку ТМЗ.
- Поместите раствор ТМЗ / ДМСО в химический стакан с водой над горячей плите при 65 ° С в течение 10-15 мин. После того, как ТМЗ полного растворения, раствор должен стать бледно-желтого цвета; Если раствор становится розовым, то ТМЗ ухудшается, и новое решение должно быть подготовлено со свежим много TMZ.
- Рассчитать соответствующий объем стерильного физиологического раствора, необходимого путем умножения 0,85 от общего объема (0,85 х 16,5 мл = 14,025 мл физиологического раствора). Добавить 15 мл стерильного физиологического раствора к 50 мл коническую. В то время как ТМЗ растворяется в ДМСО, тепла солевым раствором до 65 ° С.
- Вихревой / ДМСО раствора ТМЗ, чтобы гарантировать, что порошок ТМЗ полного растворения и медленно добавляют подогретое физиологический раствор в / ДМСО раствора ТМЗ.
- Сразу же после приготовления, полностью загрузить 15 х 1 мл туберкулина SyringES ТМЗ решения для введения 4 дня, установленного с опухолью мышей.
- Повторите эту процедуру в дни с 1 по 4 на общую сумму пять ТМЗ администраций.
2. весь мозг Облучение опухоли мышей
Дни со 2 по 4:
- Включите рентгеновского излучателя и дайте ему прогреться до полного напряжения. Убедитесь, что соответствующий фильтр на месте и ввода нужного напряжения и текущих настроек (Рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: дозиметрии облучателя должны быть установлены заранее определить соответствующие параметры напряжения и сетка макета (2А, Б). - Рассчитать продолжительность времени, которое необходимо, чтобы привести в 5,5 Гр рентгеновского облучения. Например, если Х-лучи доставляются в размере 2 Гр / мин, затем 2,75 мин необходимо доставить в общей сложности 5,5 Гр. Вход необходимости длительность.
ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 2 приведены мыши ИВБ дозыой их клинические эквиваленты в организме человека. В контексте высококачественных глиомы, 60 Гр фракционированию WBI (2 Гр фракции, 5 дней / неделю в течение 6 недель) является клинический стандарт медицинской помощи, и мышиный эквивалент, используемый здесь, 16,5 Гр (5,5 Гр х 3). - Подготовка свежий раствор кетамина / ксилазина для системного анестезии путем добавления 2 мл кетамина и 1 мл ксилазина к 17 мл физиологического раствора таким образом, что конечный раствор 10 мг / мл кетамина и 1 мг / мл ксилазина.
- Взвешивание мышей и управлять 10 мкл кетамина / ксилазина внутрибрюшинно на грамм веса тела таким образом, что животные получали дозу кетамина в дозе 100 мг / кг и 10 мг / кг ксилазина. Мыши должны быть полностью в отключке и заметно дыхание в течение 2 мин кетамина администрации / ксилазина.
- Для поддержания глазной влаги в седативных животных, мягко втирать небольшое количество искусственных слез мази на каждый глаз.
- Поместите седации мышей на сетке, так что головки позиционируются в области, которая получает наибольшее рентгеновского излучения винтенсивность (фиг.2В, С). Щит органы от шеи вниз с соответствующим размером ведущую трубу, чтобы заблокировать системную доставку X-лучей (рис 2D).
- Поместите расположенные мышей под рентгеновского луча таким образом, что лазерный обозначающий фокус на рентгеновского пучка в начале координат (0,0) на макет сетки. Начните доставку X-Ray.
- При подаче Рентгеновский удалим животных от облучателя и место на теплую грелку. Не дом седации животных с сознательными животных, пока животные не восстановили достаточно сознания, чтобы сохранить грудины отдохновение. После того, как животные могут поддерживать грудины отдохновение, место сознательные животных обратно в их соответствующих клетках.
- Повторите эту процедуру на 3 и 4 на общую сумму три фракционированных доз радиации.
3. Трансфекция
День -1:
- Подготовка D10 носитель путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 500 мл Дульбекко Мodified Eagle Medium (DMEM).
