在对小鼠胚胎子宫内心脏番茄凝集素注射到计肾血流量

Abstract

形成和发展肾脏血管（除了肾小球）灌注大大充分研究。作为脉管经由血管生成的发展（其为分支大血管的）和血管（ 从头血管形成），如树脂管型， 在体内超声成像，和显微解剖灌注映射技术在证明之间的亲密关系被限制胚胎内这两个过程和显影肾结构。在这里，我们描述了在小鼠胚胎在子宫内的心内超声引导FITC标记番茄凝集素显微注射的方法，以评估肾灌注的个体发育。番茄凝集素（TL）被灌注在整个胚胎和肾脏收获。组织中共同染色关于各种肾结构，包括：肾祖细胞，肾单位的结构，输尿管上皮细胞，和血管。起始于E13.5大口径血管灌流，但是周边船只仍unperfused。由E15.5和E17.5，小末梢血管以及肾小球开始变得灌注。这个实验技术对于胚胎发育过程中学习脉管和血流的作用是至关重要的。

Introduction

在胚胎发育两个分立的，但同时，血管过程发生：血管生成，该过程从一个主要的预先存在的血管，和血管生成，这是一种新形成血管的来自住宅内皮祖^1,2-由此容器增长。分别，前者是同义的血流量，而后者被认为主要是发生在没有它。

同时，以血管形成，肾脏祖细胞的合成，增殖和分化周期性和动态的过程开始展开上9.5天胚胎（E9.5）。在这一点上输尿管芽（UB）侵入背侧到包围后肾间质（MM），并继续直到出生^3。反复分支UB进入快速冷凝后肾间质帽开始肾脏的功能单位，肾的形成。随着每一代新UB和NEPH的罗恩，老一辈流离失所到内皮层和髓质的地区，在那里他们再进行内主要血管密集的环境中进一步成熟和分化。就证明了德雷斯勒等人 ^3，此胚胎过程是由感应信令沉淀，如UB和MM，和细胞外因素^3-6无数之间的串扰。最近的两个研究发展胰腺内的细胞外因素和肾脏包括氧张力和血流量^7,8。后者将在更详细地相对于肾脏发育中讨论如下。

以暴露所述感应作用血流可能起着肾祖细胞的分化，以及在其他器官的过程，胚胎血流映射的精确和准确的方法是必要的。

计量血流的替代方法包括微升的处方trasound成像及树脂注塑^9,10。决定性，这些模式已经被证明是固有地缺乏其能力，以同时地揭开血流之间的时间和空间的并置和干细胞的分化。树脂管型，例如，提供成人组织中血管形成图案的一个有效的模型，然而，在未成熟的血管，如与胚胎的时间点，容器是非常不发达和漏。因此，树脂注塑未能微小的，常常多孔，船内举行。

对于这些明显的障碍，除其他外，我们选择了把超声引导体内心内胚胎番茄凝集素（TL）显微注射到我们的肾发展的调查工作。在此过程中，我们利用超声波探头向同步引导装入微量针填充有2.5微升的TL溶液注入小鼠胚胎在E11.5，E13.5，E15.5和E17.5的时间点左心室。 E170.5是最新的发育年龄为针是没有强大到足以穿透更发达的胚胎。

这种显微注射方法的优点是丰富的。超声引导下注射允许注射针的胚胎左心室内精确定位，被动和控制驱逐溶液进入动物，对心脏的损害最小和周围组织的心脏跳动，并避免突发性心脏衰竭而死亡胚胎前全身灌注。与使用FITC标记TL的，任何灌注脉管将保持沿着其内皮顶膜的标志物。与免疫相结合，利用粘附分子（CD31，血小板内皮细胞粘附分子）和其他各种血管标记，我们能够清楚地灌注和未灌注血管区分，以及表征周围组织中的任何异常染色。

Protocol

注：匹兹堡机构动物护理和使用委员会的批准大学的所有实验。

1.制备超声仪器显微注射和胚胎

1. 建立阶段，安装，和探针（ 图1）以及外科手术器械（ 图2）。地方的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（pH7.4）的在37℃的暖浴。完全填充微注射针与矿物油，用1ml注射器附连到第二柔性地下25针，通过其基极。
2. 固定针到旋转支架臂上，与矿物油溶液空针。重新填充2.5微升的TL解决方案。确保没有气泡注射针中存在。旋转针手臂朝着墙，离舞台。
3. 通过异氟醚持续输注麻醉孕妈妈在麻醉室。当妈妈呈现昏迷，麻醉转移到鼻管放置在C舞台audal侧，并与炉鼻的鼻管仰卧位的地方母亲以允许延续的完全麻醉状态。
4. 磁带肢体45°角，或手和脚休息和放置上层建筑ECG /温度显示器标签。重要的是，在怀孕的坝被连续监测，以确保麻醉足以并向眼睛软膏施加到降低干燥。
5. 申请脱毛产品横跨母亲的下腹部，轻轻地用干棉签擦去，然后再次用70％的乙醇饱和棉签除去任何过量的产物和头发。确保现场切口（ 图3）清洁腹部皮肤关闭所有的头发。
6. 执行对孕妈妈用细手术镊子和剪刀剖腹探查术。请注意，以避免削减任何重大的血管或脏器。使第一，表皮直切口1.5-2厘米以上的阴道和继续削减对肋骨的approximat伊利2-3厘米。露出皮下膜，找到白线（“白线”）（ 图3），并切平行于初始切口，沿着相同的长度，以露出内部的内脏器官和子宫saccules。

2.提取胚胎

1. 使用6英寸棉签涂抹机动母亲和胚胎。轻轻推动（不要用力）对皮肤敷贴操纵第一胎出切口开放。提取第一胚胎球囊后，轻轻地，慢慢地，并到母亲的外部拉子宫角的其余部分。避免因切口在这个阶段拉肠或其他器官。
2. 量化胚胎和轻轻地放在左宫角回妈妈。然后开始把右侧子宫角回母亲开始从喇叭阴道胚胎球囊最远和向下移动。继续，直到只有两个胚胎仍然暴露（ 网络连接古尔4）。最后，在上述的柱，并平行的位置胚胎切口线，作为识别不切断子宫循环。
3. 放置粘土块和位置手臂和身体，以及腿和尾部之间。确保粘土表面大约级别与开腹手术切口。湿窗孔的培养皿37℃PBS。
4. 把握延伸钳子用右手和有孔培养皿左手（平行于胚胎开窗），并通过开窗术带来封闭镊子〜5厘米，从培养皿的顶部。打开钳完全没有撕裂开窗网。
5. 操纵手以上的胚胎和视线集中在这两个胚胎saccules。如果没有（或轻度）触摸saccules与开窗啮合或镊子，透过缝隙滑到他们并设置培养皿到母亲的腹部。用钳子还在延续，操作有孔的网状座位它放在一边，并在每个胚胎的基地（ 图5
6. 下一步，将装有墙培养皿中的蓝色橡胶，而不会挤压或伤害胚胎（ 图6）。确保黏土块坚决平衡培养皿中，胚胎，以及含有橡胶墙。最后，填充培养皿用37℃的PBS中直至胚完全淹没（ 图6），同时控制用于 ​​在有孔啮合泄漏。

3.注射程序

1. 较低的注射阶段与母亲和胚胎向下使用的Z-电平调整旋钮（ 图1），然后旋转注射针及安装臂，并直接与超声波探头排队，以针半厘米的左侧和下探针尖端（ 图7） 。推针臂（未针）45°远离探头。要小心，不要打了菜或超声探头的针尖。
2. 提高注射阶段回到原来的高度，用超声波P长袍的正上方胚胎探头必须稍微淹没，并在3-4毫米的胚胎组织。利用X＆Y阶段调节旋钮（ 图8），修订胚/妈妈/舞台上的地位，有系统地找到跳动胚胎心脏。
3. 直接超声波屏幕的中心观察到黑中心目标标记绘制（*）。找到左心室（最好）或中庭采用X＆Y级调节旋钮（ 图8），然后抬高或使用旋转旋钮，在舞台上通过超声波屏幕上的黑中心标记精确定位注入目标降低的阶段。
4. 使用X级调节旋钮，将胚胎到右侧，关闭超声波屏。重新定位显微注射针和臂回原位，半厘米的距离和90°的超声探头（ 图7）。
5. 用显微注射装入调节旋钮（ 图9C-G）的位置的针与尖端清楚人igned与中心标记。调整喷射角（使用旋钮在图9C和EG），并且X，Y，和微针的Z-载体，以确保针尖被聚焦在正确的平面。仅仅使用了“注入”旋钮（ 图9F）收回显微注射针，注意不要调整其他尺寸。
6. 同样，使用单独的X微调阶段旋钮招回胚胎探头下，用目标正好在超声屏幕上的中心标志。确保左心室现在正好在相同的X，Y和Z平面。
7. 接着，只用“注入”的显微注射调节器架，慢慢穿刺胚胎与显微注射针和逐渐使前端进入左心室。注满2.5微升TL溶液进入左心室或直到空的警告提示音，通过举办“空”，挖掘“补”一次（ 图2A和B）。此时注射观察影子从它进入心脏腔室中的TL（ 图10）的针的尖端发出。相反，快速收回注射针旋转的显微注射的“注入”按钮（ 图9F）安装在注射完成。
8. 继续到下一个胚胎，然后重复此步骤如下这一系列的步骤剩余的胚胎，最后将胚胎最终回大坝的腹部。改用麻醉室中，轻轻移动的母亲在这里15分钟从最后一次注射时间。

4.收获胚胎及分析

1. 通过颈椎脱位牺牲大坝。展开开腹手术切口容易地从母亲子宫中删除角。保持内子宫囊的胚胎。将在PBS冷冻胚胎。
2. 从解剖子宫的胚胎囊（如果进行基因分型需要收集组织），并把整个胚胎我ñ4％多聚甲醛（PFA）过夜，然后到30％蔗糖过夜，冻结在低温恒温器切片中。然后切冷冻切片，并将其放置到幻灯片免疫组化分析。任选地，使用的组织为通过脱水在100％的甲醇，在4％PFA以下定影整个安装。
3. 免疫组化分析，将进入冰冻切片PBS去除十月然后方框，用10％正常驴血清的部分30分钟。然后添加PECAM一级抗体以1：100稀释过夜，在4℃。第二天，洗涤载玻片中的PBT 3次，每次10分钟，并添加驴抗鼠594仲和孵育1小时，在室温。
   注：这是一个非常苛刻的技术，需要超和显微注射的优化和协调。有一个非常陡峭的学习曲线，与此相关的技术，需要四到六周注射辅导就会有一个精通之前。

Representative Results

血管的形成先于肾脏发育流

大多数胚胎组织（包括肾脏）中包含的致密脉管（包括unperfused和灌注），即使是在早期胚胎的时间点。到肾脏发育中更好地衡量和分析血流我们利用在宫内胚胎心内显微注射的方法。与使用一个高分辨率超声在E11.5通过E17.5识别胚胎心脏，并按照通过剖腹提取和单一子宫球囊的曝光，我们能够注入2.5微升TL的（异硫氰酸荧光素素（FITC）缀合）。

我们已发现最大的成功注入E13.5和E15.5胚胎的时间点，以约〜80％的成功率提高到90％之间。由于相对不成熟心脏的E11.5的存在，并在E17.5的存在密集的软骨和骨形成的，外围的Ti我点是比较困难的注入，与成功相比于中间胚胎时间点的概率相当低。可以预期，至少约50％和〜30％的成功率与E11.5和E17.5的时间点，分别。

通过共标记的组织与PECAM（CD31），通用内皮标志物，我们能够荧光血管和组织定性分类为三组：灌注脉管（PECAM阳性TL阳性），unperfused脉管（PECAM阳性），以及异常灌注结构（TL阳性）。这个特定的染色模式允许我们灌注和未灌注（ 图11）的区域之间的空间上区分。

在E11.5，我们发现，灌注血管封装显影肾脏在幅状图案，而无需实际渗入器官（ 图12B）。由E13.5，大血管灌流有一些较小辅助船只TL（ 图12C）染色。染色也可以看到整个部分的输尿管上皮，这可以是从肾小球那些已经灌注或由于早期胚胎血管的固有泄漏。由E15.5主要血管灌注，还可以观察到但是大量肾小球保持在TL染色，这表明显著滤波发生（ 图12D）。此外，在这个时间点的一些出现灌注小口径血管，虽然外肾区的一个显著比例似乎缺乏血流。最后，然而，由E17.5大多数肾灌注除了肾区，这是主要是缺乏灌注（在PECAM阳性血管然而密实）从而表明在周边区域的情况下的血管生成的血管系统。小口径血管包含TL和灌注肾小球的平均数目有显着的折痕相比较早的时间点（ 图12E）。

图1，超声探头，手术阶段，显微注射系统，铁路系统，以及ECG /温度显示器基本设置。

图2。必要的手术设备，解决方案和设备。（A）棉签涂抹。 （B）延长（环）镊子。 （C）手术剪。 （D）钝尖镊子。 （E）细镊子。 （F）显微注射针（Origio，＃C060609）。 （H）的注塑/填控制器。 （I）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。 （J）的矿物油（Sigma Aldrich公司）。

图3。一个2厘米的剖腹手术对麻醉的母亲进行，露出皮下组织层（腹壁）子宫的上方。利用手术剪刀和细镊子，露出白线并平行于表皮切割切口。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4。通过剖腹手术切口1-2 E15.5子宫saccules提取和曝光。 请点击此处查看大图版本的身影。

图5。子宫暴露通过saccules狭缝中使用扩展钳窗孔培养皿指导。窗孔啮合座位舒服地在saccules基地。

图6。蓝收容壁放置到子宫saccules的右侧。培养皿装有37℃的PBS中直至胚胎和收容壁被完全淹没。安全地放置在手臂和身体，腿和尾巴之间的培养皿/胚胎粘土块。

图7。注射系统positio奈德半厘米到左边和下面，以及90°的超声探头。

图8;阶段的X和Y调整机构。

图9.清空/填充装置，显微注射系统，舞台安装。（A）填写按钮。 （B）注入按钮。 （C）圆针角度调节旋钮。 （E）精细X调节旋钮。 （F）的 “注射”旋钮。 （G）课程X调节旋钮。 （H）阶段循环高度调节旋钮。

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图10。E15.5的心内注射TL。针尖超声图像定位心腔中，TL的解决方案是由黑色的阴影表示在两个室。心包及心包腔很容易区分。

图11，灌注，unperfusion和异常染色看出端倪之间的区域。第一个面板显示PECAM染色。中间的面板显示TL染色过的组织完全一样的区域。输尿管芽是异常染色;大血管被白色虚线包围。最后的面板是合并。白色箭头指示血管渗漏，和灰色箭头表明对一个容器中的过渡变得灌注。黄色代表结构完全灌注血管。OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看图的放大版本。

图12.胚胎，肾灌注个体发育进行了研究。（A）所有E11.5胚胎灌注，与持有TL头部和尾部区域内非常周围血管。 （B）血管灌流，看到周围，但没有纳入在E11.5在网络状花纹的肾脏发育，也有相当大的量染色弥漫在这一点上。 （C）E13.5肾脏表示主要，大口径血管灌注在整个肾脏（白色和黄色箭头），灌注在肾区（白色虚线）缺席。 （D）E15.5肾脏显示整个小口径灌注，外周血管（黄色箭头），在一些肾小球（白色箭头），并再次缺乏灌注在外围肾壁炉。 （E）E17.5肾脏显示肾小球各地（白色箭头）广阔的灌注和小口径血管（黄色箭头）。在肾区是从肾脏在这个放大的其余部分没有区别。 请点击此处查看图的放大版本。

Discussion

注射麻醉和时间框架

与关于母亲的麻醉，这是至关重要的，以保持气流不变（2-3升/分钟），并在低的PSI。镇静药流必须在约1.75-2升/分举行。同时，时间安排在注射发生必须密切监测和控制与每个垃圾。对于每一个垃圾注射过程应保持在45分。这一时限是极为重要的实验，因为每个胚胎必须保持恒定，正常的心脏速率的范围内，以促进在整个身体和感兴趣器官受控和恒定的灌注。我们已发现，延长注射导致胚胎之间可疑的结果和波动灌注模式和降低成功注射（ 即，慢心脏速率，心脏死亡）的速率。最后，在最后一次注射垫料内后，有必要允许大约15分钟前，胚胎收获，方便每个胚胎中适当，充分灌注。

程序上的治疗和护理胚胎

期间提取的胚胎中，我们已经发现成功注射是由经常参加到整体健康和子宫内膜和胚胎的完整性胚胎提取期间完成的更大的速率。使用细腻棉签施用器（用PBS饱和的）操纵和操纵子宫囊和saccules是必须确保在整个过程中的母亲和胚胎的生存。首先，为了确保子宫和胎盘的物理完整性正确维护是重要的。避免被扭曲的saccules在于将阻碍血液流向胚胎或导致在供应血液流向胎盘血管显著破损的方式。这可以通过提取maximu来实现1-2胚胎米的时间（除非提取整个子宫囊为初始计），并通过在胎盘的基部定位喷头远离主要血管。

胚胎注射部位的位置

引导显微注射针在正确的位置与超声波机也是每次注射尝试是至关重要的。仔细必须注意对中央标记左心室的定位和定心。在此之后，针必须位于和精确地集中在中心的标记，以及对齐于相同的X和Y计划针和注射部位。一旦这个完成之后，慢慢地吸取针尖接近注射部位和避免施加不必要的压力到心包囊和心脏。这是通过使针穿过组织层逐渐传递，而不是强制的针的通道，通过它们进行。在注射，这也是很重要的升OOK出去黑影从针尖（ 图10）所产生的。这表明在TL溶液填充心室。如果针尖处于正确位置时，影子要不断出现和消失作为TL被喷射到主动脉。但是，如果在心包腔似乎充盈，这表示该针是偏离目标左心室和对TL溶液填充包围心脏的心包腔。这是一个常见的​​错误，很容易被重新定位注射针在其X和Y平面纠正，与正在发生的针仍胚胎内的任何细微的调整。避免提取从胚胎针在这个阶段。

超声引导下的体内注射的限制

本质上，超声显微注射拥有一些基本的技术限制。首先，在显微注射针容积容量限制注射至E17.5小鼠的年龄范围。 2.5微升的TL溶液已被证明在我们的研究中，以完全地灌注胚胎高达E15.5。然而，就按照此时间点上，TL血容量比变得微不足道并稀释至有效标记外围肾血管内皮细胞膜。因此，血液流动的减少画面出现在稍后的时间点注射。此外，骨和软骨中的胚胎的形成创造了针尖的天然屏障，从而导致延长喷射时间和频繁的裂缝在针头。这些限制可通过利用一种新的注射系统具有更大的针的强度和体积的能力来克服。

替代胚胎血流量映射技术

迄今为止，映射胚胎小鼠血液流动的替代方法包括实施树脂塑像，免疫组化和高resolut离子超声成像。作为树脂铸件（具有先进成像技术的集成）是目前最流行的选择，这将在下面进一步详细地讨论。树脂石膏允许创建产后器官内流动的精确三维表示。然而，收效甚微已曾与成像产前肾组织因多孔血液血管和限制分辨率。相比较而言，缀合的TL污渍使粘合于内皮细胞膜抗原，导致更高的精确度。在其他情况下，树脂浇铸粘度过早地截断流入肾小球血管和微小的毛细血管床，在更高的放大倍率创造研究性限制。在较低的放大倍率，这种技术显然是可行的，在建立流动模式相对于发展中地区。相反地​​，TL允许相对于发育结构血流在细胞水平的高分辨率分析。

ENT“>未来的应用和方向

我们的数据表明，血液流动和氧合与问候的关键因素，肾祖分化。为了进一步阐明自己的肾发展中的作用，今后的调查必须划定沉淀这种生理过程中潜在的解剖机制，以及研究转录信号通路介导这种现象为好。一个假设，关于架桥现象与机制之间的差距，是平滑肌细胞和周细胞聚集在策划血流量的瞬时截断来发展器官的干细胞发挥地区作用款式。为了测试这一点，进一步免疫荧光染色和分析必须侧重于这些细胞类型在肾区边界进行。在信号通路潜在的未来的调查方面，我们想探讨低氧诱导因子和角色冯林道Hippen信号通路。这两个基本上都被牵连整个文学发挥着重要的作用感应干细胞的区域（主要是认为是缺氧）和分化领域内保持缺氧和氧化环境（地区氧合最需要的），分别为。此外，我们想询问在介导血管生成和血管的整个过程肾脏血管发育促红细胞生成素（EPO）的作用。 EPO是一种糖蛋白，肾播放内皮分化和维持关键作用。它在血液介导的内皮细胞分化的主要作用是未知的。最后，我们想在体内显微注射实验血管扩张化合物进行进一步加强这些调查的合法性。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10