Introduction
神経膠芽腫（GBM）は、最も一般的な原発性悪性脳腫瘍であると常に致命的である。ケア化学療法および放射線療法の非特異的に結合された標準の外科的切除が完全にこの疾患を有する患者における1未満の15ヶ月の予後不良をもたらす、悪性細胞を排除することができない。対照的に、免疫療法は、腫瘍細胞を特異的に標的化するための正確なアプローチを提供し、したがって、担保毒性2-4リスクの減少と非常に効果的な治療プラットフォームとして機能する可能性がある。キメラ抗原受容体（車を）を発現するようにex vivoでを設計し 、T細胞が腫瘍免疫療法のための多目的な戦略を提供します。是正は、複雑な、完全長の主要組織適合性の代わりに、一つ以上の細胞内のT細胞シグナル伝達分子（単数または複数）を有する抗体の細胞外可変領域を融合することによって生成される（MHC）は、T細胞受容体5を拘束性。抗体様抗原のこのモードrecognitiには、反応性の抗原特異的T細胞はMHCの非存在下で認識腫瘍抗原に応答することを可能にし、実質的に無限の抗原レパートリーに適合させることができる。
腫瘍抗原の多様に対して設計さCARのT細胞は、診療所6-9に前臨床有効性と優れた将来性を示している。具体的には、GBM、上皮成長因子受容体変異体III（EGFRvIIIの）、細胞表面10上に発現される腫瘍特異的な変異を標的CAR T細胞プラットフォームの文脈において、神経膠腫を有するマウス11の生存を延長することが示された。汎用性にもかかわらず、しかし、CAR養子療法の臨床的利点は、完全に起因する腫瘍関連免疫抑制および免疫回避12-16ならびに確立およびin vivoで抗原特異的T細胞を維持する際の課題の一部は、実現されていない。免疫療法とケア（SOC）の標準を活用することは、潜在的にこれらのLのいくつかを克服することができる模造品、両方の前臨床および臨床の場で強化された有効性になる。
切除後GBMのためのSOCは、高用量のテモゾロミド（TMZ）、DNAアルキル化剤17、及び全脳照射（WBI）から成る1。これらの治療は、腫瘍MHC発現18-20および死腫瘍細胞17,19,21,22による抗原の脱落のアップレギュレーションを介して、腫瘍ワクチンと相乗作用することが推定される。実際、前臨床設定における免疫ベースの治療法の強化された抗腫瘍効果にTMZ 20,23-またはWBI 18,24リードの追加。さらに、多くの非特異的な細胞傷害性化学療法のように、TMZは、養子療法プラットフォーム27-29に対するホスト空調手段として活用することができる全身リンパ球25,26を引き起こすことが知られている。 TMZ媒介リンパ球枯渇は、ADOPの効力の増大をもたらす、抗原特異的T細胞の頻度及び機能を増強することが示されている頭蓋内腫瘍30に対して電性治療プラットフォーム。 CAR療法の文脈では、リンパ球枯渇は、内因性サプレッサーT細胞31の数を減らし、従って、抗腫瘍活性11,34を増強サイトカイン33削減競争を介して恒常的増殖32を誘導することの両方によってホスト調節手段として機能する。 GBM SOCと免疫療法のプラットフォーム間の相乗関係を考えると、SOCの文脈における新規養子療法とワクチンプラットフォームを評価する有効性に関する意味のある結論を引き出すために重要である。
このプロトコルでは、（処理タイムラインについては図1を参照）のEGFRvIII陽性頭蓋内腫瘍を有するマウスにおけるTMZとWBIと一緒にマウスのEGFRvIII特異CARのT細胞の生成および静脈内投与のための方法を概説する。簡単に言えば、CAR T細胞は、レトロウイルス形質導入によりエクスビボで行われる。ヒト胚腎臓（HEK）293T次いで、細胞を採取し、並行して培養し、活性化マウス脾細胞を形質導入するために使用されるウイルスを生成する（CARベクトルとしたpCL-エコプラスミドを含む）、DNA /脂質複合体を用いてトランスフェクトされる。 CARの生成の過程において、EGFRvIIIの陽性頭蓋内腫瘍を有するマウスのホストは、臨床SOCに匹敵する用量で分画した全脳X線照射および全身TMZ処置を投与する。 CAR T細胞を、lymphodepletedホストに静脈内に送達される。
腫瘍を有するマウスにテモゾロミドの（1）投与、腫瘍を有するマウスの（2）全脳照射、（3）トランスフェクション、（4）、脾臓摘出及びT細胞の調製、（5：以下の手順は、7つの別々の相に記載されている腫瘍を有するマウスに）形質導入、（6）CAR T細胞培養および収穫、及び（7）CARのT細胞の投与。これらの相は6〜7日にまたがると並行して行われるいくつかのステップで構成されています。
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Protocol
このプロトコルは、10匹のマウスは、10 7 CAR T細胞それぞれで処理した実験計画に基づいている。これは、10 8 CAR T細胞が必要とされることを意味する。収率は、生存能力の損失を口座に5×10 7 -1×10 8で過大評価されるべきである。以下のプロトコルは、約200×10 6個の細胞を生成するためにスケーリングされる。次いで、細胞を既存のKR158B星状細胞腫またはB16メラノーマ細胞株から開発、9日確立同系のEGFRvIII陽性頭蓋内腫瘍でメスのC57BL / 6マウスに静脈内投与される。 CAR T細胞の生成に付随し、担癌マウスをlymphodepletive TMZた（60mg / kg）およびWBI（16.5グレイ）の臨床的に適切な用量で投与される。
マウスは、デューク大学医療センター（DUMC）での病原体を含まない条件下で維持して飼育した。全ての動物実験は、デューク大学機関によって承認されたプロトコルに従って実施したアル動物管理使用委員会（IACUC）。
担癌マウスへのテモゾロミドの1.管理
日〜4 0：
- マウスの総数が注入される計算スピルオーバー（16.5ミリリットルTMZを考慮して（ 例えば、30匹のマウスのx 0.5ミリリットル= 15ミリリットルTMZ）必要なTMZ溶液の体積を決定し、このボリュームを1.5ミリリットルを追加する0.5することによって、これを掛ける）。
- 乗算凍結乾燥されたTMZの量を決定するために3 mg / mlのことで、この総容量（ 例えば、16.5×3 = 49.5 mgのTMZ）を必要とした。 50ミリリットルコニカルにこれを秤量する。
注意：TMZは吸入、経口摂取、および、目、皮膚、及び粘膜に接触すると有毒である。被ばくのリスクを低減に関する勧告のための機関の労働安全および/または環境健康とウェルネス部門に相談してください。 - ジメチルスルホキシド（DMSO）が必要（ 例えば 、体積を決定するために0.15総容量を掛け、16.5 xは0.15 = 2.475ミリリットルDMSO）。滅菌チューブに0.2μmのフィルターを通して（スピルオーバーを考慮するために加え、追加の2ミリリットル）のDMSOのこのボリュームを殺菌フィルター。 TMZ粉末に無菌のDMSO 2.475 mLを加え。
- 10〜15分間65℃のホットプレートの上に水の入ったビーカーに、TMZ / DMSO溶液を置きます。 TMZは完全に溶解したら、溶液の色は淡黄色になるべきである。溶液がピンク色になった場合、TMZが低下し、新しいソリューションをTMZの新鮮な多くで調製すべきである。
- 総量（0.85 X 16.5ミリリットル= 14.025ミリリットル生理食塩水）で0.85を乗じて必要とされる滅菌生理食塩水の適切な量を計算します。 50ミリリットルコニカルに滅菌生理食塩水15ミリリットルを追加します。 TMZは、DMSO、65℃に加熱食塩水に溶解されている。
- 渦TMZ / DMSO溶液は、TMZ粉末が完全に溶解し、ゆっくりとTMZ / DMSO溶液に温め、食塩水を追加していることを確実にする。
- 調製直後、完全に15×1ミリリットルのツベルクリンsyringをロード4日確立された腫瘍担持マウスへの投与のためのTMZ溶液を用いてES。
- 5 TMZ投与、合計4を通して1日目でこの手順を繰り返します。
担癌マウスの2.全脳照射
日2〜4：
- X線照射の電源を入れ、それが全電圧にウォームアップすることができます。適切なフィルタが所定の位置と入力に適切な電圧と電流の設定（ 図2A）であることを確認してください。
注：照射の線量測定は、適切な電圧設定値とグリッドレイアウト（ 図2A、B）を決定するために、事前に確立されるべきである。 - 5.5 GyのX線照射をもたらすために必要である時間の長さを計算する。 X線は、2 Gyの/分の速度で送達される場合、次に2.75 minは5.5 Gyの合計を提供することが必要である。入力適切な持続時間。
注： 表2は、マウスWBIは用量提供ヒトでのND臨床同等。高悪性度神経膠腫の文脈では、60 GyはWBI（6週間、2 Gyの画分、5日/週）を分画しケアの臨床的基準は、であり、ここで使用されるマウスの等価物は16.5 Gyの線量（Gy×3 5.5）である。 - 最終溶液は、10 mg / mlのケタミンおよび1mg / mlのキシラジンであるように17ミリリットル生理食塩水に2ミリリットルケタミンと1ミリリットルキシラジンを追加することによって、全身麻酔のためのケタミン/キシラジンの新鮮な溶液を調製する。
- マウスを秤量し、動物が100ミリグラム/ kgおよび10mg / kgキシラジンでケタミンの用量を受けるように、体重1gあたり腹腔内ケタミン/キシラジンの10μlを管理します。マウスは、完全に鎮静さと目に見えてケタミン/キシラジン政権の2分以内に呼吸をする必要があります。
- 鎮静さの動物における眼科水分を維持するために、静かにそれぞれの眼に人工涙液軟膏の少量をこする。
- ヘッドは最も高いX線を受ける領域に配置されるように、グリッド上に鎮静させたマウスを置きテンシティ（ 図2B、C）。全身X線配信（ 図2D）をブロックするために適切なサイズのリードチューブと首から下シールド体。
- グリッドレイアウト上のX線ビームの焦点位置を示すレーザ座標（0,0）になるように、X線ビームの下に配置したマウスを置く。 X線の配信を開始します。
- X線配信が完了すると、暖かい加熱パッド上に照射し、所定の位置から動物を削除する。動物は胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻しまで、意識のある動物で鎮静動物を収容しないでください。一度動物は、胸骨横臥を維持彼らの適切なケージには意識のある動物を配置することができます。
- 放射線の3分画された用量の合計3日目および4でこの手順を繰り返します。
3.トランスフェクション
-1日目：
- ダルベッコM、500 mlの50ミリリットルのウシ胎児血清（FBS）を添加することにより、D10メディアを準備odifiedイーグル培地（DMEM）。
- 500ミリリットルRPMI-1640培地に5.5ミリリットルのL-グルタミン、5.5ミリリットルのピルビン酸ナトリウム、5.5ミリリットルの非必須アミノ酸、及び5.5ミリリットルのペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を添加することによって、T細胞培地（TCM）を準備。次に、2-メルカプトエタノールおよび550μlのゲンタマイシンの550μlを添加する。最後に、50ミリリットルのFBSを追加します。
- 収穫インビトロ培養されたHEK293T細胞およびD10培地中7.5×10 6細胞/ mlの濃度にもたらす。
- プレートを10ml D10培地と16×10cmのポリ-D-リジン（PDL）でコーティングしたプレートの各HEK293T細胞懸濁液1mlを加える。
- 5％CO 2で37℃で一晩インキュベートする。
0日目：
- 細胞をトランスフェクション前に10ミリリットルの新鮮なD10少なくとも30分間でメディアを交換してください。
- ベクタープラスミドの量たpCL-エコベクター、および14.1μgのによりプレートの総数+ 1（16 + 1 = 17）を乗じて、トランスフェクションのために必要リポソームトランスフェクション試薬を決定するベクタープラスミド（14.1×17 = 239.7μgの）、9.9μgのPCL-エコベクトル（9.9×17 = 168.3μgの）、および60μlのリポソームトランスフェクション試薬（60×17 = 1020μL）。すべての試薬は溶液を調製する前に室温であるべきである。
- 管A内のラベル2の管AとBは、（×17 1.5）に239.7μgのベクタープラスミドと168.3μgのPCL-エコベクトルを追加する（RS-MEM）減少し、血清改変イーグル培地をミリリットル。チューブBで、（1.5×17）mlのRS-MEM 1020μlのリポソームトランスフェクション試薬を加える。
- 室温で5分間別々にAとBをインキュベートする。
- （1-2秒間ボルテックスし、または数回転倒）優しく一緒にAとBを混合すると、脂質/ DNA複合体を形成するために、室温で20分間インキュベートする。
- 10cmディッシュでHEK293T細胞に滴下脂質/ DNA複合体の低下を追加します。
- 6-8時間または一晩（24時間を超えない）、37℃でインキュベートする。
- 6-8時間インキュベートした後、ウイルス産生のための新鮮なTCMの12ミリリットルを含む培地を交換してください。これは、メディアメッキT細胞の形質導入のためのウイルス上清と2日目に使用される。
4.脾臓摘出とT細胞の調製
0日目：
- 脾臓収集のための氷上で50ミリリットルコニカルし、所定の位置にTCMの10ミリリットルを注ぐ。
- CO 2窒息と二断頭により動物の適切な数を生け贄に捧げる：アメリカ獣医師会のガイドラインあたり、10〜30％のケージボリューム/分の流量でCO 2を受信ケージ内の場所動物（わずか5動物が可能呼吸が終了するまで、その後2分間）を同時に犠牲に。 CO 2室から動物を削除し、首を切る。
注：6-12週齢の雌のC57BL / 6マウスのワン脾臓は約4.5〜5×10 7脾細胞が得られます。ここでは、4脾臓は約200×10 6個の細胞のために採取されます。 - その右側が上を向いているようにマウスを置き、そして70％エタノールでスプレー。鉗子で、左胸郭下の皮膚の薄いひだをつかみ、ハサミでわずかに切開をカット。ピールは背中の皮膚、慎重に鉗子で腹膜の薄倍をつかむ、と小さな空洞をカット。
- 脾臓は平坦化された豆に似た小型の、細長い、暗赤色器官である。微妙に周囲の結合組織を離れて切断することにより鉗子と物品税と脾臓をつかむ。氷の上にTCMの10ミリリットルを含む円錐形に切除した脾臓を置きます。
- 70μmのメッシュセルストレーナー上脾臓を注ぎ、単一細胞懸濁液を生成した5ml注射器の内側の平滑末端で叩解して脱凝集する。 2脾臓の最大値は、メッシュストレーナーごとにばらばらにする必要があります。
- 慎重に残りの脾細胞を収集するための分解以下のストレーナーを洗浄するために、TCMの小さなボリュームを使用してください。単一細胞懸濁液中にすべての脱凝集し、脾臓をプール。 1回の洗浄のためのTCMで50mlに最終容量を持参10分間300×gでスピンdは。
- 5ミリリットルの10倍の溶解緩衝液45 mlの滅菌水を添加して1×溶解緩衝液の溶液を調製する。優しく上下にピペッティングによりよく混合、赤血球、50ミリリットルで脾臓あたり1×溶解緩衝液5ミリリットル中にペレットを再懸濁し、円錐形を排除するために。 5脾臓を超える場合は、250ミリリットルの遠心管を使用しています。 5分間37℃の水浴中に円錐形または遠心分離管を置く。
- 水浴から溶解反応を削除し、1でTCMを追加します。反応を中和するために溶解緩衝液で1の割合。 10分間300×gで回転させて洗う。
- ピペッティングによるTCMで上清を吸引し、完全に再懸濁ペレット（2ミリリットル/脾臓、4脾臓のために8ミリリットルの合計）。
- 190μlのトリパンブルー（1:20希釈）への細胞懸濁液10μlを添加して細胞を数える。総細胞数を得るために20×10 4×総容積（8ml）にて4グリッドの正方形のいずれかで得られた数値を乗算する（ 例えば、125細胞×20×10 4 6脾臓細胞）まで。
- 2μg/ mlのコンカナバリンA（ConAの）および50 IU / mlの組換えヒトインターロイキン2（のrhIL-2）を補充したTCMで2×10 6細胞/ mlの濃度に細胞を希釈する。このように、200×10 6脾細胞のために、8ミリリットルの細胞、200μgのConAを、そして5000 IUのrhIL-2に92ミリリットルメディアを追加。
- 4×10 6個の細胞を各ウェルにあるように、24ウェル組織培養処理プレートの各ウェルに2mLの細胞を加える（ 例えば、細胞の100 mlの約4板を必要とする）。
- 5％CO 2で37℃で一晩インキュベートする。
5.トランスダクション
1日目：
- 非組織培養の数は2によって採取した脾臓の数（8プレートを4脾臓のために必要とされる）を乗算することによって形質導入するために必要な24ウェルプレートを処理し計算する。
- 次に、組換えヒトフィブロネクチン断片（RHFF）ソリューションの必要量を計算する（ウェル+ 3の合計数）を乗じてコートプレートに必要な0.5ミリリットル= 97.5ミリリットルをxは（8×24ウェルプレート= 192 + 3 = 195）を0.5ml xは。
- 25μgの（97.5×25 = 2437.5μgの）総容積を乗じて25μgの/ mlの濃度でRHFFを含む97.5ミリリットルリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製。 97.5ミリリットルのPBSにRHFFのこの金額を追加します。
- コート非組織培養ウェルあたり0.5mlのPBS / RHFF溶液を添加することによって24ウェルプレートを処理した。
- 4℃で一晩インキュベートする。
2日目：
- 非組織培養物からPBS / RHFF溶液をダンプ24ウェルプレートを処理した。
- PBS中を1ml /ウェルの2％ウシ血清アルブミン（BSA）を添加し、30分間室温でインキュベートする。
- しっかりとプレートをupendingによりBSAを削除します。 2mlのPBSを加えることによって洗浄する。
- 250mlの遠心管にそれぞれHEK293T PDLプレートから培地を移すことによって、ウイルス上清を収集し、500×gで10分間スピン。
- 慎重にウイルスのSUを転送必ず形成された可能性のある細胞ペレットを乱さないようにされ、新鮮な250mlの遠心管にpernatant。
- 最終容量はRHFF被覆ウェルに必要な量より3ミリリットル以上であるようにウイルス上清を新鮮なTCMを加える。たとえば、192 RHFF被覆ウェルのために、192 + 3ミリリットル= 195ミリリットルにウイルス上清の容積を。
- 各ウェルで3回 - 穏やかにピペッティングしてインキュベータ再懸濁から培養された脾細胞を取り出し、上下2。 250ミリリットルコニカルに移す。マルチチャンネルピペットを使用している場合は、転送する前に滅菌容器を使用すると、このステップを促進するのに役立ちます。前述したように、10分間300×gでスピンカウント。
- のrhILを-2を追加するウイルス上清を50 IU / mlの濃度で。例えば、ウイルス上清の195ミリリットルに50×195 = 9750 IUのrhIL-2を追加します。
- 1×10 6細胞/ mlのウイルス上清中で脾細胞を再懸濁
- RHFFコーティングした24ウェルプレートに脾細胞懸濁液1ml /ウェルを加える。
- 以下の設定に応じて90分間スピン：770 XG、加速= 4、ブレーキ/減速= 0、32℃。
- 50 IU / mlののrhIL-2とTCM溶液を調製する。例えば10,000 IUのrhIL-2を添加することにより200 TCM溶液を調製。遠心分離後、各ウェルにのrhIL-2 / TCMの1ミリリットルを追加します。
- 5％CO 2中で37℃で一晩培養。
6. CAR T細胞培養および収穫
3日目および4：
- T細胞は> 80％コンフルエントを達成した場合、細胞は（これは通常、3日目または4日目までに発生する）に分割することができる。セルを分割するには、穏やかにピペッティングし、各ウェルに2〜3回でダウン、そして新鮮な24ウェル組織培養処理プレートの新しいウェルに各ウェルから1ミリリットルを移動します。その後、それぞれに50 IU / mlのIL-2との最終容量は、全てのウェル中の2ミリリットルであることはよくそのような新鮮なTCMの1ミリリットルを追加します。
- 細胞が> 80％コンフルエンスに達しない場合は、ゆっくりと、各ウェルの上部から培地1mlをオフにピペッティングすることにより半培地交換を行う。 Dを避けるメディアを除去しながら、底に沈降した細胞をisturbing。 50 IU / mlののrhIL-2を含有する新鮮なTCMの1ミリリットルを追加します。
5日目：
- 優しくピペッティングを3回各ウェルに加え、250mlの遠心チューブに移すことによって再懸濁CAR T細胞。 10分間300×gで細胞をスピン。
- 完全にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。 、PBSで一回洗浄する前述のように細胞をカウントし、PBSで二回洗浄する。典型的なCAR T細胞収率は、ウェル当たり約1×10 6細胞（8×24ウェルプレート= 192×10 6 CAR T細胞）である。
- 200μgの量の1×10 7の注入のための5×10 7 / mlの濃度でPBS中に再懸濁し、細胞（ 例えば、192×10 6 CARのT細胞について、再懸濁3.84 mlのPBS中でペレットを洗浄した）。
担癌マウスへ7 CAR T細胞の管理
5日目：
- Transpo静脈内注射のための動物施設に氷上で室温細胞。すべての気泡が排出されることを確実に31 G針、 - 27インスリン注射器にロード500〜1,000μLを。
- 尾の基部にマウスをつかみ、チューブ制止に配置します。
- 上に向けて静脈との緊張状態に尾を引いて、それが尾静脈に平行に挿入することにより、静脈に皮膚の下に針およそ1〜2 mmの滑空。ゆっくりと静脈に200μlのを追放。針が正確に静脈に挿入された場合、ボリュームが容易に流れることになる。そうでなければそこに抵抗となり、針が尾から削除され、正しく再挿入する必要があります。
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Representative Results
CAR T細胞を、EGFRvIIIのCARレトロウイルスベクター11での形質導入によって生成されます。このベクターは、MSGV1は、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）の長い末端反復配列、拡張ギャグ領域およびエンベロープスプライス部位（スプライスドナー、sdは、スプライスアクセプター、sa）の、およびウイルスが含まSFGtcLuc_ITE4ベクトル35から開発されたパッケージングシグナル（ψ）。マウスCD8TMと並行して、ヒト抗EGFRvIIIの一本鎖可変フラグメント（scFv）で139を含むEGFRvIIIのCARは、CD28、4-1BB、およびCD3ζの細胞内領域は、下流のレトロウイルスベクターのNcoI部位にクローン化した（ 図3） 。
形質導入の後、CAR T細胞を定量することができるし、フローサイトメトリーにより表現型。 EGFRvIIIのCAR T細胞は、ストレプトアビジン - フィコエリトリン（SA / PE）からなる2色のパネルを視覚化することができるbiotynlated EGFRvIIIの誘導多量体および抗CD3 FITC - 結合。文化や形質導入PROTの使い方ここで説明ocolsは、私たちは日常的にマウス脾細胞の55から70までパーセント（ 図4A）11の間でCARの発現を観察します。あるいは、是正もヤギ抗ヒト以前36に記載されているのF（ab '）2 -ビオチンプライマリおよびSA / PE二次抗体を用いて発現のために染色することができる。 CARのT細胞はさらに二色CARパネルの他の蛍光標識抗体を添加することによって表現型することができる。例えば、CD8およびCD4染色の20％がCD4 + T細胞（ 図4B）であるが、形質導入のCARの70％が、CD8 + T細胞であることを示している。この発現プロファイルとCARのT細胞は、容易に脳へのトラフィックおよび頭蓋内腫瘍を治療するために示されている。
| 体重 | ボリューム | |||
| 25グラム | 0.50ミリリットル | |||
| 0.48ミリリットル | ||||
| 23グラム | 0.46ミリリットル | |||
| 22グラム | 0.44ミリリットル | |||
| 21グラム | 0.42ミリリットル | |||
| 20グラム | 0.40ミリリットル | |||
| 19グラム | 0.38ミリリットル | |||
| 18グラム | 0.36ミリリットル | |||
| 17グラム | 0.34ミリリットル | |||
| 16グラム | 0.32ミリリットル | |||
| 15グラム | 0.30ミリリットル | |||
| 14グラム | 0.28ミリリットル | |||
| 13グラム | 0.26ミリリットル | |||
| 12グラム | 0.24ミリリットル | |||
| 11グラム | 0.22ミリリットル |
| D | D | ＃画分 | BED | SOC |
| 16.5 | 5.5 | 3 | 62 | GBM |
| 14 | 7 | 2 | 63 | GBM |
| 20 | 4 | 5 | 60 | GBM |
| 12 | 6 | 2 | 48 LGA | |
| 16 | 4 | 4 | 48 | LGA |
| 21 | 3 | 7 | 52.5 | LGA |
| 12 | 3 | 4 | 30 | メット |
| 16 | 2 | 8 | 32 | メット |
表2：臨床的に関連する生物学的に等価な放射線量を放射線量はBED = D [1 + dの/（α/β）]、D =総用量はd =分割線量、およびα/β= 2）に従って計算した。マウス宿主にWBIとして投与総用量は、番目の点で示されている電子配信分数の用量およびそれらの線量分画によってモデル化されるヒト用量。モデルの目的のために、BEDは、標準治療であるために悪性腫瘍も示されている。
図1：担癌マウスの治療と同時エキソビボ CAR生成のためのタイムラインケア療法の標準と全脳照射を4日間腫瘍移植（A）の後に始まる。この時間間隔の間に、CAR T細胞が生成され、培養されたex vivoで （B）を 、ホストコンディショニングのフルコース後に配信される。
図2：レイアウトと放射線照射のための設定を行います。X線は、所望の投与量（A）に応じて選択さ可変の持続時間で、320 40kVおよび10mAの線量測定に応じて配信される。 X線放射の焦点視野は狭いを2.5cmの領域である。 （C）は、X線ビームの一端から見た図、鎮静させた動物は、頭が最も高いX線強度の領域にあるようにグリッド（B）に従って配置されている。約4の動物は、このグリッドレイアウト（B、D）に応じてX線投与の1過程で照射下に置くことができる。リードチューブはWBI（D）曝露のみ頭を残して、身体を保護するために使用される。
図3：変更されたSFGtcLuc_ITE4レトロウイルスベクター、MSGV1は、CARのT細胞の形質導入および生成のために使用したザ。マウスCD8TM、CD28、4-1BB、およびCD3ζの細胞内領域を有するタンデムヒト抗EGFRvIIIの単鎖可変フラグメント（scFv）139を含むEGFRvIIIのCARインサートは、LTR（マウス幹細胞ウイルス（MSCV）長い末端反復に隣接している）。 CARインサートの上流に拡張ギャグ領域およびエンベロープスプライス部位（スプライスドナー、sdは、スプライスアクセプター、sa）の、およびウイルスのパッケージングシグナル（ψ）である。
図4：EGFRvIIIの是正はT細胞の表面で発現される形質導入後48時間は、T細胞がLEEKKGNYVVTDHC-K（ビオチン）-NH 2 /ストレプトアビジンPEからなる多量体を使用してEGFRvIIIの是正の表面発現について染色した。同じドナーからの形質導入T細胞はまた、陰性対照として染色した。データは、駅に陽性CAR T細胞（y軸）の数を示し発現は、60.9％（A）であることが判明したT細胞マーカーとしてCD3 +細胞にゲートPE結合EGFRvIIIのマルチマー（x軸）によってining。 CD4-PerCP標識-のCy5.5およびCD8-APCについて染色CARのT細胞が、それぞれ21.7％と70.9パーセント、（B）の発現プロフィールを示す。
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Discussion
ここに記載されている治療のタイムラインはケアの臨床標準をモデル化し、CAR養子療法のためにその効果を活用するために設計されました。 CAR T細胞の用量、TMZ療法、および放射線療法の投与は、in vivoで T細胞活性、リンパ球枯渇、および腫瘍殺傷を増強するように改変することができる。 TMZレジメンは、宿主骨髄破壊及び養子移入細胞の30の増加した膨張を得るために増加させることができる。したがって、SOCの殺腫瘍特性を回避、 - （6Gyの4）単一フラクション全身照射（TBI）さらに、TMZのlymphodepletive効果は低用量によって要約させることができる。ここに適用される放射線レジメンは60 Gyでの生物学的等価線量を模倣。しかしながら、画分分数投与回数は、他の臨床投与量（ 表2）を模倣するように調整することができる。重要なことは、SOCの我々のモデルは、外部ビーム放射線が腫瘍とMAに限局的に配信するのではなく、WBIの生物学的に同等の用量を利用rginsは、としては、多くの場合、臨床で利用され、従って、腫瘍に送達される放射線のより少ない用量および健康なマウス脳への毒性の危険性の増加につながる可能性がある。これらの制限にもかかわらず、しかし、WBIは前臨床設定で臨床放射線治療をモデル化するための一般に認められた手法である。
CAR T細胞の用量を増加または腫瘍殺傷および全生存率11の線量の影響を観察するために減少させることができる。さらに、治療および送達経路のタイミングは、有効性の違いを見るために修飾することができる。例えば、CAR T細胞が腫瘍部位での活性を確認するために頭蓋内に送達することができる。 CAR陽性T細胞の収率は、形質導入の効率に依存して変化し得る。成功した形質導入を確実にする一つの方法は、処置を通して、緑色蛍光タンパク質（GFP） - コントロールを行うことである。これを行うために、1 HEK293T 10cmのPDLプレートはがれにT細胞の単一ウェルのGFPトランスフェクションおよび形質導入のために割り当てることができる日3-5でGFPのためのn。形質導入効率における重要な因子は、ウイルス上清を添加するとT細胞活性化および増殖の程度である。我々は、培養培地へのConAを添加することによって達成されるT細胞活性化の手法の間の重要な相違点に注意して、それはCD3とCD28アゴニストモノクローナル抗体によって達成され、臨床設定で使用。後者は、日常的に患者のレトロウイルス形質導入CARのT細胞を生成するために使用され、また、マウスT細胞の形質導入に成功しているが、我々は、以前のConA刺激がより良く、より一貫性のある形質導入37につながっていることを決定した。また、全体的なCAR T細胞の収量は、ステップ5.18が実行されるときに基づいて変化することができることを観察した。あなたが悪いCAR T細胞収量が発生した場合、我々はすぐにステップ5.17の代わりに、5-6時間のインキュベーションのを待ってからステップ5.18を実行することをお勧めします。これは、形質導入の効率に影響を与える可能性があるが、ここで重要なのdifを観察していない私たちの研究でCAR表面発現でferences。
形質導入の後、CAR T細胞を定量化することができ、フローサイトメトリーにより表現型。私たちは、ストレプトアビジン - フィコエリトリン（SA / PE）で構成される2色パネルとのEGFRvIIIのCAR T細胞はbiotynlated EGFRvIIIの由来多量体及び抗CD3 - 結合染色。あるいは、是正もヤギ抗ヒト以前36に記載されているのF（ab '）2 -ビオチンプライマリおよびSA / PE二次抗体を用いて発現のために染色することができる。私たちは日常的にマウス脾細胞11の百分の55から70の間でCARの発現を観察します。我々は以前に、容易に脳へのトラフィックおよび腫瘍を治療することができ、このCARの発現プロフィールを有するT細胞の送達を示している。 TMZ-またはTBI誘発性リンパ球減少は、CAR陽性細胞の頻度とその全体的な抗腫瘍応答を増大、養子移入された細胞のクローン増殖を強化する。 CARのT細胞は、Aで末梢血を染色することによって、in vivoで追跡することができるppropriate四量体。これは、CARのT細胞の経時的生存およびCARのT細胞機能および持続ホストコンディショニングの効果を理解するために有用な技術である。ない四量体は、抗原受容体に対して使用できない場合あるいは、 エキソビボ蛍光レポーターは、CARのベクター構築物に含めることができ、またはCAR T細胞を標識することができるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）による投与の前に、in vivoで追跡した。
腫瘍モデル、免疫療法のプラットフォーム、およびSOCレジメンに応じて、養子療法またはワクチンと一緒に投与する臨床SOCが毒性をもたらすことができる。 TMZは、非特異的な細胞死滅をもたらすDNAアルキル化剤であり、投与量は、マウス宿主における体重減少および罹患率をもたらすことができる激化。高用量とWBIの長期化画分を水頭症になることができます。また、炎症作用の強いワクチンから、および/または養子T細胞応答が原因と罹患率につながる可能性が転送有毒なサイトカインの嵐。それは病的な動物の全身麻酔の影響を注意することも重要です。 TMZとWBIは著しい毒性を引き起こす場合、動物のみ2-（小さな放射線量を送達するための10分間鎮静させ、固定化する必要があるように、その後、ケタミン/キシラジンの用量は、死亡の危険性を減らすために20〜25％減少させることができる8 Gyで）。
ホスト·コンディショニングは養子移入を含む全ての免疫療法のプラットフォームのために重要である。免疫療法の臨床試験は、多くの場合、SOCのコンテキスト内で評価されたように、免疫療法の前臨床評価は、臨床シナリオを再現するには、この設定内で行う必要があります。ここではlymphodepletive及びCARのT細胞を用いた養子免疫療法によるSOCの殺腫瘍効果を活用する一例を提示する。このレジメンは、結合SOCの効果を評価するために、他の免疫療法のプラットフォームにも適用することができる強力なツールである。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10x concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 μm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/ml |
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がん生物学、問題96、腫瘍免疫療法、神経膠芽腫、キメラ抗原受容体、養子移入、テモゾロミド、放射線治療 View Video
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