- Подготовка Т-клеток носитель (TCM), добавляя 5,5 мл L-глутамина, 5,5 мл пируват натрия, 5,5 мл несущественные аминокислоты и 5,5 мл pencillin / стрептомицин (ручка / стрептококк) с 500 мл среды RPMI-1640. Затем добавьте 550 мкл 2-меркаптоэтанола и 550 мкл гентамицина. И, наконец, добавляют 50 мл FBS.
- Урожай в пробирке, культивируемые клетки HEK293T и довести до концентрации 7,5 х 10 6 клеток / мл в D10 СМИ.
- Пластина 10 мл D10 медиа и добавьте 1 мл суспензии HEK293T клеток в каждом из 16 х 10 см поли-D-лизина (PDL) Плиты покрытием.
- Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% СО 2.
День 0:
- Замените носитель с 10 мл свежего D10, по крайней мере 30 минут до трансфекции клеток.
- Определить количество векторной плазмиды, PCL-Eco вектор, липосомной трансфекции реагента, необходимого для трансфекции путем умножения общего количества пластин + 1 (16 + 1 = 17) 14,1 мкгплазмидный вектор (14,1 х 17 = 239,7 мкг), 9,9 мкг PCL-Eco вектор (9,9 х 17 = 168,3 мкг) и 60 мкл липосомальной трансфекции реагента (60 х 17 = 1020 мкл). Все реагенты должны быть комнатной температуры перед приготовлением растворов.
- Этикетка две трубки А и В. В трубе А, добавьте 239,7 мкг векторной плазмиды и 168,3 мкг PCL-Eco вектора (1,5 х 17) мл, с пониженным содержанием сыворотки модифицированной среде орла (RS-MEM). В трубе Б, добавить 1020 мкл липосомальной трансфекции реагента (1,5 х 17) мл RS-MEM.
- Инкубируйте А и В по отдельности в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Смешайте А и В вместе аккуратно (вихрь в течение 1-2 сек или инвертировать несколько раз) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре с образованием липидов / комплекса ДНК.
- Добавить липид / ДНК падение сложную стрелке, чтобы HEK293T клеток в 10 см блюдо.
- Выдержите при 37 ° С в течение 6-8 ч или на ночь (не более 24 ч).
- После 6-8 часов инкубации, заменить среду с 12 мл свежего TCM для вирусного производства. Это покрыло СМИбудет использоваться на 2-й день, как вирусный супернатант для Т-клеток трансдукции.
4. спленэктомия и Т клеточный препарат
День 0:
- Налейте 10 мл TCM в коническую 50 мл и место на льду для сбора селезенки.
- Жертвоприношение соответствующее количество животных СО 2 удушья и среднего обезглавливания: Место животных в клетке принимающей CO 2 при расходе 10-30% клетки объем / мин, в руководящих Американская ветеринарная медицинская ассоциация (не более 5 животных не может быть не приносится в жертву одновременно) до тех пор, дыхания прекращается и в течение двух минут после этого. Удалить животных из CO 2 камеры и обезглавить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один селезенка 6-12 недельных самок C57BL / 6 мыши получается примерно 4,5-5 х 10 7 спленоцитов. Здесь четыре селезенки будет собрано около 200 × 10 6 клеток. - Положите мышь так, чтобы его правая сторона обращена вверх, испрей с 70% этанола. С помощью пинцета, возьмите тонкую складку кожи под левой грудной клетки и вырезать небольшой разрез с помощью ножниц. Отогните кожи, тщательно захватить тонкую складку брюшины щипцами, и вырезать небольшое углубление.
- Селезенка небольшой, удлиненные, темно-красный орган, который напоминает сплюснутый боб; деликатно захватить селезенки с пинцетом и акциза путем срезания окружающую соединительную ткань. Поместите вырезали селезенки в коническую, содержащей 10 мл TCM на льду.
- Налейте селезенки более сито сетка клетки 70 мкм с разбивкой по признаку пюре с тупым концом внутренней 5 мл шприц, чтобы создать один-клеточной суспензии. Не более двух селезенки должны быть разбиты на сито петли.
- Используйте небольшой объем TCM тщательно мыть сито следующий разбивку собрать все оставшиеся спленоцитов. Бассейн все разукрупненные селезенки в одной клеточной суспензии. Доведите конечного объема до 50 мл на один TCM стирки сбы вращаться на 300 мкг в течение 10 мин.
- Приготовьте раствор 1x буфера для лизиса путем добавления 5 мл буфера для лизиса 10x в 45 мл стерильной воды. Для устранения красных кровяных клеток, ресуспендируют осадок в 5 мл 1x буфера для лизиса в селезенке в 50 мл конические, хорошо перемешивая, осторожно пипеткой вверх и вниз. Если более 5 раздражительность, используйте 250 мл центрифужную пробирку. Поместите коническую центрифужную пробирку или в C водяной бане 37 ° С в течение 5 мин.
- Удалить реакцию лизиса из водяной бани и добавить TCM в соотношении 1: 1 с буфером для лизиса для нейтрализации реакции. Вымойте спиннинг в 300 мкг в течение 10 мин.
- Отберите супернатант и полностью ресуспендируют осадок в традиционной китайской медицине (2 мл / селезенка, 8 мл Всего за 4 селезенки) с помощью пипетки вверх и вниз.
- Количество клеток путем добавления 10 мкл клеточной суспензии в 190 мкл трипанового синего (1:20 разбавление). Умножьте полученную в одном из четырех сетчатых квадратов 20 х 10 4 х общего объема (8 мл) номер, чтобы получить общее количество клеток (например, 125 клеток х 20 х 10 4 6 спленоцитов).
- Развести клетки в концентрации 2 × 10 6 клеток / мл в TCM, с добавлением 2 мкг / мл конканавалин (ConA) и 50 МЕ / мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (чрИЛ-2). Таким образом, для 200 х 10 6 спленоцитов, добавить 92 мл средства массовой информации в 8 мл клеток, 200 мкг coña и 5000 МЕ рИЛ-2.
- Добавить 2 мл клеток в каждую лунку 24-луночных тканевых культур, обработанных пластин, таким образом, что 4 × 10 6 клетки в каждой лунке (например, 100 мл клеток потребуется примерно 4 пластины).
- Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% СО 2.
5. Трансдукция
День 1:
- Рассчитать количество не тканевой культуры рассматриваются 24-луночных планшетах, необходимые для трансдукции путем умножения количества селезенки собирали 2 (8 пластин, необходимых для 4 селезенки).
- Затем вычислите необходимый объем рекомбинантный фрагмент человеческого фибронектина решения (RHFF)необходим для покрытия пластин путем умножения (общее количество скважин + 3) х 0,5 мл (8 пластин х 24 скважины = 192 + 3 = 195) х 0,5 мл = 97,5 мл.
- Подготовьте 97,5 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащего RHFF в концентрации 25 мкг / мл путем умножения суммарного объема на 25 мкг (97,5 х 25 = 2437,5 мкг). Добавить такое количество RHFF 97,5 мл PBS.
- Шерсть без тканевой культуры обрабатывают 24-луночных планшетах путем добавления 0,5 мл PBS / RHFF решение на лунку.
- Инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
День 2:
- Кузов раствор PBS / RHFF от не-культуре ткани обрабатывают 24-луночных планшетах.
- Добавить 1 мл / лунку 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалить BSA, крепко переворачивая плиту. Промыть добавлением 2 мл PBS.
- Сбор вируса супернатант перенос носитель из каждого HEK293T PDL пластины в 250 мл центрифужную пробирку и спин 10 мин при 500 х г.
- Тщательно передачи вируса SUpernatant в свежем 250 мл центрифужную пробирку, будучи уверенным, чтобы не нарушить клеточный осадок, которые могли образоваться.
- Добавить свежий TCM к вирусным супернатантом, так что конечный объем 3 мл больше, чем количество, необходимое для RHFF покрытием скважин. Например, для 192 скважин RHFF покрытием, довести объем вирусного супернатанта с 192 мл + 3 = 195 мл.
- Удалить культивируемые спленоциты из инкубатора и ресуспендируют, осторожно пипеткой вверх и вниз 2 - 3 раза в каждую лунку. Переход к 250 мл конической. При использовании многоканальной пипетки, используя стерильный резервуар перед передачей поможет ускорить этот шаг. Граф, как описано выше, и спина при 300 мкг в течение 10 мин.
- Добавить чрИЛ-2 вирусной супернатанта при концентрации 50 МЕ / мл. Например, добавьте 50 х 195 = 9750 МЕ чрИЛ-2 до 195 мл вирусной супернатант.
- Ресуспендируют спленоцитов вирусной супернатанта на 1 х 10 6 клеток / мл
- Добавить 1 мл / лунку спленоцитов суспензии RHFF покрытием 24-луночных планшетах.
- Спин в течение 90 мин в соответствии со следующими настройками: 770 мкг, ускорение = 4, тормоз / торможение = 0, 32 ° C.
- Подготовьте TCM решение с 50 МЕ / рИЛ-2 мл. Например, приготовить раствор 200 TCM добавлением 10000 МЕ чрИЛ-2. Добавить 1 мл рИЛ-2 / TCM в каждую лунку после центрифугирования.
- Культура в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2.
6. CAR Т-клеток Культура и урожай
Дни 3 и 4:
- Если Т-клетки достичь> 80% слияния, клетки могут быть разделены (обычно это происходит в день 3 или 4 день). Чтобы разделить клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз в каждой лунке 2-3 раза, а двигаться 1 мл из каждой лунки в новые лунки свежего 24-луночного культурального-обработанной пластины. Затем добавляют 1 мл свежей TCM 50 МЕ / мл IL-2 в каждую лунку так, чтобы конечный объем составляет 2 мл во всех скважинах.
- Если клетки не достигают> 80% слияния, выполнить половину изменение медиа медленно пипетки с 1 мл среды из каждой лунки. Избегайте Disturbing клетки оседали на дно, удаляя СМИ. Добавить 1 мл свежей TCM, содержащей 50 МЕ / мл чрИЛ-2.
День 5:
- Ресуспендируйте CAR Т-клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз 3 раза в каждую лунку и перенести в 250 мл центрифужную пробирку. Спин клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
- Полностью аспирация супернатант, не нарушая гранул. Промывают один раз PBS, рассчитывать клеток, как описано ранее, и промывали PBS во второй раз. Типичный выход CAR Т-клеток составляет примерно 1 × 10 6 клеток на лунку (8 пластин х 24 скважин = 192 х 10 6 CAR Т-клетки).
- Ресуспендируют клеток в PBS в концентрации 5 х 10 7 / мл для инъекции 1 × 10 7 в объеме 200 мкг (например, для 192 × 10 6 CAR Т-клеток, ресуспендируют осадок промывали в 3,84 мл PBS).
7. CAR T Администрация ячейка мышей с опухолями
День 5:
- TranspoRT клетки на льду за животными для внутривенных инъекций. Добавить 500-1000 мкл в инсулиновый шприц с 27 - 31 г иглы, гарантируя, что все пузырьки исключен.
- Возьмите мыши в основание хвоста и разместить в трубе фиксатор.
- Потяните хвост в натянутом состоянии, с вены обращена вверх, и скользить иглу примерно 1-2 мм под кожу в вену, вставив его параллельно в хвостовую вену. Медленно высылать 200 мкл в вену. Если игла вставлена правильно в вену, объем будет легко течь в; в противном случае будет сопротивление и игла должны быть удалены из хвоста и вновь установлена правильно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CAR Т-клетки генерируются трансдукции ретровируса вектора EGFRvIII CAR 11. Этот вектор, MSGV1, был разработан на основе SFGtcLuc_ITE4 вектора 35, который содержит вирус мышиного стволовых клеток (MSCV) длинные концевые повторы, расширенный кляп область и конверт сайта сплайсинга (разъем доноров, SD, и сплайс-акцептор, SA) и вирусной сигнал упаковки (ψ). EGFRvIII АВТОМОБИЛЯ, содержащее человеческого анти-EGFRvIII вариабельный фрагмент одной цепи (ScFv) 139, в тандеме с мышиным CD8TM, CD28, 4-1BB и CD3ζ внутриклеточные участки, клонировали в ретровирусный вектор нисходящего сайта NcoI (фиг.3) ,
После трансдукции, CAR Т-клетки могут быть определены количественно, и phenotyped с помощью проточной цитометрии. EGFRvIII АВТОМОБИЛЯ Т-клетки могут быть визуализированы с 2-цветовой панели, состоящей из стрептавидин-фикоэритрин (SA / ПЭ) -conjugated biotynlated EGFRvIII полученных мультимер и анти-CD3 FITC. Использование культуры и трансдукции протocols описано здесь, мы обычно наблюдаем выражение автомобилем среди 55-70% мышиных спленоцитов (рис 4а) 11. В качестве альтернативы, автомобили могут быть также окрашивали дл экспрессии с помощью козьего-анти-человеческий F (аb ') 2-биотин первичной и SA / PE вторичные антитела, которые было описано ранее 36. CAR Т-клетки могут быть дополнительно phenotyped добавлением других флуоресцентно меченных антител к двухцветного CAR панели. Например, окрашивание CD8 и CD4 показывает, что 70% трансдуцированных ЦА являются CD8 + Т-клетки, в то время как 20% являются CD4 + Т-клетки (фиг.4В). CAR Т-клетки с таким профилем экспрессии, как было показано, чтобы легко трафика в мозг и лечить внутричерепные опухоли.
Вес тела | Объем | |||
25 г | 0,50 мл | |||
0,48 мл | ||||
23 г | 0,46 мл | |||
22 г | 0,44 мл | |||
21 г | 0,42 мл | |||
20 г | 0,40 мл | |||
19 г | 0,38 мл | |||
18 г | 0,36 мл | |||
17 г | 0,34 мл | |||
16 г | 0,32 мл | |||
15 г | 0,30 мл | |||
14 г | 0,28 мл | |||
13 г | 0,26 мл | |||
12 г | 0,24 мл | |||
11 г | 0,22 мл |
D | d | # Фракции | КРОВАТЬ | SOC |
16,5 | 5,5 | 3 | 62 | GBM |
14 | 7 | 2 | 63 | GBM |
20 | 4 | 5 | 60 | GBM |
12 | 6 | 2 | 48 | LGA|
16 | 4 | 4 | 48 | LGA |
21 | 3 | 7 | 52,5 | LGA |
12 | 3 | 4 | 30 | Встретил |
16 | 2 | 8 | 32 | Встретил |
Таблица 2:. Клинически значимые биологически эквивалентные дозы облучения Дозы облучения были рассчитаны в соответствии с кроватью = D [1+ d / (α / β)], где D = общая доза, d = фракционированного дозы и α / β = 2). Общая доза вводится в ИВБ с мышиным хоста показана в плане ме дробные дозы доставленные и человеческая доза, которая моделируется этих фракций дозы. Для целей модели, злокачественные опухоли, для которых кровать стандарт медицинской помощи также показано на рисунке.
Рисунок 1:. Срок лечения мышей, несущих опухоль и одновременно экс естественных поколение автомобиля стандарт медицинской помощи химиотерапии и облучения всего головного мозга начинается через 4 дня после имплантации опухоли (А). В течение этого интервала времени, CAR Т-клетки генерируются и культивировали экс виво (б) и поставляется после полного курса принимающей кондиционирования.
Рисунок 2: Схема и параметры доставки излучения.Рентгеновские лучи доставляются в соответствии с дозиметрии 320 кВ и 10 мА, с переменной длительности выбранной в соответствии с желаемой дозы (А). Фокусное поле рентгеновского излучения узкой 2,5 см площадь. Седативные животных расположены в соответствии с сеткой (В) таким образом, что их головы лежат в области наивысшей интенсивности рентгеновского; (С) показан вид с одного конца пучка рентгеновского излучения. Около 4 животные могут находиться под облучателя в течение одного курса рентгеновского управления в соответствии с этой раскладки сетки (B, D). Ведущий трубки используется, чтобы оградить тело, оставляя только головы выставлены на ИВБ (D).
Рисунок 3: модифицированный SFGtcLuc_ITE4 ретровирусный вектор, MSGV1, был использован для преобразования и генерации CAR Т-клеток.EGFRvIII CAR вставку, содержащую человеческого анти-EGFRvIII вариабельного фрагмента одного цепи (ScFv) 139, в тандеме с мышиным CD8TM, CD28, 4-1BB и CD3ζ внутриклеточных регионах, в окружении мышиного вируса стволовых клеток (MSCV) длинные концевые повторы (LTR ). Выше по течению CAR вставки являются протяженной области кляп и конверт сайта сплайсинга (разъем доноров, SD, и сплайс-акцептор, SA), а вирусный сигнал упаковки (ψ).
Рисунок 4: EGFRvIII ЦАР выражены на поверхности Т-клеток через 48 часов следующих трансдукции, Т-клетки окрашивали для поверхностной экспрессии EGFRvIII машины, при мультимер, состоящий из LEEKKGNYVVTDHC-K (биотин) -NH 2 / стрептавидин-PE.. Untransduced Т-клетки от того же донора, также окрашивали в качестве отрицательного контроля. Данные показывают, числа дорожно-транспортных Т-клеток (Y-ось), позитивных по ГНАining по PE-конъюгированного EGFRvIII мультимера (ось х), закрытого на CD3 + клеток в Т-клеток маркера, где выражение было найдено, что 60,9% (А). CAR Т-клетки окрашивали на CD4-PerCP-Cy5.5 и CD8-APC показывают профиль экспрессии 21,7% и 70,9%, соответственно (В).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лечение график описано здесь был разработан, чтобы моделировать клинический стандарт медицинской помощи и использовать его последствий для автомобиля приемной терапии. CAR Т-клеток дозы, ТМЗ схемы, и администрация лучевая терапия могут быть изменены для повышения в естественных условиях Т активности клеток, lymphodepletion и опухоли убийства. ТМЗ схемы может быть увеличена, чтобы получить хост myeloablation и повышенную расширение адаптивно переданных элементов 30. Кроме того, lymphodepletive эффекты ТМЗ может быть обобщены низкой дозы (4 - 6 Гр) с одним фракция общего облучения тела (TBI), таким образом обходя уничтожающие опухоли, свойства соц. Режим излучения применяется здесь имитирует биологически эквивалентной дозы 60 Гр; Однако, количество фракций и дробных доз могут быть настроены, чтобы имитировать другие клинические дозы (таблица 2). Важно отметить, что наша модель SOC использует биологически эквивалентные дозы Институтом Всемирного банка, а не дистанционная лучевая доставлен централизовано к опухоли и техниrgins, как это часто используется в клинике, и, таким образом, может привести к меньшей дозы радиации подаваемого в опухоли и повышенным риском токсичности до здорового мозга мыши. Несмотря на эти ограничения, однако, ИВБ принятой методике для моделирования клинической лучевой терапии в доклинических условиях.
CAR Т-клеток дозы могут быть увеличены или уменьшены, чтобы наблюдать эффекты, доза на убийство опухоли и общей выживаемости 11. Кроме того, сроки обработки и маршрута доставки можно модифицировать, чтобы увидеть различий в эффективности. Например, CAR Т-клетки могут быть доставлены интракраниально, чтобы обеспечить активность в месте опухоли. Выход автомобиля-положительных Т-клеток может варьироваться в зависимости от эффективности трансдукции. Один из способов обеспечения успешного трансдукции путем проведения зеленый флуоресцентный белок (GFP) -Контроль на протяжении всей процедуры. Чтобы сделать это, один HEK293T 10 см PDL пластина может быть выделено GFP трансфекции и трансдукции одной скважины Т-клеток в осыпип для GFP в дни 3-5. Одним из важных факторов эффективности трансдукции является степень активации Т-клеток и пролиферации при добавлении супернатанта вируса. Отметим важную расхождение между нашего метода активации Т-клеток, что достигается за счет добавления ConA к культуральной среде, и которые используются в клинической практике, достигнутый CD3 и CD28 моноклональных антител агонистов. Хотя последняя обычно используется для генерации пациентов антиретровирусные трансдуцировали CAR Т-клеток и также успешно в передаче мышиных Т-клеток, ранее мы определили, что Кон стимуляция приводила к улучшению и более последовательных трансдукции 37. Мы также отметили, что в целом CAR T выход клеток может изменяться в зависимости от того, когда шаг 5,18 выполняется. При плохом выход CAR Т-клеток, мы рекомендуем шаг 5,18 выполнении сразу же после стадии 5,17 вместо того, чтобы ждать 5-6 ч инкубации. Хотя это может повлиять на эффективность трансдукции, мы не наблюдали значительное DIFконференциях в поверхностной экспрессии автомобиль в наших исследованиях.
После трансдукции, CAR Т-клетки могут быть определены количественно, и phenotyped с помощью проточной цитометрии; Мы окрасить наши EGFRvIII АВТОМОБИЛЯ Т-клеток с 2-цветовой панели, состоящей из стрептавидин-фикоэритрин (SA / ПЭ) -conjugated biotynlated EGFRvIII полученных мультимер и анти-CD3. В качестве альтернативы, автомобили могут быть также окрашивали дл экспрессии с помощью козьего-анти-человеческий F (аb ') 2-биотин первичной и SA / PE вторичные антитела, которые было описано ранее 36. Мы регулярно наблюдать выражение автомобиль среди 55-70% мышиных спленоцитов 11. Ранее мы показали, что доставку Т-клеток с этим профилем экспрессии автомобиль может легко трафика в мозг и лечения опухолей. TMZ- или TBI-индуцированной лимфопения повышает клональной экспансии восприимчиво переданных клеток, увеличивает частоту CAR-позитивных клеток и их общего противоопухолевый ответ. CAR Т-клетки могут быть отслежены в естественных условиях путем окрашивания периферической крови с аppropriate Тетрамер; это полезная техника для понимания ав выживаемость клеток с течением времени и воздействия принимающей кондиционирования на функции клеток CAR T и настойчивости. С другой стороны, если ни один тетрамер не доступен для рецептора антигена, флуоресцентные репортер может быть включен в машину векторной конструкции, или автомобиль Т-клетки могут быть помечены экс виво с карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира (CFSE) перед введением для отслеживания в естественных условиях.
В зависимости от модели опухоли, иммунотерапия платформы, и SOC режима, клиническая SOC вводить вместе с приемной терапии или вакцин может привести к токсичности. ТМЗ является ДНК алкилирующий агент, что приводит к неспецифической клеточной гибели, и усиление дозы могут привести к потере веса и заболеваемости в мышиных хостов. Высокие дозы и длительные фракции Институтом Всемирного банка может привести к гидроцефалии. Кроме того, воспалительные эффекты от сильного вакцины и / или адаптивно перенесенных Т-клеточных ответов может привести к заболеваемости в связи стоксичные цитокинов бури. Важно также отметить, эффекты анестезии на системную болезненных животных. Если ТМЗ и ИВБ привести к значительным токсичности, то кетамин / Ксилазин дозы могут быть уменьшены на 20-25% снизить риск смертности, как животные должны быть только в отключке и иммобилизованных в течение 10 мин для доставки малых доз радиации (2- 8 Гр).
Хост кондиционирования имеет решающее значение для всех иммунотерапии платформ, которые включают в себя приемные передачу. Как иммунотерапия исследования часто интерпретируются в контексте ШОС, доклинические оценка иммунотерапии должно быть сделано в течение этого параметра резюмировать клинического сценария. Мы приведем здесь один пример усиливая lymphodepletive и уничтожающие опухоли, последствия SOC с приемными терапии с использованием CAR Т-клеток. Этот режим является мощным инструментом, который может быть применен к другим платформам иммунотерапии оценить влияние комбинированной SOC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
Gentamicin (50 mg/ml) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
Pharm Lyse (10x concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
70 μm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/ml |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
- Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
- Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
- Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
- Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
- Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
- Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
- Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
- Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
- Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
- Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
- Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
- Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
- Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
- Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
- Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
- Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
- Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
- Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
- Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
- Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
- Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
- Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
- Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
- Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
- Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
- Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
- Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
- Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
- Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
- Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
- Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
- Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).