Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Генерация CAR Т-клеток в усыновители терапии в контексте глиобластомы стандарт медицинской помощи

Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52397
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

Introduction

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенной первичной злокачественной опухоли головного мозга и приводит к летальному исходу. Хирургическая резекция в сочетании с неспецифической стандарт медицинской помощи химиотерапии и лучевой терапии не удается полностью устранить злокачественные клетки, в результате чего плохим прогнозом менее 15 месяцев у пациентов с этим заболеванием 1. В отличие от этого, иммунотерапия предлагает точный подход специально для ориентации опухолевые клетки, и, таким образом, имеет потенциал, чтобы служить в качестве весьма эффективного лечения платформе с уменьшенным риском побочного токсичности 2-4. Т-клетки инженерии экс естественных условиях, чтобы выразить химерных рецепторов антигена (автомобили) предлагают универсальный стратегии иммунотерапии опухолей. ЦАР формируются путем слияния внеклеточный вариабельный участок антитела с сигнальной молекулы одного или более внутриклеточный Т-клеток (ов), вместо полноразмерного главного комплекса гистосовместимости (MHC) -ограниченных Т-клеточный рецептор 5. Этот режим антитело-антиген, как ждут победитна позволяет реактивные антиген-специфические Т-клетки, чтобы распознавать и реагировать на опухолевых антигенов в отсутствие МНС и может быть адаптирована для практически бесконечного антигена репертуара.

CAR Т-клетки инженерии против различных опухолевых антигенов показали доклинические эффективность и высокую обещание в клинике 6-9. В частности, в контексте GBM, ориентации АВТОМОБИЛЯ Т платформа клеток рецептор эпидермального фактора роста вариант III (EGFRvIII), мутация опухоли конкретных экспрессируется на клеточной поверхности 10, как было показано, продлить выживание в глиомы мышей, несущих 11. Несмотря на универсальность, однако, клиническая польза CAR приемной терапии не были полностью реализованы, отчасти из-за опухоли связано иммуносупрессии и иммунной уклонения 12-16, а также проблемы в установлении и поддержании антиген-специфические Т-клетки в живом организме. Используя стандарт медицинской помощи (SoC) с иммунотерапии потенциально может преодолеть некоторые из этих лимитации, приводит к повышению эффективности в обоих доклинических и клинических условиях.

SOC для Пострезекционные GBM состоит из высоких доз темозоломида (ТМЗ), ДНК алкилирующим агентом 17, и облучения всего головного мозга (ИВБ) 1. Эти процедуры, как предполагается, быть согласованы с противоопухолевых вакцин с помощью повышающей регуляции опухолевого МНС выражения 18-20 и пролития антигенов мертвых опухолевых клеток 17,19,21,22. Действительно, добавление ТМЗ 20,23 или 18,24 ИВБ приводит к повышенной противоопухолевой эффективности иммунных основе процедуры в доклинических настройки. Кроме того, как много неспецифических цитотоксических химиотерапевтических, ТМЗ, как известно, вызывают системное лимфопения 25,26, которые могут быть использованы в качестве средства принимающей кондиционирования для приемных платформ терапии 27-29. ТМЗ-опосредованной lymphodepletion было показано, что повышение частоты и функцию антиген-специфических Т-клеток, что приводит к увеличению эффективности в adopный платформа терапия против внутричерепных опухолей 30. В контексте CAR терапии, lymphodepletion служит в качестве средства для кондиционирования принимающей стороны и уменьшения количества эндогенного супрессоров Т-клеток 31 и индуцирующий пролиферацию гомеостатической 32 с помощью пониженном конкуренции за цитокинов 33, таким образом, повышение противоопухолевой активностью 11,34. Учитывая синергетический отношения между GBM ШОС и иммунотерапии платформ, оценивая новые приемных терапии и платформы вакцины в контексте ШОС имеет решающее значение для привлечения значимых выводов относительно эффективности.

В этом протоколе мы опишем метод генерации и внутривенного введения мышиных EGFRvIII-конкретного автомобиля Т-клеток наряду с TMZ и ИВБ в мышей, несущих EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей (рис 1 для лечения сроки). Вкратце, CAR Т-клетки сделаны экс естественных условиях на ретровируса трансдукции. Человек эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки трансфицируют с использованием ДНК / липидный комплекс (содержащий вектор машину и PCL-Eco плазмиды), чтобы получить вирус, который затем используется для трансдукции активированных мышиных спленоцитов, которые собирали и культивировали в параллель. В ходе поколение автомобиля, мышиные хозяева, несущие EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей вводят фракционированного всего головного мозга рентгеновского излучения и системное лечение ТМЗ в дозах, сопоставимых с клинической SOC. CAR Т-клетки затем доставляются внутривенно lymphodepleted хозяев.

Следующая процедура описана в семи отдельных фаз: (1) Администрация Темозоламид для мышей с опухолями, (2) весь мозг Облучение опухоли мышей (3) трансфекции, (4) спленэктомия и Т-клеток Подготовка, (5 ) трансдукция, (6) Культура CAR Т-клеток и урожай, и (7) управление CAR Т-клеток в опухоли мышей. Эти фазы состоят из нескольких этапов, которые охватывают 6-7 дней и выполняются одновременно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол основан на экспериментальной конструкции, где 10 мышей обрабатывают 10 7 CAR Т-клеток в каждой. Это означает, что 10 8 АВТОМОБИЛЯ Т-клетки будут необходимы; выход должен быть завышены 5 х 10 7 -1 × 10 8 для учета потери жизнеспособности. Следующий протокол масштабируется для получения примерно 200 х 10 6 клеток. Затем клетки вводили внутривенно женского C57BL / 6 мышей с 9-й день, установленных сингенных EGFRvIII-положительных внутричерепными опухолями, разработаны на основе существующих KR158B астроцитомы или В16 линий клеток меланомы. Одновременно с автомобилем Т поколения клеток, опухоль мышей вводят клинически значимых доз lymphodepletive ТМЗ (60 мг / кг) и Институтом Всемирного банка (16,5 Гр).

Мыши были сохранены и выращивают в свободных от патогенов условиях в Университете Дьюка Медицинского центра (DUMC). Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными Университета Дьюка институтааль Уход за животными и использование комитета (IACUC).

1. Администрация Темозоламид для мышей с опухолями

Дни от 0 до 4:

  1. Рассчитать общее количество мышей, который будет введен и умножить это на 0,5, чтобы определить объем ТМЗ решения, необходимого (например, 30 мышей х 0,5 мл = 15 мл ТМЗ) и добавить 1,5 мл до этого объема для учета перетекания (16,5 мл TMZ ).
  2. Умножьте это общий объем на 3 мг / мл для определения веса лиофилизированного TMZ необходимости (например, 16,5 х 3 = 49.5 мг ТМЗ). Взвешивание это в 50 мл коническую.
    ВНИМАНИЕ: ТМЗ является токсичным при вдыхании, попадании внутрь и контакте с глазами, кожей и слизистой оболочки. Проконсультируйтесь с охраны труда учреждения и / или окружающей среде, здоровья и благополучия отдела рекомендаций по снижению риска заражения.
  3. Умножьте общий объем на 0,15, чтобы определить объем диметилсульфоксида (ДМСО), которые необходимы (например, 16,5 х0,15 = 2,475 мл ДМСО). Фильтр стерилизовать такой объем ДМСО (плюс дополнительные 2 мл для учета трансмиссионные) через 0,2 мкм фильтр в стерильную пробирку. Добавить 2,475 мл стерильной ДМСО к порошку ТМЗ.
  4. Поместите раствор ТМЗ / ДМСО в химический стакан с водой над горячей плите при 65 ° С в течение 10-15 мин. После того, как ТМЗ полного растворения, раствор должен стать бледно-желтого цвета; Если раствор становится розовым, то ТМЗ ухудшается, и новое решение должно быть подготовлено со свежим много TMZ.
  5. Рассчитать соответствующий объем стерильного физиологического раствора, необходимого путем умножения 0,85 от общего объема (0,85 х 16,5 мл = 14,025 мл физиологического раствора). Добавить 15 мл стерильного физиологического раствора к 50 мл коническую. В то время как ТМЗ растворяется в ДМСО, тепла солевым раствором до 65 ° С.
  6. Вихревой / ДМСО раствора ТМЗ, чтобы гарантировать, что порошок ТМЗ полного растворения и медленно добавляют подогретое физиологический раствор в / ДМСО раствора ТМЗ.
  7. Сразу же после приготовления, полностью загрузить 15 х 1 мл туберкулина SyringES ТМЗ решения для введения 4 дня, установленного с опухолью мышей.
  8. Повторите эту процедуру в дни с 1 по 4 на общую сумму пять ТМЗ администраций.

2. весь мозг Облучение опухоли мышей

Дни со 2 по 4:

  1. Включите рентгеновского излучателя и дайте ему прогреться до полного напряжения. Убедитесь, что соответствующий фильтр на месте и ввода нужного напряжения и текущих настроек (Рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: дозиметрии облучателя должны быть установлены заранее определить соответствующие параметры напряжения и сетка макета (2А, Б).
  2. Рассчитать продолжительность времени, которое необходимо, чтобы привести в 5,5 Гр рентгеновского облучения. Например, если Х-лучи доставляются в размере 2 Гр / мин, затем 2,75 мин необходимо доставить в общей сложности 5,5 Гр. Вход необходимости длительность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 2 приведены мыши ИВБ дозыой их клинические эквиваленты в организме человека. В контексте высококачественных глиомы, 60 Гр фракционированию WBI (2 Гр фракции, 5 дней / неделю в течение 6 недель) является клинический стандарт медицинской помощи, и мышиный эквивалент, используемый здесь, 16,5 Гр (5,5 Гр х 3).
  3. Подготовка свежий раствор кетамина / ксилазина для системного анестезии путем добавления 2 мл кетамина и 1 мл ксилазина к 17 мл физиологического раствора таким образом, что конечный раствор 10 мг / мл кетамина и 1 мг / мл ксилазина.
  4. Взвешивание мышей и управлять 10 мкл кетамина / ксилазина внутрибрюшинно на грамм веса тела таким образом, что животные получали дозу кетамина в дозе 100 мг / кг и 10 мг / кг ксилазина. Мыши должны быть полностью в отключке и заметно дыхание в течение 2 мин кетамина администрации / ксилазина.
  5. Для поддержания глазной влаги в седативных животных, мягко втирать небольшое количество искусственных слез мази на каждый глаз.
  6. Поместите седации мышей на сетке, так что головки позиционируются в области, которая получает наибольшее рентгеновского излучения винтенсивность (фиг.2В, С). Щит органы от шеи вниз с соответствующим размером ведущую трубу, чтобы заблокировать системную доставку X-лучей (рис 2D).
  7. Поместите расположенные мышей под рентгеновского луча таким образом, что лазерный обозначающий фокус на рентгеновского пучка в начале координат (0,0) на макет сетки. Начните доставку X-Ray.
  8. При подаче Рентгеновский удалим животных от облучателя и место на теплую грелку. Не дом седации животных с сознательными животных, пока животные не восстановили достаточно сознания, чтобы сохранить грудины отдохновение. После того, как животные могут поддерживать грудины отдохновение, место сознательные животных обратно в их соответствующих клетках.
  9. Повторите эту процедуру на 3 и 4 на общую сумму три фракционированных доз радиации.

3. Трансфекция

День -1:

  1. Подготовка D10 носитель путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 500 мл Дульбекко Мodified Eagle Medium (DMEM).
  2. Подготовка Т-клеток носитель (TCM), добавляя 5,5 мл L-глутамина, 5,5 мл пируват натрия, 5,5 мл несущественные аминокислоты и 5,5 мл pencillin / стрептомицин (ручка / стрептококк) с 500 мл среды RPMI-1640. Затем добавьте 550 мкл 2-меркаптоэтанола и 550 мкл гентамицина. И, наконец, добавляют 50 мл FBS.
  3. Урожай в пробирке, культивируемые клетки HEK293T и довести до концентрации 7,5 х 10 6 клеток / мл в D10 СМИ.
  4. Пластина 10 мл D10 медиа и добавьте 1 мл суспензии HEK293T клеток в каждом из 16 х 10 см поли-D-лизина (PDL) Плиты покрытием.
  5. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% СО 2.

День 0:

  1. Замените носитель с 10 мл свежего D10, по крайней мере 30 минут до трансфекции клеток.
  2. Определить количество векторной плазмиды, PCL-Eco вектор, липосомной трансфекции реагента, необходимого для трансфекции путем умножения общего количества пластин + 1 (16 + 1 = 17) 14,1 мкгплазмидный вектор (14,1 х 17 = 239,7 мкг), 9,9 мкг PCL-Eco вектор (9,9 х 17 = 168,3 мкг) и 60 мкл липосомальной трансфекции реагента (60 х 17 = 1020 мкл). Все реагенты должны быть комнатной температуры перед приготовлением растворов.
  3. Этикетка две трубки А и В. В трубе А, добавьте 239,7 мкг векторной плазмиды и 168,3 мкг PCL-Eco вектора (1,5 х 17) мл, с пониженным содержанием сыворотки модифицированной среде орла (RS-MEM). В трубе Б, добавить 1020 мкл липосомальной трансфекции реагента (1,5 х 17) мл RS-MEM.
  4. Инкубируйте А и В по отдельности в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Смешайте А и В вместе аккуратно (вихрь в течение 1-2 сек или инвертировать несколько раз) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре с образованием липидов / комплекса ДНК.
  6. Добавить липид / ДНК падение сложную стрелке, чтобы HEK293T клеток в 10 см блюдо.
  7. Выдержите при 37 ° С в течение 6-8 ч или на ночь (не более 24 ч).
  8. После 6-8 часов инкубации, заменить среду с 12 мл свежего TCM для вирусного производства. Это покрыло СМИбудет использоваться на 2-й день, как вирусный супернатант для Т-клеток трансдукции.

4. спленэктомия и Т клеточный препарат

День 0:

  1. Налейте 10 мл TCM в коническую 50 мл и место на льду для сбора селезенки.
  2. Жертвоприношение соответствующее количество животных СО 2 удушья и среднего обезглавливания: Место животных в клетке принимающей CO 2 при расходе 10-30% клетки объем / мин, в руководящих Американская ветеринарная медицинская ассоциация (не более 5 животных не может быть не приносится в жертву одновременно) до тех пор, дыхания прекращается и в течение двух минут после этого. Удалить животных из CO 2 камеры и обезглавить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один селезенка 6-12 недельных самок C57BL / 6 мыши получается примерно 4,5-5 х 10 7 спленоцитов. Здесь четыре селезенки будет собрано около 200 × 10 6 клеток.
  3. Положите мышь так, чтобы его правая сторона обращена вверх, испрей с 70% этанола. С помощью пинцета, возьмите тонкую складку кожи под левой грудной клетки и вырезать небольшой разрез с помощью ножниц. Отогните кожи, тщательно захватить тонкую складку брюшины щипцами, и вырезать небольшое углубление.
  4. Селезенка небольшой, удлиненные, темно-красный орган, который напоминает сплюснутый боб; деликатно захватить селезенки с пинцетом и акциза путем срезания окружающую соединительную ткань. Поместите вырезали селезенки в коническую, содержащей 10 мл TCM на льду.
  5. Налейте селезенки более сито сетка клетки 70 мкм с разбивкой по признаку пюре с тупым концом внутренней 5 мл шприц, чтобы создать один-клеточной суспензии. Не более двух селезенки должны быть разбиты на сито петли.
  6. Используйте небольшой объем TCM тщательно мыть сито следующий разбивку собрать все оставшиеся спленоцитов. Бассейн все разукрупненные селезенки в одной клеточной суспензии. Доведите конечного объема до 50 мл на один TCM стирки сбы вращаться на 300 мкг в течение 10 мин.
  7. Приготовьте раствор 1x буфера для лизиса путем добавления 5 мл буфера для лизиса 10x в 45 мл стерильной воды. Для устранения красных кровяных клеток, ресуспендируют осадок в 5 мл 1x буфера для лизиса в селезенке в 50 мл конические, хорошо перемешивая, осторожно пипеткой вверх и вниз. Если более 5 раздражительность, используйте 250 мл центрифужную пробирку. Поместите коническую центрифужную пробирку или в C водяной бане 37 ° С в течение 5 мин.
  8. Удалить реакцию лизиса из водяной бани и добавить TCM в соотношении 1: 1 с буфером для лизиса для нейтрализации реакции. Вымойте спиннинг в 300 мкг в течение 10 мин.
  9. Отберите супернатант и полностью ресуспендируют осадок в традиционной китайской медицине (2 мл / селезенка, 8 мл Всего за 4 селезенки) с помощью пипетки вверх и вниз.
  10. Количество клеток путем добавления 10 мкл клеточной суспензии в 190 мкл трипанового синего (1:20 разбавление). Умножьте полученную в одном из четырех сетчатых квадратов 20 х 10 4 х общего объема (8 мл) номер, чтобы получить общее количество клеток (например, 125 клеток х 20 х 10 4 6 спленоцитов).
  11. Развести клетки в концентрации 2 × 10 6 клеток / мл в TCM, с добавлением 2 мкг / мл конканавалин (ConA) и 50 МЕ / мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (чрИЛ-2). Таким образом, для 200 х 10 6 спленоцитов, добавить 92 мл средства массовой информации в 8 мл клеток, 200 мкг coña и 5000 МЕ рИЛ-2.
  12. Добавить 2 мл клеток в каждую лунку 24-луночных тканевых культур, обработанных пластин, таким образом, что 4 × 10 6 клетки в каждой лунке (например, 100 мл клеток потребуется примерно 4 пластины).
  13. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% СО 2.

5. Трансдукция

День 1:

  1. Рассчитать количество не тканевой культуры рассматриваются 24-луночных планшетах, необходимые для трансдукции путем умножения количества селезенки собирали 2 (8 пластин, необходимых для 4 селезенки).
  2. Затем вычислите необходимый объем рекомбинантный фрагмент человеческого фибронектина решения (RHFF)необходим для покрытия пластин путем умножения (общее количество скважин + 3) х 0,5 мл (8 пластин х 24 скважины = 192 + 3 = 195) х 0,5 мл = 97,5 мл.
  3. Подготовьте 97,5 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащего RHFF в концентрации 25 мкг / мл путем умножения суммарного объема на 25 мкг (97,5 х 25 = 2437,5 мкг). Добавить такое количество RHFF 97,5 мл PBS.
  4. Шерсть без тканевой культуры обрабатывают 24-луночных планшетах путем добавления 0,5 мл PBS / RHFF решение на лунку.
  5. Инкубируют в течение ночи при 4 ° С.

День 2:

  1. Кузов раствор PBS / RHFF от не-культуре ткани обрабатывают 24-луночных планшетах.
  2. Добавить 1 мл / лунку 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Удалить BSA, крепко переворачивая плиту. Промыть добавлением 2 мл PBS.
  4. Сбор вируса супернатант перенос носитель из каждого HEK293T PDL пластины в 250 мл центрифужную пробирку и спин 10 мин при 500 х г.
  5. Тщательно передачи вируса SUpernatant в свежем 250 мл центрифужную пробирку, будучи уверенным, чтобы не нарушить клеточный осадок, которые могли образоваться.
  6. Добавить свежий TCM к вирусным супернатантом, так что конечный объем 3 мл больше, чем количество, необходимое для RHFF покрытием скважин. Например, для 192 скважин RHFF покрытием, довести объем вирусного супернатанта с 192 мл + 3 = 195 мл.
  7. Удалить культивируемые спленоциты из инкубатора и ресуспендируют, осторожно пипеткой вверх и вниз 2 - 3 раза в каждую лунку. Переход к 250 мл конической. При использовании многоканальной пипетки, используя стерильный резервуар перед передачей поможет ускорить этот шаг. Граф, как описано выше, и спина при 300 мкг в течение 10 мин.
  8. Добавить чрИЛ-2 вирусной супернатанта при концентрации 50 МЕ / мл. Например, добавьте 50 х 195 = 9750 МЕ чрИЛ-2 до 195 мл вирусной супернатант.
  9. Ресуспендируют спленоцитов вирусной супернатанта на 1 х 10 6 клеток / мл
  10. Добавить 1 мл / лунку спленоцитов суспензии RHFF покрытием 24-луночных планшетах.
  11. Спин в течение 90 мин в соответствии со следующими настройками: 770 мкг, ускорение = 4, тормоз / торможение = 0, 32 ° C.
  12. Подготовьте TCM решение с 50 МЕ / рИЛ-2 мл. Например, приготовить раствор 200 TCM добавлением 10000 МЕ чрИЛ-2. Добавить 1 мл рИЛ-2 / TCM в каждую лунку после центрифугирования.
  13. Культура в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2.

6. CAR Т-клеток Культура и урожай

Дни 3 и 4:

  1. Если Т-клетки достичь> 80% слияния, клетки могут быть разделены (обычно это происходит в день 3 или 4 день). Чтобы разделить клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз в каждой лунке 2-3 раза, а двигаться 1 мл из каждой лунки в новые лунки свежего 24-луночного культурального-обработанной пластины. Затем добавляют 1 мл свежей TCM 50 МЕ / мл IL-2 в каждую лунку так, чтобы конечный объем составляет 2 мл во всех скважинах.
  2. Если клетки не достигают> 80% слияния, выполнить половину изменение медиа медленно пипетки с 1 мл среды из каждой лунки. Избегайте Disturbing клетки оседали на дно, удаляя СМИ. Добавить 1 мл свежей TCM, содержащей 50 МЕ / мл чрИЛ-2.

День 5:

  1. Ресуспендируйте CAR Т-клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз 3 раза в каждую лунку и перенести в 250 мл центрифужную пробирку. Спин клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
  2. Полностью аспирация супернатант, не нарушая гранул. Промывают один раз PBS, рассчитывать клеток, как описано ранее, и промывали PBS во второй раз. Типичный выход CAR Т-клеток составляет примерно 1 × 10 6 клеток на лунку (8 пластин х 24 скважин = 192 х 10 6 CAR Т-клетки).
  3. Ресуспендируют клеток в PBS в концентрации 5 х 10 7 / мл для инъекции 1 × 10 7 в объеме 200 мкг (например, для 192 × 10 6 CAR Т-клеток, ресуспендируют осадок промывали в 3,84 мл PBS).

7. CAR T Администрация ячейка мышей с опухолями

День 5:

  1. TranspoRT клетки на льду за животными для внутривенных инъекций. Добавить 500-1000 мкл в инсулиновый шприц с 27 - 31 г иглы, гарантируя, что все пузырьки исключен.
  2. Возьмите мыши в основание хвоста и разместить в трубе фиксатор.
  3. Потяните хвост в натянутом состоянии, с вены обращена вверх, и скользить иглу примерно 1-2 мм под кожу в вену, вставив его параллельно в хвостовую вену. Медленно высылать 200 мкл в вену. Если игла вставлена ​​правильно в вену, объем будет легко течь в; в противном случае будет сопротивление и игла должны быть удалены из хвоста и вновь установлена ​​правильно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CAR Т-клетки генерируются трансдукции ретровируса вектора EGFRvIII CAR 11. Этот вектор, MSGV1, был разработан на основе SFGtcLuc_ITE4 вектора 35, который содержит вирус мышиного стволовых клеток (MSCV) длинные концевые повторы, расширенный кляп область и конверт сайта сплайсинга (разъем доноров, SD, и сплайс-акцептор, SA) и вирусной сигнал упаковки (ψ). EGFRvIII АВТОМОБИЛЯ, содержащее человеческого анти-EGFRvIII вариабельный фрагмент одной цепи (ScFv) 139, в тандеме с мышиным CD8TM, CD28, 4-1BB и CD3ζ внутриклеточные участки, клонировали в ретровирусный вектор нисходящего сайта NcoI (фиг.3) ,

После трансдукции, CAR Т-клетки могут быть определены количественно, и phenotyped с помощью проточной цитометрии. EGFRvIII АВТОМОБИЛЯ Т-клетки могут быть визуализированы с 2-цветовой панели, состоящей из стрептавидин-фикоэритрин (SA / ПЭ) -conjugated biotynlated EGFRvIII полученных мультимер и анти-CD3 FITC. Использование культуры и трансдукции протocols описано здесь, мы обычно наблюдаем выражение автомобилем среди 55-70% мышиных спленоцитов (рис 4а) 11. В качестве альтернативы, автомобили могут быть также окрашивали дл экспрессии с помощью козьего-анти-человеческий F (аb ') 2-биотин первичной и SA / PE вторичные антитела, которые было описано ранее 36. CAR Т-клетки могут быть дополнительно phenotyped добавлением других флуоресцентно меченных антител к двухцветного CAR панели. Например, окрашивание CD8 и CD4 показывает, что 70% трансдуцированных ЦА являются CD8 + Т-клетки, в то время как 20% являются CD4 + Т-клетки (фиг.4В). CAR Т-клетки с таким профилем экспрессии, как было показано, чтобы легко трафика в мозг и лечить внутричерепные опухоли.

Таблица 1:. Темозоламид доза в расчете на массу животного темозоломида дозы были рассчитаны на основе суммарной дозе 60 мг / кг.

Вес тела Объем
25 г 0,50 мл
0,48 мл
23 г 0,46 мл
22 г 0,44 мл
21 г 0,42 мл
20 г 0,40 мл
19 г 0,38 мл
18 г 0,36 мл
17 г 0,34 мл
16 г 0,32 мл
15 г 0,30 мл
14 г 0,28 мл
13 г 0,26 мл
12 г 0,24 мл
11 г 0,22 мл
D d # Фракции КРОВАТЬ SOC
16,5 5,5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52,5 LGA
12 3 4 30 Встретил
16 2 8 32 Встретил

Таблица 2:. Клинически значимые биологически эквивалентные дозы облучения Дозы облучения были рассчитаны в соответствии с кроватью = D [1+ d / (α / β)], где D = общая доза, d = фракционированного дозы и α / β = 2). Общая доза вводится в ИВБ с мышиным хоста показана в плане ме дробные дозы доставленные и человеческая доза, которая моделируется этих фракций дозы. Для целей модели, злокачественные опухоли, для которых кровать стандарт медицинской помощи также показано на рисунке.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Срок лечения мышей, несущих опухоль и одновременно экс естественных поколение автомобиля стандарт медицинской помощи химиотерапии и облучения всего головного мозга начинается через 4 дня после имплантации опухоли (А). В течение этого интервала времени, CAR Т-клетки генерируются и культивировали экс виво (б) и поставляется после полного курса принимающей кондиционирования.

Фиг.2
Рисунок 2: Схема и параметры доставки излучения.Рентгеновские лучи доставляются в соответствии с дозиметрии 320 кВ и 10 мА, с переменной длительности выбранной в соответствии с желаемой дозы (А). Фокусное поле рентгеновского излучения узкой 2,5 см площадь. Седативные животных расположены в соответствии с сеткой (В) таким образом, что их головы лежат в области наивысшей интенсивности рентгеновского; (С) показан вид с одного конца пучка рентгеновского излучения. Около 4 животные могут находиться под облучателя в течение одного курса рентгеновского управления в соответствии с этой раскладки сетки (B, D). Ведущий трубки используется, чтобы оградить тело, оставляя только головы выставлены на ИВБ (D).

Рисунок 3
Рисунок 3: модифицированный SFGtcLuc_ITE4 ретровирусный вектор, MSGV1, был использован для преобразования и генерации CAR Т-клеток.EGFRvIII CAR вставку, содержащую человеческого анти-EGFRvIII вариабельного фрагмента одного цепи (ScFv) 139, в тандеме с мышиным CD8TM, CD28, 4-1BB и CD3ζ внутриклеточных регионах, в окружении мышиного вируса стволовых клеток (MSCV) длинные концевые повторы (LTR ). Выше по течению CAR вставки являются протяженной области кляп и конверт сайта сплайсинга (разъем доноров, SD, и сплайс-акцептор, SA), а вирусный сигнал упаковки (ψ).

Рисунок 4
Рисунок 4: EGFRvIII ЦАР выражены на поверхности Т-клеток через 48 часов следующих трансдукции, Т-клетки окрашивали для поверхностной экспрессии EGFRvIII машины, при мультимер, состоящий из LEEKKGNYVVTDHC-K (биотин) -NH 2 / стрептавидин-PE.. Untransduced Т-клетки от того же донора, также окрашивали в качестве отрицательного контроля. Данные показывают, числа дорожно-транспортных Т-клеток (Y-ось), позитивных по ГНАining по PE-конъюгированного EGFRvIII мультимера (ось х), закрытого на CD3 + клеток в Т-клеток маркера, где выражение было найдено, что 60,9% (А). CAR Т-клетки окрашивали на CD4-PerCP-Cy5.5 и CD8-APC показывают профиль экспрессии 21,7% и 70,9%, соответственно (В).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Лечение график описано здесь был разработан, чтобы моделировать клинический стандарт медицинской помощи и использовать его последствий для автомобиля приемной терапии. CAR Т-клеток дозы, ТМЗ схемы, и администрация лучевая терапия могут быть изменены для повышения в естественных условиях Т активности клеток, lymphodepletion и опухоли убийства. ТМЗ схемы может быть увеличена, чтобы получить хост myeloablation и повышенную расширение адаптивно переданных элементов 30. Кроме того, lymphodepletive эффекты ТМЗ может быть обобщены низкой дозы (4 - 6 Гр) с одним фракция общего облучения тела (TBI), таким образом обходя уничтожающие опухоли, свойства соц. Режим излучения применяется здесь имитирует биологически эквивалентной дозы 60 Гр; Однако, количество фракций и дробных доз могут быть настроены, чтобы имитировать другие клинические дозы (таблица 2). Важно отметить, что наша модель SOC использует биологически эквивалентные дозы Институтом Всемирного банка, а не дистанционная лучевая доставлен централизовано к опухоли и техниrgins, как это часто используется в клинике, и, таким образом, может привести к меньшей дозы радиации подаваемого в опухоли и повышенным риском токсичности до здорового мозга мыши. Несмотря на эти ограничения, однако, ИВБ принятой методике для моделирования клинической лучевой терапии в доклинических условиях.

CAR Т-клеток дозы могут быть увеличены или уменьшены, чтобы наблюдать эффекты, доза на убийство опухоли и общей выживаемости 11. Кроме того, сроки обработки и маршрута доставки можно модифицировать, чтобы увидеть различий в эффективности. Например, CAR Т-клетки могут быть доставлены интракраниально, чтобы обеспечить активность в месте опухоли. Выход автомобиля-положительных Т-клеток может варьироваться в зависимости от эффективности трансдукции. Один из способов обеспечения успешного трансдукции путем проведения зеленый флуоресцентный белок (GFP) -Контроль на протяжении всей процедуры. Чтобы сделать это, один HEK293T 10 см PDL пластина может быть выделено GFP трансфекции и трансдукции одной скважины Т-клеток в осыпип для GFP в дни 3-5. Одним из важных факторов эффективности трансдукции является степень активации Т-клеток и пролиферации при добавлении супернатанта вируса. Отметим важную расхождение между нашего метода активации Т-клеток, что достигается за счет добавления ConA к культуральной среде, и которые используются в клинической практике, достигнутый CD3 и CD28 моноклональных антител агонистов. Хотя последняя обычно используется для генерации пациентов антиретровирусные трансдуцировали CAR Т-клеток и также успешно в передаче мышиных Т-клеток, ранее мы определили, что Кон стимуляция приводила к улучшению и более последовательных трансдукции 37. Мы также отметили, что в целом CAR T выход клеток может изменяться в зависимости от того, когда шаг 5,18 выполняется. При плохом выход CAR Т-клеток, мы рекомендуем шаг 5,18 выполнении сразу же после стадии 5,17 вместо того, чтобы ждать 5-6 ч инкубации. Хотя это может повлиять на эффективность трансдукции, мы не наблюдали значительное DIFконференциях в поверхностной экспрессии автомобиль в наших исследованиях.

После трансдукции, CAR Т-клетки могут быть определены количественно, и phenotyped с помощью проточной цитометрии; Мы окрасить наши EGFRvIII АВТОМОБИЛЯ Т-клеток с 2-цветовой панели, состоящей из стрептавидин-фикоэритрин (SA / ПЭ) -conjugated biotynlated EGFRvIII полученных мультимер и анти-CD3. В качестве альтернативы, автомобили могут быть также окрашивали дл экспрессии с помощью козьего-анти-человеческий F (аb ') 2-биотин первичной и SA / PE вторичные антитела, которые было описано ранее 36. Мы регулярно наблюдать выражение автомобиль среди 55-70% мышиных спленоцитов 11. Ранее мы показали, что доставку Т-клеток с этим профилем экспрессии автомобиль может легко трафика в мозг и лечения опухолей. TMZ- или TBI-индуцированной лимфопения повышает клональной экспансии восприимчиво переданных клеток, увеличивает частоту CAR-позитивных клеток и их общего противоопухолевый ответ. CAR Т-клетки могут быть отслежены в естественных условиях путем окрашивания периферической крови с аppropriate Тетрамер; это полезная техника для понимания ав выживаемость клеток с течением времени и воздействия принимающей кондиционирования на функции клеток CAR T и настойчивости. С другой стороны, если ни один тетрамер не доступен для рецептора антигена, флуоресцентные репортер может быть включен в машину векторной конструкции, или автомобиль Т-клетки могут быть помечены экс виво с карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира (CFSE) перед введением для отслеживания в естественных условиях.

В зависимости от модели опухоли, иммунотерапия платформы, и SOC режима, клиническая SOC вводить вместе с приемной терапии или вакцин может привести к токсичности. ТМЗ является ДНК алкилирующий агент, что приводит к неспецифической клеточной гибели, и усиление дозы могут привести к потере веса и заболеваемости в мышиных хостов. Высокие дозы и длительные фракции Институтом Всемирного банка может привести к гидроцефалии. Кроме того, воспалительные эффекты от сильного вакцины и / или адаптивно перенесенных Т-клеточных ответов может привести к заболеваемости в связи стоксичные цитокинов бури. Важно также отметить, эффекты анестезии на системную болезненных животных. Если ТМЗ и ИВБ привести к значительным токсичности, то кетамин / Ксилазин дозы могут быть уменьшены на 20-25% снизить риск смертности, как животные должны быть только в отключке и иммобилизованных в течение 10 мин для доставки малых доз радиации (2- 8 Гр).

Хост кондиционирования имеет решающее значение для всех иммунотерапии платформ, которые включают в себя приемные передачу. Как иммунотерапия исследования часто интерпретируются в контексте ШОС, доклинические оценка иммунотерапии должно быть сделано в течение этого параметра резюмировать клинического сценария. Мы приведем здесь один пример усиливая lymphodepletive и уничтожающие опухоли, последствия SOC с приемными терапии с использованием CAR Т-клеток. Этот режим является мощным инструментом, который может быть применен к другим платформам иммунотерапии оценить влияние комбинированной SOC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

Tags

Биология рака выпуск 96 иммунотерапии опухолей глиобластома химерного рецептора антиген приемный перевод темозоломид лучевая терапия
Генерация CAR Т-клеток в усыновители терапии в контексте глиобластомы стандарт медицинской помощи
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Riccione, K., Suryadevara, C. M.,… More

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter