Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52397
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

Introduction

Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno primário mais comum e é invariavelmente fatal. A ressecção cirúrgica associada com o padrão não específico de quimioterapia e radioterapia cuidado para não eliminar completamente as células malignas, resultando em um mau prognóstico de menos de 15 meses, em pacientes com esta doença 1. Em contraste, a imunoterapia oferece uma abordagem precisa para visar especificamente células tumorais, e portanto tem o potencial de servir como uma plataforma de tratamento altamente eficaz, com um risco reduzido de toxicidade colateral 2-4. As células T engenharia ex vivo para expressar receptores de antigénios quiméricos (CARs) oferecem uma estratégia versátil para imunoterapia de tumor. CARs são gerados por fusão da região variável extracelular de um anticorpo com uma ou mais das células T intracelular molécula (s) de sinalização, em vez de um de histocompatibilidade principal de comprimento completo complexo (MHC) -restricted receptor de células T 5. Este modo de anticorpo-like reconhecimen antígenosobre permite células específicas para o antigénio T reactivas para reconhecer e responder aos antigénios tumorais na ausência de MHC e podem ser adaptados para um repertório antigénio praticamente infinito.

CARRO células T modificadas contra uma variedade de antigénios de tumor demonstraram eficácia pré-clínica e excelente na promessa clínica 6-9. Especificamente, no contexto de GBM, uma variante de t CARRO plataforma de direccionamento celular de crescimento epidermal do receptor do factor III (EGFRvIII), uma mutação específica do tumor expressos na superfície da célula 10, foi mostrado prolongar a sobrevivência de ratinhos portadores de glioma 11. Apesar de sua versatilidade, no entanto, o benefício clínico da terapia adoptiva CAR ainda não foi plenamente realizado, em parte devido à imunossupressão associada ao tumor e evasão imune 12-16, bem como desafios na criação e manutenção de células T específicas de antigénio in vivo. Aproveitando padrão de atendimento (SOC) com a imunoterapia pode potencialmente superar vários destes limitações, resultando num aumento da eficácia tanto na configuração de pré-clínica e clínica.

SOC para pós-ressecção GBM consiste de temozolomida em altas doses (TMZ), um agente de alquilação de ADN 17, e a irradiação do cérebro inteiro (WBI) 1. Presume-se que estes tratamentos a sinergia com vacinas tumorais via regulação positiva de tumor MHC expressão 18-20 eo derramamento de antígenos pelas células tumorais mortas 17,19,21,22. Com efeito, a adição de TMZ 20,23 ou 18,24 WBI leva ao aumento da eficácia antitumoral de tratamentos de base imunológica na configuração pré-clínico. Além disso, como muitos quimioterápicos citotóxicos não específicos, TMZ é conhecido por causar 25,26 lymphopenia sistêmica, que pode ser aproveitado como um meio de host-condicionado para as plataformas de terapia adotivos 27-29. Lymphodepletion TMZ mediada tem demonstrado aumentar a frequência e função de células T específicas de antigénio, que conduz a um aumento da eficácia de um adopplataforma terapia tiva contra tumores intracranianos 30. No contexto da terapia de CAR, lymphodepletion serve como um meio de acolhimento-condicionado tanto pela redução do número de células T supressoras endógenas 31, e induzindo a proliferação homeostática 32 através de competição reduzida para citocinas 33, aumentando assim a actividade anti-tumoral 11,34. Dada a relação sinérgica entre SOC e imunoterapia plataformas GBM, avaliando terapias adotivos novos e plataformas de vacina no contexto do SOC é fundamental para tirar conclusões significativas a respeito da eficácia.

Neste protocolo, que descrevem um método para a geração e administração intravenosa de células de murino CAR T específicas para EGFRvIII ao lado TMZ e WBI em camundongos com tumores intracranianos EGFRvIII-positivos (veja a Figura 1 para a linha do tempo de tratamento). Resumidamente, as células T são feitos CAR ex vivo por transdução retroviral. Rim embrionário humano (HEK) 293T células são transfectadas utilizando um complexo de ADN / lípido (contendo o vector CAR e plasmídeos pCL-Eco) para produzir vírus, que é então utilizado para transduzir os esplenócitos de murideo activadas que são colhidas e cultivadas em paralelo. Durante o curso da geração CAR, hospedeiros murinos com tumores intracranianos EGFRvIII-positivos são administrados fraccionado em todo o cérebro de irradiação de raios X e TMZ tratamento sistémico com doses comparáveis ​​às SOC clínica. Células carro T são então entregues por via intravenosa aos anfitriões lymphodepleted.

O procedimento que se segue é descrita em sete fases distintas: (1) administração de temozolomida para (3) Transfecção Ratos, (2) Irradiação Cérebro Total de Ratos portadores de tumor, que possui o tumor, (4) e esplenectomia Preparação de células T, (5 ) Transdução, (6) Cultura de células T CAR e colheita, e (7) a administração de células T CAR para portadores de tumor Ratos. Estas fases consistem em várias etapas que se estendem por 6-7 dias e são realizadas simultaneamente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Este protocolo é baseado em um projeto experimental, onde 10 ratos são tratados com 10 células 7 carro T cada. Isto significa que serão necessários 10 8 células CAR T; o rendimento deve ser superestimada por 5 x 10 7 -1 x 10 8 a conta para a perda da viabilidade. O protocolo seguinte é dimensionado para gerar cerca de 200 x 10 6 células. As células são então administrada intravenosamente a fêmea C57BL / 6 com 9 dias estabelecidos os tumores intracranianos EGFRvIII-positivo singeneicos, desenvolvidos a partir das linhas celulares de melanoma B16 ou de astrocitoma KR158B existentes. Concomitante com a geração de células T CAR, os ratinhos portadores de tumor são administradas doses clinicamente relevantes de lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) e WBI (16,5 Gy).

Os ratos foram mantidos e criados em condições livres de patógenos na Duke University Medical Center (DUMC). Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Duke University Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC).

1. A administração de temozolomida para portadores de tumor Ratos

Dias de 0 a 4:

  1. Calcula-se o número total de ratinhos para serem injectados e multiplicar este por 0,5 para determinar o volume de solução necessário TMZ (por exemplo, 30 ratos x 0,5 ml = 15 ml TMZ) e adicionar 1,5 ml para este volume para contabilizar transbordamento (16,5 ml TMZ ).
  2. Multiplicar este volume total de 3 mg / ml para determinar o peso do liofilizado TMZ necessário (por exemplo, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Pese isso em um cônico de 50 ml.
    CUIDADO: TMZ é tóxico por inalação, ingestão e contato com os olhos, pele e membranas mucosas. Consulte com a segurança da instituição ocupacional e / ou de saúde ambiental e do departamento de bem-estar para recomendações sobre como reduzir o risco de exposição.
  3. Multiplicar o volume total de 0,15 para determinar o volume de dimetil sulfóxido (DMSO) necessário (por exemplo, 16,5 x0,15 = 2,475 ml de DMSO). Filtrar esterilizar este volume de DMSO (mais um adicional de 2 ml para explicar transbordamento) através de um filtro de 0,2 um para um tubo estéril. Adicionar 2,475 mL de DMSO estéril para o pó TMZ.
  4. Coloque a solução TMZ / DMSO num copo de água sobre uma placa quente a 65 ° C durante 10-15 min. Uma vez TMZ estiver completamente dissolvido, a solução deve ficar de cor amarelo pálido; se a solução torna-se cor de rosa, em seguida, a TMZ é degradada, e uma nova solução deve ser preparada com um lote fresco de TMZ.
  5. Calcula-se o volume apropriado de solução salina estéril através da multiplicação necessária 0,85 pelo volume total (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml de solução salina). Adicionar 15 ml de solução salina estéril para uma cónico de 50 ml. Enquanto TMZ é dissolução em DMSO, a solução salina de calor a 65 ° C.
  6. Vortex a solução / DMSO TMZ para garantir que o pó TMZ é totalmente dissolvido e adiciona-se lentamente solução salina aquecida até a solução / DMSO TMZ.
  7. Imediatamente após a preparação, carregue totalmente 15 x 1 ml syring tuberculinaes com solução TMZ para administração a quatro dias camundongos com tumores estabelecidos.
  8. Repetir este procedimento nos dias 1 a 4 para um total de cinco administrações TMZ.

2. cérebro inteiro de Irradiação de portadores de tumor Ratos

Dias 2 a 4:

  1. Ligue o irradiador de raios-X e deixe-o aquecer-up de tensão total. Certifique-se de que o filtro apropriado está no lugar e entrada a tensão adequada e as configurações atuais (Figura 2A).
    NOTA: A dosimetria da irradiador deve ser estabelecido de antemão para determinar as configurações de tensão e layout de grade (Figura 2A, B) apropriado.
  2. Calcula-se a duração do tempo que é necessário para resultar em 5,5 Gy de irradiação de raios-X. Por exemplo, se os raios X são entregues a uma taxa de 2 Gy / min, em seguida, 2,75 min é necessário para fornecer um total de 5,5 Gy. Introduza o tempo de duração apropriada.
    NOTA: A Tabela 2 apresenta rato WBI doses and seus equivalentes clínicos em seres humanos. No contexto de gliomas de alto grau, de 60 Gy WBI fraccionado (fracções de 2 Gy, 5 dias / semana, durante 6 semanas) é o padrão de cuidado clínico, e o equivalente murino aqui utilizado é de 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Prepara-se uma solução fresca de cetamina / xilazina na anestesia sistémica, através da adição de 2 ml de cetamina e xilazina 1 ml a 17 ml de solução salina de modo a que a solução final é de 10 mg / ml de cetamina e 1 mg / ml de xilazina.
  4. Pesar ratinhos e administrar 10 uL de cetamina / xilazina intraperitonealmente por grama de peso corporal de modo a que os animais recebem uma dose de cetamina a 100 mg / kg e 10 mg / kg de xilazina. Ratos deve ser totalmente sedado e respirando visivelmente dentro de 2 min de cetamina administração / xilazina.
  5. Para manter a umidade oftálmica em animais sedados, esfregue suavemente uma pequena quantidade de pomada lágrimas artificiais em cada olho.
  6. Coloque ratos sedados na grelha de tal modo que as cabeças estão posicionadas na área que recebe o raio-X em maiorintensidade (Figura 2B, C). Corpos Protetor de pescoço para baixo com tamanho adequado tubo de chumbo para bloquear a entrega de raios-X sistêmica (Figura 2D).
  7. Coloque ratinhos posicionado sob o feixe de raios-X de tal forma que o laser denotando o ponto focal do feixe de raios-X está na coordenada (0,0) sobre a disposição da grade. Comece a entrega de raios-X.
  8. Quando a entrega de raios-X é completo, remover animais do irradiador e coloque sobre uma almofada de aquecimento quente. Não abrigar animais sedados com animais conscientes até animais recuperou a consciência suficiente para manter decúbito externo. Uma vez que os animais podem manter decúbito externo, coloque animais conscientes de volta em suas gaiolas apropriadas.
  9. Repita este procedimento nos dias 3 e 4 de um total de três doses fracionadas de radiação.

3. Transfection

Dia -1:

  1. Prepare meios D10 pela adição de 50 ml de soro fetal bovino (FBS) a 500 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM).
  2. Prepare meios de células T (MTC) por adição de 5,5 ml de L-glutamina, 5,5 ml de piruvato de sódio, 5,5 ml de aminoácidos não essenciais, e 5,5 ml de penicilina / estreptomicina (pen / strep) em 500 ml de meio RPMI-1640. Em seguida, adicione 550 mL de 2-mercaptoetanol e gentamicina 550 mL. Finalmente, adicione 50 ml FBS.
  3. Colheita in vitro de células em cultura e HEK293T levar a uma concentração de 7,5 x 10 6 células / ml em meio D10.
  4. Placa 10 ml de meio de D10 e adicionar 1 ml de suspensão de células HEK293T em cada um de 16 x 10 cm poli-D-lisina (PDL) placas revestidas.
  5. Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2.

Dia 0:

  1. Substituir meios com 10 ml D10 fresco, pelo menos, 30 min antes da transfecção de células.
  2. Determinar a quantidade de vector de plasmídeo, pCL-Eco vector, e o reagente de transfecção lipossómica necessária para transfecção através da multiplicação do número total de placas + 1 (16 + 1 = 17) de 14,1 ugvector plasmídico (14,1 x 17 = 239,7 g), 9,9 ug pCL-Eco vector (9,9 x 17 = 168,3 g), e 60 ul de reagente de transfecção lipossómica (60 x 17 = 1020 mL). Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente antes de preparar soluções.
  3. Rotular dois tubos A e B. No tubo A, adicionar 239,7 g vector plasmídeo e 168,3 mg PCL-Eco vector de (1,5 x 17) ml de soro reduzida meio de Eagle modificado (RS-MEM). No tubo B, adicionar 1,020 mL de reagente de transfecção lipossómica de (1,5 x 17) ml de RS-MEM.
  4. Incubar A e B separadamente, durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Misturar A e B, em conjunto com cuidado (vortex durante 1-2 segundos ou gire várias vezes) e incubar durante 20 min à temperatura ambiente para formar complexos lípido / ADN.
  6. Adicionar lípido / DNA do complexo gota a gota às células HEK293T em placa de 10 cm.
  7. Incubar a 37 ° C durante 6-8 horas ou durante a noite (não exceder 24 h).
  8. Depois de 6-8 horas de incubação, substitua médio, com 12 ml de TCM fresco para a produção viral. Este chapeados mediaserão utilizados no Dia 2 como sobrenadante viral para a transdução de células T.

4. A esplenectomia e Preparação de Células T

Dia 0:

  1. Despeje 10 ml de TCM em um cônico de 50 ml e colocar no gelo para a coleta de baço.
  2. Sacrificar o número adequado de animais por asfixia com CO2 e decapitação secundário: Colocar os animais em uma gaiola de recepção de CO 2 a um caudal de 10-30% do volume da gaiola / minuto, por orientações American Veterinary Medical Association (não mais do que 5 animais podem ser sacrificado simultaneamente) até termina respiração e durante dois minutos depois. Remover animais da câmara de CO 2 e decapitar.
    NOTA: Um baço de um 6-12 semanas de idade do sexo feminino C57BL / 6 do mouse irá produzir cerca de 4,5-5 x 10 7 esplenócitos. Aqui, 4 baços serão colhidas para aproximadamente 200 x 10 6 células.
  3. Coloque o rato de tal forma que seu lado direito está virado para cima, epulverizar com etanol a 70%. Com a pinça, pegue uma dobra fina de pele abaixo da caixa torácica esquerda e cortou uma pequena incisão com a tesoura. Retire a pele, pegue cuidadosamente uma dobra fina do peritônio com uma pinça, e cortou uma pequena cavidade.
  4. O baço é um órgão alongado pequeno, escuro vermelho que se assemelha a um bean achatada; delicadamente agarrar o baço com a pinça e impostos especiais de consumo por cortar o tecido conjuntivo circundante. Colocar os baços extirpados em cónico contendo 10 ml de TCM em gelo.
  5. Pour baços mais de um 70 um filtro de células de malha e desagregar por trituração com a extremidade romba do interior de uma seringa de 5 ml para gerar uma suspensão de célula única. Devem ser desagregados Um máximo de dois baços per mesh peneira.
  6. Use um pequeno volume de TCM para lavar cuidadosamente o filtro seguinte desagregação de recolher quaisquer esplenocitos restantes. Associação Todos os baços desagregados em uma suspensão de uma única célula. Levar o volume final para 50 mL com uma lavagem de TCM para umad girar a 300 xg durante 10 min.
  7. Prepara-se uma solução de tampão de lise 1x por adição de 5 ml de 10x tampão de lise a 45 ml de água estéril. Para eliminar as células vermelhas do sangue, ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de lise 1x por baço em uma cónico de 50 ml, misturando bem cuidado pipetando para cima e para baixo. Se não superior a 5 baços, utilizar um tubo de centrífuga de 250 ml. Colocar o tubo de centrifugação cónico ou em um banho de água a 37 C ° durante 5 min.
  8. Remover a reacção de lise a partir do banho de água e adicionar TCM na proporção de 1: 1 com tampão de lise para neutralizar a reacção. Lavar por centrifugação a 300 xg durante 10 min.
  9. Aspirar o sobrenadante e pellet totalmente ressuspender em TCM (2 ml / baço, 8 ml total para 4 baços) por pipetagem cima e para baixo.
  10. Contar as células por adição de 10 ul de suspensão de células a 190 ul azul de tripano (diluição de 1:20). Multiplicar o número obtido em um dos quatro quadrados em grade por 20 x 10 4 x volume total (8 mL) para se obter o número total de células (por exemplo, células 125 x 20 x 10 4 6 esplenócitos).
  11. Dilui-se as células a uma concentração de 2 x 10 6 células / ml em TCM, suplementado com 2 ug / ml de concanavalina A (ConA) e 50 UI / ml de recombinante humano IL-2 (rhIL-2). Assim, para 200 x 10 6 esplenócitos, adicionar 92 ml de meio de células de 8 ml, 200 ug de Con A, e 5000 UI de rhIL-2.
  12. Adicionar 2 mL de células para cada poço de placas tratadas de cultura de tecidos de 24 poços, de tal modo que 4 x 10 6 células em cada poço são (por exemplo, 100 ml de células vai demorar aproximadamente 4 placas).
  13. Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2.

5. Transdução

Dia 1:

  1. Calcular o número de cultura não-tecido tratado placas de 24 poços necessários para a transdução através da multiplicação do número de baços colhidos por 2 (8 placas são necessários para baços 4).
  2. Em seguida, calcular o volume requerido de solução fragmento de fibronectina humana recombinante (RHFF)necessária para placas de revestimento através da multiplicação (número total de poços + 3) x 0,5 ml (8 x 24 placas = 192 poços + 3 = 195) x 0,5 mL = 97,5 mL.
  3. Prepare a 97,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo RHFF a uma concentração de 25 ug / ml, multiplicando o volume total de 25? G (97,5 x 25 = 2437,5 ug). Adicionar esta quantidade de RHFF a 97,5 ml PBS.
  4. Bata de cultura não-tecido tratado placas de 24 poços por adição de 0,5 ml de solução PBS / RHFF por poço.
  5. Incubar durante a noite a 4 ° C.

Dia 2:

  1. Despejar solução de PBS / RHFF de cultura não-tecido tratado placas de 24 poços.
  2. Adicionar 1 ml / poço de albumina de soro bovino a 2% (BSA) em PBS e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  3. Remover BSA por firmemente upending placa. Lavar por adição de 2 ml de PBS.
  4. Recolher o sobrenadante virai por transferência de meios de comunicação a partir de cada placa HEK293T PDL para um tubo de centrífuga de 250 ml e girar 10 min a 500 x g.
  5. Transferir cuidadosamente su viralpernatant em um 250 ml fresco tubo de centrifugação, tendo a certeza de não perturbar o sedimento de células que podem ter se formado.
  6. Adicionar TCM fresco ao sobrenadante virai, tal que o volume final de 3 ml é mais do que a quantidade necessária para poços RHFF-revestidos. Por exemplo, para 192 poços RHFF-revestidos, trazer ao volume de sobrenadante virai a 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Remover esplenócitos cultivadas na incubadora e ressuspender por suavemente pipetando para cima e para baixo 2 - 3 vezes em cada poço. Transfira para uma cónico de 250 ml. Se utilizando uma pipeta multicanal, utilizando um reservatório estéril antes de serem transferidos vai ajudar a acelerar esta etapa. Contagem como anteriormente descrito e centrifugação a 300 xg durante 10 min.
  8. Adicionar rhIL-2 a sobrenadante viral a uma concentração de 50 Ul / ml. Por exemplo, adicionar 50 x 195 = 9.750 UI a 195 ml de sobrenadante viral-2 rhIL.
  9. Ressuspender esplenócitos em sobrenadante virai a 1 x 10 6 células / ml
  10. Adicionar 1 ml / poço de uma suspensão de esplenócitos em placas de 24 poços revestidas com RHFF.
  11. Rotação por 90 min de acordo com as seguintes configurações: 770 xg, aceleração = 4, freio / desaceleração = 0, 32 ° C.
  12. Prepara-se uma solução de TCM com 50 UI / ml de rhIL-2. Por exemplo, preparar uma solução de 200 TCM por adição de 10.000 UI de rhIL-2. Adicionar 1 ml de rhIL-2 / TCM a cada poço, após a centrifugação.
  13. Cultura durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2.

6. CAR célula T Cultura e colheita

Dias 3 e 4:

  1. Se as células T obter> 80% de confluência, as células podem ser divididas (isto normalmente ocorre no dia 3 ou dia 4). Para dividir as células, pipetar suavemente para cima e para baixo em cada poço de 2-3 vezes, e mover-se 1 ml de cada poço em novos poços de uma placa de 24 poços de cultura de tecidos tratados fresco. Em seguida, adicionar 1 ml de TCM fresco com 50 UI / ml de IL-2 a cada cavidade de tal modo que o volume final é de 2 ml em todos os poços.
  2. Se as células não atingem> 80% de confluência, realizar uma mudança de metade meios por pipetagem fora lentamente 1 ml de meios de comunicação a partir do topo de cada cavidade. Evite disturbing células se instalaram no fundo durante a remoção da mídia. Adicionar 1 ml de TCM fresco contendo 50 UI / ml de rhIL-2.

Dia 5:

  1. Suspenda as células T CAR cuidado pipetando para cima e para baixo 3 vezes em cada poço e transferir para um tubo de centrífuga de 250 ml. Girar células a 300 xg durante 10 min.
  2. Sobrenadante completamente aspirado sem perturbar pellet. Lavar uma vez com PBS, a contagem de células como descrito anteriormente, e lavar com PBS uma segunda vez. Um rendimento típico de células T CAR é de aproximadamente 1 x 10 6 células por poço (8 placas de células x 24 poços = 192 x 10 6 CAR T).
  3. Ressuspender as células em PBS a uma concentração de 5 x 10 7 / ml para uma injecção de 1 x 10 7 num volume de 200? G (por exemplo, para 192 x 10 6 células T CAR, ressuspender o sedimento lavado em 3,84 ml de PBS).

7. CAR T Administration celular para portadores de tumor Ratos

Dia 5:

  1. Transport células sobre gelo para instalações de animais por injecção intravenosa. Carga 500-1.000 ul em seringa de insulina com 27-31 G agulha, assegurando que todas as bolhas são expulsos.
  2. Pegue um rato na base da cauda e colocar em restrainer tubo.
  3. Puxar a cauda esticada com a veia virada para cima, e deslizar a agulha aproximadamente 1-2 mm sob a pele para dentro da veia, inserindo-o paralelo na veia da cauda. Lentamente expelir 200 ul na veia. Se a agulha estiver correctamente introduzida na veia, o volume vai fluir facilmente in; caso contrário, haverá resistência e da agulha terá que ser removido a partir da cauda e re-inserido correctamente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Células carro T são gerados por transdução com o vector retroviral EGFRvIII CAR 11. Este vector, MSGV1, foi desenvolvido a partir do vector SFGtcLuc_ITE4 35, que contém o vírus de células estaminais de murino (MSCV) repetições terminais longas, a região gag estendida e local de splicing do envelope (dador de splicing, sd, e aceitador de splicing, sa), e viral sinal de empacotamento (ψ). O CARRO EGFRvIII contendo o fragmento de anticorpo humano anti-EGFRvIII de cadeia única variável (scFv) 139, em conjunto com CD8TM murino, CD28, 4-1BB, e CD3ζ regiões intracelulares, foi clonado no vector retroviral a jusante o local Ncol (Figura 3) .

Na sequência de transdução, as células T CAR pode ser quantificada e fenotipados por citometria de fluxo. EGFRvIII células T CAR pode ser visualizada com um painel de 2 cores composta por uma estreptavidina-ficoeritrina (SA / PE) conjugado a biotynlated multímero derivada-EGFRvIII e anti-CD3 FITC. Usando a cultura e transdução de protocols descrito aqui, nós rotineiramente observar expressão CAR entre 55-70% de esplenócitos murinos (Figura 4A) 11. Como alternativa, RAC também podem ser coradas para expressão usando F cabra-anti-humano (ab ') 2 de anticorpos secundário e primário biotina-SA / PE que tem sido previamente descrito 36. CARRO células T podem ainda ser fenotipados pela adição de outros anticorpos marcados com fluorescência para o painel CARRO de duas cores. Por exemplo, a coloração para CD8 e CD4 mostra que 70% do CAR são transduzidas células T CD8 +, enquanto que 20% são células T CD4 + (Figura 4B). CARRO células T com este perfil de expressão têm sido mostrados para tráfego prontamente para o cérebro e o tratamento de tumores intracranianos.

Tabela 1:. Dose de temozolomida com base no peso do animal doses de temozolomida foram calculadas com base em uma dose total de 60 mg / kg.

O peso corporal Volume
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0,46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0,42 ml
20 g 0,40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0,36 ml
17 g 0,34 ml
16 g 0,32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0,28 ml
13 g 0,26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0,22 ml
D d # Frações CAMA SOC
16,5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52,5 LGA
12 3 4 30 Met
16 2 8 32 Met

Tabela 2:. As doses de radiação biologicamente equivalentes clinicamente relevantes As doses de radiação foram calculados de acordo com a CAMA D = [1 + d / (α / β)], em que D = dose total, a dose d = fraccionado, e α / β = 2). A dose total administrada como WBI ao hospedeiro murino é mostrada em termos de the doses fracionadas entregues e a dose humana que é modelada por essas frações de dose. Para fins de modelo, a malignidade para que a cama é padrão de atendimento também é mostrada.

Figura 1
Figura 1:. Linha de tempo para o tratamento de ratinhos portadores de tumor e concomitante geração ex vivo CARRO padrão de cuidados quimioterapia e irradiação de todo o cérebro começa 4 dias após a implantação do tumor (A). Durante este intervalo de tempo, as células T são gerados CAR e cultivadas ex vivo (B) e entregues após um ciclo completo de acolhimento condicionado.

Figura 2
Figura 2: Layout e configurações para entrega de radiação.Os raios X são fornecidos de acordo com um dosimetria de 320 kV e 10 mA, com uma duração variável escolhida de acordo com a dose desejada (A). O campo focal da radiação de raios-X é uma área de 2,5 centímetros estreita. Animais sedados são dispostos de acordo com a grelha (B) de tal forma que as cabeças se encontram na área de maior intensidade de raios-X; (C) mostra a vista de uma das extremidades do feixe de raios-X. Cerca de 4 animais podem estar sob a irradiador durante um curso de administração de raios-X de acordo com esta disposição da grade (B, D). Tubo de chumbo é usado para proteger o corpo, deixando apenas suas cabeças expostas para WBI (D).

Figura 3
Figura 3: O vector retroviral modificado SFGtcLuc_ITE4, MSGV1, foi utilizado para a transdução e geração de células T O CARRO.Insert CAR EGFRvIII contendo o fragmento humano anti-EGFRvIII cadeia única variável (scFv) 139, em conjunto com CD8TM murino, CD28, 4-1BB e CD3ζ regiões intracelulares, é ladeado por vírus de células-tronco murino (MSCV) repetições terminais longas (LTR ). Upstream da inserção CAR são a região gag estendida e local de união envelope (dador, sd, e emendar aceitante, sa), e o sinal de empacotamento viral (ψ).

Figura 4
Figura 4: CARs EGFRvIII são expressos na superfície de células T de 48 horas a seguir a transdução, as células T foram coradas para expressão de superfície de CARs o EGFRvIII utilizando um multímero composto de LEEKKGNYVVTDHC-K (biotina) -NH2 / estreptavidina-PE.. As células não transduzidas T do mesmo dador foram também coradas como um controlo negativo. Os dados mostram o número de células T CAR (eixo-y) positivos para staining pelo multimero conjugado com PE EGFRvIII (eixo x), fechado nas células CD3 + como um marcador de célula T, em que a expressão se verificou ser 60,9% (A). CARRO células T CD4-coradas para PerCP-Cy5.5 e APC-CD8 mostram um perfil de 21,7% e 70,9%, respectivamente (B) a expressão.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A linha do tempo de tratamento descrito aqui foi projetado para modelar padrão clínico de cuidado e alavancar os seus efeitos para a terapia adotiva CAR. T doses carro de célula, regimes TMZ, administrativos e radioterapia podem ser modificados para aumentar a actividade in vivo de células T, lymphodepletion e assassinato tumor. Os regimes de TMZ pode ser aumentada para se obter mieloablação hospedeiro e aumentar a expansão das células adoptivamente transferidos 30. Além disso, os efeitos lymphodepletive de TMZ pode ser reproduzido por baixa dose (4-6 Gy)-única fração de irradiação total do corpo (TBI), contornando, assim, as propriedades tumoricidas de SOC. O regime de radiação aplicada aqui imita uma dose biologicamente equivalente de 60 Gy; no entanto, o número de frações e doses fracionadas pode ser ajustado para imitar outras doses clínicas (Tabela 2). É importante ressaltar que o nosso modelo de SOC utiliza doses biologicamente equivalentes de WBI, em vez de radiação externa entregue focally ao tumor e margins, como é frequentemente utilizado na clínica, e pode assim levar a uma menor dose de radiação no tumor e um aumento do risco de toxicidades de cérebro de rato saudável. Apesar destas limitações, no entanto, WBI é uma técnica aceita para modelar radioterapia clínica em um cenário pré-clínico.

Doses de células T carro pode ser aumentada ou diminuída para observar os efeitos de doses em assassinato tumor e sobrevida global de 11. Além disso, o tempo de tratamento e via de administração pode ser modificado para observar diferenças na eficácia. Por exemplo, as células T CAR pode ser entregue por via intracraniana para assegurar a actividade no local do tumor. O rendimento de células CAR-positivo T pode variar, dependendo da eficiência de transdução. Uma maneira de assegurar uma transdução de sucesso é através da realização de uma proteína fluorescente -control verde (GFP) em todo o processo. Para fazer isto, uma placa de 10 cm HEK293T PDL pode ser alocado para a transfecção de GFP e transdução de um único poço de células T para screen para a GFP nos dias 3-5. Um factor crítico na eficiência de transdução é a medida da activação das células T e a proliferação pela adição de sobrenadante viral. Observamos uma discrepância significativa entre o nosso método de activação de células T, o que é conseguido através da adição de ConA ao meio de cultura, e que é utilizado no contexto clínico, conseguida por meio de anticorpos monoclonais agonistas CD3 e CD28. Embora este último é rotineiramente usado para gerar retrovirais transduzidas células T CARRO paciente e também tem sido bem sucedida na transdução de células T murino, previamente determinado que a estimulação ConA levou a melhor e mais consistente transduções 37. Observamos, também, que a T rendimento global célula CAR pode variar com base em quando passo 5,18 é executada. Se tiver rendimento celular CAR T pobres, recomendamos realizar o passo 5,18 imediatamente após o passo 5,17 em vez de esperar para a incubação de 5-6 horas. Embora isso possa afetar a eficiência de transdução, não observamos dif significativaças na expressão superfície CAR em nossos estudos.

Após a transdução, as células T CAR pode ser quantificado e fenotipadas por citometria de fluxo; nós manchar nossas células EGFRvIII CAR T com um painel de 2 cores composta por um estreptavidina-ficoeritrina (SA / PE) conjugado a biotynlated mult�ero derivados de EGFRvIII e anti-CD3. Como alternativa, RAC também podem ser coradas para expressão usando F cabra-anti-humano (ab ') 2 de anticorpos secundário e primário biotina-SA / PE que tem sido previamente descrito 36. Rotineiramente observar expressão CAR entre 55-70% de esplenócitos murinos 11. Nós mostramos anteriormente que a administração de células T com este perfil de expressão CAR pode prontamente tráfego para o cérebro e o tratamento de tumores. Lymphopenia induzida por TBI TMZ- ou aumenta a expansão clonal de células adotivamente transferidos, aumentando a frequência de células Car-positivo e sua resposta global antitumoral. Células T CAR pode ser rastreado in vivo através da coloração de sangue periférico com o umtetramer ppropriate; esta é uma técnica útil para a compreensão CAR T sobrevivência das células ao longo do tempo e os efeitos de host-condicionado em função das células T CAR e persistência. Em alternativa, se não tetrâmero está disponível para o receptor do antigénio, um repórter fluorescente pode ser incluída na construção CARRO vector ou células T CAR pode ser marcado ex vivo com éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) antes da administração para o rastreamento in vivo.

Dependendo do modelo do tumor, a plataforma de imunoterapia, e regime de SOC, SOC clínica administrada juntamente com a terapia adotiva ou vacinas podem levar a efeitos tóxicos. TMZ é um agente de alquilação de DNA que leva a morte celular não específica, e intensificação das doses pode resultar em perda de peso e morbidade em hospedeiros murinos. Altas doses e frações prolongados de WBI pode resultar em hidrocefalia. Além disso, os efeitos inflamatórios de forte vacina e / ou respostas de células T adotivamente transferidos pode levar a morbidade portempestades de citocinas tóxicos. Também é importante notar os efeitos da anestesia sistémico em animais mórbidos. Se TMZ WBI e conduzir a toxicidades significativas, em seguida, doses de cetamina / xilazina pode ser reduzida em 20-25% para reduzir o risco de mortalidade, como animais apenas necessitam de sedação e imobilizada durante 10 min para a entrega de pequenas doses de radiação (2- 8 Gy).

Anfitrião condicionado é fundamental para todas as plataformas de imunoterapia, que incluem a transferência adotiva. Como os ensaios de imunoterapia são frequentemente avaliada dentro do contexto da SOC, a avaliação pré-clínica de imunoterapia deve ser feito dentro desta definição para recapitular o cenário clínico. Apresentamos aqui um exemplo de alavancar o lymphodepletive e efeitos tumoricidas de SOC com terapia adoptiva usando células T CAR. Este regime é uma ferramenta poderosa que pode ser aplicado a outras plataformas de imunoterapia para avaliar os efeitos combinados de SOC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

Tags

Biologia do Câncer Edição 96 Tumor imunoterapia glioblastoma receptor antígeno quimérico transferência adotiva a temozolomida radioterapia
Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Riccione, K., Suryadevara, C. M.,… More

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter