Abstract
La formazione e la perfusione di sviluppare vasi sanguigni renali (a parte glomeruli) sono molto poco studiato. Come vascolare si sviluppa attraverso l'angiogenesi (che è la diramazione dei vasi) e vasculogenesi (de novo formazione dei vasi), tecniche di mappatura di perfusione, come calchi in resina, in vivo imaging ad ultrasuoni, e micro-dissezione sono stati limitati a dimostrare le relazioni intime tra questi due processi e le strutture renali in via di sviluppo all'interno dell'embrione. Qui, descriviamo la procedura di in utero intra-cardiaca ecoguidata FITC-etichettati pomodoro microiniezioni lectine su embrioni di topo per valutare l'ontogenesi della perfusione renale. Pomodoro lectina (TL) è stato perfuso tutta l'embrione e reni raccolto. I tessuti sono stati co-colorate per varie strutture renali, tra cui: i progenitori nefrone, strutture nefrone, ureterale epitelio, e vascolare. A partire da E13.5 grandi vasi di grosso calibro sono stati perfusi, tuttavia periferichenavi rimaste unperfused. Con E15.5 e E17.5, piccoli vasi periferici e glomeruli iniziato a diventare perfusione. Questa tecnica sperimentale è critico per studiare il ruolo della vascolarizzazione e del flusso sanguigno durante lo sviluppo embrionale.
Introduction
Durante lo sviluppo embrionale, due processi vascolari discreti, ma simultanei avvengono: angiogenesi, il processo mediante il quale una nave cresce da un vaso, e vasculogenesi pre-esistente, che è una formazione de novo di navi da residenziali progenitori endoteliali 1,2. Rispettivamente, il primo è sinonimo di flusso sanguigno, mentre il secondo è pensato avvenire sostanzialmente in assenza di esso.
Simultanea di formazione dei vasi sanguigni, un processo ciclico e dinamico della sintesi progenitrici delle cellule renali, la proliferazione e la differenziazione comincia a svolgersi il giorno embrionale 9.5 (E9.5). A questo punto la gemma ureterale (UB) invade dorsale in circostante mesenchima metanefrico (MM), e continua fino alla nascita 3. Ripetuto ramificazione della UB in rapida condensazione metanefrico tappo mesenchima inizia la formazione delle unità funzionali del rene, nefrone. Con ogni nuova generazione di UB e nephron, le vecchie generazioni sono collocate in regioni corticali e midollari interni, dove poi subiscono ulteriore maturazione e differenziazione all'interno di ambienti prevalentemente vascolare-densi. Come evidenziato da Dressler et al. 3, questo processo embrionale viene precipitato mediante segnalazione induttivo, come crosstalk tra UB e MM, e una miriade di fattori extracellulari 3-6. Due fattori extracellulari recentemente esaminato entro il pancreas e reni in via di sviluppo includono tensione di ossigeno e il flusso di sangue 7,8. Quest'ultimo sarà discusso in maggior dettaglio nel seguito con riferimento allo sviluppo del rene.
Per esporre il ruolo induttiva che il flusso di sangue potenzialmente gioca nella differenziazione delle cellule progenitrici nefrone, così come in altri processi organogenesi, metodi precise ed accurate di mappatura del flusso sanguigno embrionale è imperativo.
Metodi alternativi di misurazione del flusso sanguigno includono la prescrizione di ultrasound immagini e resina calchi 9,10. Conclusivamente, queste modalità hanno dimostrato di essere intrinsecamente carente nella loro capacità di svelare contemporaneamente giustapposizioni temporali e spaziali tra il flusso di sangue e di differenziazione delle cellule staminali. Calchi in resina, per esempio, offrono un valido modello di patterning nave nei tessuti adulti, ma in vasi immaturi, come ad esempio con punti di tempo embrionali, le navi sono gravemente sottosviluppati e perde. Pertanto, la resina getta non riescono a tenere all'interno dei vasi piccoli, spesso porosi,.
Per questi ostacoli apparenti, tra gli altri, abbiamo scelto di integrare ecoguidata in vivo intra-cardiaca embrionale lectina pomodoro (TL) microiniezioni nelle nostre indagini di sviluppo del rene. In questa procedura utilizziamo una sonda ad ultrasuoni per guidare in modo sincrono una micropipetta ago montato riempita con 2,5 ml di soluzione TL nel ventricolo sinistro di embrioni di topo in punti E11.5, E13.5, E15.5 e E17.5 tempo. E17.5 È l'ultima età evolutiva come gli aghi non sono abbastanza forti per penetrare l'embrione più sviluppato.
I vantaggi di questo metodo sono abbondanti microiniezione. Microiniezione Ultrasound-guida permette il posizionamento preciso di un ago per iniezione nel ventricolo embrionale di sinistra, espulsione passiva e controllata della soluzione nel cuore pulsante dell'animale, il minimo danno al cuore e tessuti circostanti, e la prevenzione di improvvisa insufficienza cardiaca e morte embrione prima della perfusione tutto il corpo. Con l'uso di un TL FITC-marcato, qualsiasi vascolarizzazione perfuso manterrà il marker lungo il suo endoteliale membrana apicale. In combinazione con l'immunoistochimica, utilizzando pecam (CD31, Platelet endoteliale molecola di adesione delle cellule) e vari altri marker vascolari, siamo in grado di distinguere chiaramente tra navi perfuso e non-perfusione, nonché caratterizzare qualsiasi colorazione anomala dei tessuti circostanti.
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Protocol
NOTA: L'Università di Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee ha approvato tutti gli esperimenti.
1. Preparazione degli strumenti Ultrasound-microiniezione e embrioni
- Impostare palco, monte, e sonda (Figura 1), così come gli strumenti chirurgici (Figura 2). Luogo soluzione tampone fosfato salino (PBS) (pH7.4) a 37 ° C il riscaldamento bagno. Riempire microiniezione ago completamente con olio minerale, con siringa da 1 ml collegato a una seconda flessibile 25 ago G, attraverso la sua base.
- Fissare ago sulla rotazione del braccio di montaggio, e vuota ago della soluzione di olio minerale. Re-riempire con 2,5 ml di soluzione TL. Assicurarsi che non bolle d'aria sono presenti all'interno l'ago iniezione. Ruotare il braccio l'ago verso la parete, lontano dal palcoscenico.
- Anestetizzare la madre incinta in camera di anestesia via infusione continua di isoflurano. Quando la madre è uno stato di incoscienza, trasferire l'anestesia per tubo naso posizionato sul clato audal del palco, e posto la madre in posizione supina con il muso in tubo naso per consentire la continuazione di uno stato completamente anestetizzato.
- Arti nastro in angoli di 45 °, o con le mani ei piedi riposati e posizionati sovrastano schede / monitor temperatura ECG. È importante che la diga incinta è costantemente monitorata per garantire che l'anestesia è sufficiente e che in pomata applicata agli occhi per ridurre l'essiccazione.
- Applicare il prodotto di rimozione dei capelli attraverso basso addome della madre, pulire delicatamente con tamponi di cotone asciutto, e poi di nuovo con un 70% di tamponi di cotone etanolo-saturi per rimuovere qualsiasi prodotto in eccesso e capelli. Assicurarsi di pulire la pelle addominale fuori di tutti i capelli nel sito di incisione (Figura 3).
- Eseguire una laparotomia sulla madre incinta con pinze chirurgiche fini e forbici. Fare attenzione a non tagliare le navi grandi o organi viscerali. Fate prima incisione diritta dell'epidermide 1,5-2 cm sopra la vagina e continuare tagliare verso costole per approximately 2-3 cm. Esporre la membrana sottocutanea, individuare la linea alba ("linea bianca") (Figura 3), e tagliare parallelo incisione iniziale, lungo la stessa lunghezza, per esporre organi interni viscerali e sacculi uterini.
2. Estrazione di embrioni
- Utilizzare applicatori di cotone con punta da 6 pollici di manovra madre ed embrioni. Premere delicatamente (non forzare) sulla pelle con applicatore di manipolare primo embrione di apertura dell'incisione. Dopo l'estrazione del primo saccule dell'embrione, delicatamente e lentamente tirare il resto del corno uterino attraverso e sulla parte esterna della madre. Evitare di tirare intestino o altri organi attraverso un'incisione in questa fase.
- Quantificare embrioni e inserire delicatamente corno uterino posteriore sinistra in madre. Poi iniziare mettendo il corno uterino destra nuovamente dentro la madre a partire dal lontano embrione sacculo dalla vagina sul corno e in movimento verso il basso. Continuare questo fino a soli due embrioni rimangono esposti (Fifigura 4). Infine, gli embrioni di posizione in una colonna sopra e parallela alla linea di incisione, essendo consapevoli di non tagliare la circolazione uterina.
- Posizionare i blocchi di argilla e la posizione tra le braccia e il corpo, così come le gambe e la coda. Assicurarsi che le superfici in terra battuta sono circa livello con incisione laparotomica. Bagnare la piastra Petri finestrato con 37 ° C PBS.
- Afferrare forcipe estendono con la mano destra e piatto fenestrato Petri con la mano sinistra (finestratura parallelo embrioni) e portare chiuso pinze ~ 5 cm attraverso fenestrazione, dalla parte superiore della scatola di Petri. Pinze aperte completamente senza strappi maglia finestratura.
- Manovra mani sopra embrioni e concentrarsi vista sulle due sacculi embrione. Senza (o leggermente) toccando sacculi con finestratura meshing o pinze, farle scorrere attraverso fessura e impostare piastra di Petri sul ventre della madre. Con pinze ancora estese, manipolare maglia fenestrata a sedere su entrambi i lati e alla base di ogni embrione (Figura 5
- Quindi, posto di gomma blu contenente muro in capsula di Petri, senza pizzicare o ferire embrioni (Figura 6). Assicurarsi che i blocchi di argilla sono saldamente equilibrando capsula di Petri, embrione, e la parete contenenti gomma. Infine, riempire piastra di Petri con 37 ° C PBS fino embrioni sono completamente sommersi (Figura 6), controllando eventuali perdite a meshing fenestrata.
Procedura 3. Iniezione
- Stadio inferiore iniezione con la madre e gli embrioni verso il basso con manopola di regolazione del livello Z (figura 1) e quindi ruotare ago per l'iniezione e il braccio di montaggio e allineare direttamente con sonda ecografica, con ½ ago cm a sinistra e sotto la punta della sonda (Figura 7) . Spingere l'ago-braccio (non l'ago) a 45 ° di distanza dalla sonda. Fare attenzione a non colpire la punta dell'ago con la sonda piatto o ad ultrasuoni.
- Sollevare fase di iniezione di nuovo all'altezza originale, con gli ultrasuoni probe direttamente sopra Probe embrioni deve essere un po 'sommerso e entro 3-4 mm del tessuto embrionale. Usa X & Y manopole di regolazione fase (Figura 8) per modificare la posizione dell'embrione / madre / stage per individuare sistematicamente cuore embrionale battere.
- Direttamente Centro di schermo ultrasuoni osservare un pennarello nero bersaglio centro disegnato (*). Individuare ventricolo sinistro (preferibile) o Atrium con le manopole di regolazione fase X & Y (Figura 8) e poi alzare o abbassare il palco con la manopola girevole sul palco per posizionare obiettivo iniezione esattamente sopra il marker nero sullo schermo ultrasuoni.
- Utilizzare X manopola di regolazione fase embrionale per spostare a destra, fuori dello schermo ultrasuoni. Riposizionare microiniezione ago e il braccio in posizione, ½ cm di distanza dal e 90 ° rispetto alla sonda ecografica (Figura 7).
- Utilizzando microiniezione montaggio manopole di regolazione (figura 9C-G), la posizione dell'ago con la punta chiaramente aligned con il marcatore centrale. Regolare l'angolo di iniezione (con manopole in Figura 9C & EG), e X, Y, Z e vettori di micro-aghi per garantire punta dell'ago è focalizzata nel piano corretto. Ritrarre microiniezione ago utilizzando esclusivamente la manopola "iniezione" (Figura 9F), attenzione a non modificare altre dimensioni.
- Ancora una volta, utilizzando esclusivamente l'X regolazione fine manopola fase embrionale mossa di nuovo sotto la sonda, con l'obiettivo esattamente sul segno centrale sullo schermo ultrasuoni. Assicurarsi che il ventricolo sinistro è ora esattamente nella stessa X, Y, e Z aereo.
- Successivamente, con la sola manopola "iniezione" sul supporto microiniezione, lentamente forare embrione con l'ago microiniezione e gradualmente portare punta nel ventricolo sinistro. Iniettare il pieno di 2,5 ml di soluzione di TL in ventricolo sinistro o fino a quando i segnali acustici di allarme vuote, tenendo "vuoto" e toccando "riempire" una volta (figure 2A & B). In questo momentodell'iniezione osservare un'ombra proveniente dalla punta dell'ago che è la TL entrare nella camera cardiaca (Figura 10). In contrario, ritirare rapidamente microiniezione ago ruotando la manopola "iniezione" (Figura 9F) sulla microiniezione monte quando l'iniezione è completa.
- Proseguimento per il prossimo dell'embrione e ripetere la procedura per embrioni rimanenti seguito questa serie di passaggi e, infine, mettere gli embrioni finali nuovamente dentro l'addome della diga. Passare anestesia a scatola da camera e spostare delicatamente la madre qui per 15 minuti dal momento dell'ultima iniezione.
4. raccolta embrioni e analisi
- Sacrifica diga via dislocazione cervicale. Espandere l'incisione laparotomica per rimuovere facilmente le corna uterine dalla madre. Mantenere gli embrioni all'interno dell'utero sac. Mettere embrioni in raffreddato PBS.
- Sezionare embrioni da uterino sac (se il tessuto necessario per raccogliere genotipizzazione) e porre il tutto embrione in 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte, poi in 30% di saccarosio durante la notte, congelare in criostato sezionamento di media. Poi tagliare il cryosection e posizionarlo su vetrini per l'analisi immunoistochimica. Facoltativamente, utilizzare tessuti di tutto il montaggio da disidratazione in 100% di metanolo, dopo fissazione in 4% PFA.
- Per l'analisi immunoistochimica mettere le criosezioni in PBS per rimuovere Office. Poi bloccare le sezioni con siero normale asino 10% per 30 min. Quindi aggiungere anticorpo primario PECAM a 1: 100 diluizione notte a 4 ° C. Il giorno dopo, lavare i vetrini in PBT 3 volte per 10 minuti ciascuno e aggiungere asino contro ratto 594 secondaria e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
NOTA: Questa è una tecnica molto esigente che richiede l'ottimizzazione e il coordinamento di ultrasuoni e microiniezione. C'è una curva di apprendimento molto ripida legati a questa tecnica e richiede 4-6 settimane di iniezioni mentore prima si diventa abili.
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Representative Results
Formazione vascolare precede flusso in via di sviluppo del rene
La maggioranza di tessuto embrionale (compreso il rene) contiene un sistema vascolare denso (sia unperfused e perfuso), anche a primi punti temporali embrionali. Per meglio calibro e analizzare il flusso di sangue all'interno del rene sviluppo abbiamo utilizzato un metodo di In Utero microiniezioni intracardiache embrionali. Con l'uso di un ultrasuoni ad alta risoluzione per identificare cuore embrionale E11.5 E17.5 attraverso, e dopo l'estrazione e l'esposizione di un singolo saccule uterina mediante una laparotomia, siamo stati in grado di iniettare 2,5 ml di TL (isotiocianato di fluoresceina (CIC) -conjugated).
Abbiamo trovato la più grande iniezione E13.5 successo e E15.5 punti di tempo embrionali, con una percentuale di successo di circa il ~ 80% al 90%, rispettivamente. A causa della presenza di un cuore relativamente immaturo a E11.5 e una esistenza di denso cartilagine e la formazione di osso E17.5, TI perifericome punti sono relativamente difficili da iniettare, con una probabilità di successo sostanzialmente inferiore rispetto alle medie punti temporali embrionali. Ci si può aspettare almeno il ~ 50% ~ 30% e tassi di successo con E11.5 e ora E17.5 punti rispettivamente.
In tessuto co-marcatura con PECAM (CD31), un marker endoteliale universale, siamo in grado di categorizzare qualitativamente vasi e tessuti fluorescenti in tre gruppi: vasi perfusi (PECAM positivo e TL positivo), vascolare unperfused (pecam positivo), e aberrante perfuso strutture (TL positivo). Questo particolare pattern di colorazione consente di distinguere spazialmente tra le aree di perfusione e non-perfusione (Figura 11).
A E11.5, abbiamo scoperto che le navi perfusi incapsulano il rene di sviluppo in un modello web-like senza effettivamente penetrare nell'organo (Figura 12B). Da E13.5, grandi navi sono state perfusi con alcuni dei più piccolivasi accessori colorazione con TL (Figura 12C). La colorazione può essere visto anche durante alcune dell'epitelio ureterale, questo può essere sia da glomeruli già perfuso o per la leakiness intrinseca dei primi vasi embrionali. Con E15.5 grandi vasi sono stati perfusi tuttavia numerosi glomeruli potrebbe anche essere osservato che tiene la macchia TL, suggerendo che il filtraggio avviene significativa (Figura 12D). Anche in questo momento indicare un numero di navi più piccole calibro apparire perfusi, anche se una parte significativa della zona nefrogenica esterna sembra essere privo di flusso sanguigno. Infine, tuttavia, E17.5 maggioranza del rene è stato perfuso eccezione vascolarizzazione della zona nefrogenico, che è prevalentemente privo di perfusione (comunque densa in pecam vasi positivi) indicando così un'assenza di angiogenesi in regioni periferiche. Vasi di calibro più piccoli contengono TL e il numero medio di glomeruli perfusi ha drammaticamente inaumentati rispetto ai punti temporali precedenti (Figura 12E).
Sonda Figura 1. Ecografia, fase chirurgica, sistema di microiniezione, sistema ferroviario, e ECG / monitor temperatura set up di base.
Figura 2. Attrezzatura necessaria chirurgici, soluzioni e dispositivi. (A) applicatori di cotone con punta. (B) L'estensione (Ring) pinze. (C) forbici chirurgiche. Pinze (D) Blunt-punta. (E) pinza sottile. (F) Microiniezione Needle (ORIGIO, # C060609). (H) Iniezione / Fill controller. (I) tampone fosfato (PBS). (J) Mineral Oil (Sigma Aldrich).
Figura 3. A 2 cm laparotomia viene effettuata sulla madre anestetizzato, esponendo lo strato sottocutaneo (parete addominale) sopra l'utero. Utilizzando le forbici chirurgiche e una pinza sottile, esporre la linea alba e fare un'incisione parallelo epidermica taglio. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.
Figura 4. 1-2 E15.5 sacculi uterini estratti attraverso un'incisione laparotomia ed esposti. Cliccate qui per vedere una più grandeversione della figura.
Figura 5. Exposed sacculi uterini guidati attraverso fessura capsula di Petri fenestrata con pinze estendono. Fenestrato meshing posti snuggly alla base delle sacculi.
Figura 6. Blu muro di contenimento posta a destra del sacculi uterini. Piatto Petri riempita con 37 ° C PBS fino embrioni e contenente pareti sono completamente sommerso. Blocchi in laterizio collocati saldamente sotto Petri-dish / embrione tra braccia e il corpo e le gambe e la coda.
Figura 7. Positio Sistema di iniezione ned ½ cm verso sinistra e sotto, e 90 ° a sonda ecografica.
Figura 8. Fase X e meccanismi di regolazione Y.
Figura 9. Vuoto / Fill dispositivo, sistema microiniezione, e in scena monte. (A) pulsante Fill. (B) Pulsante Iniettare. (C) ago circolare manopola di regolazione dell'angolo. Manopola di regolazione (E) Belle X. Manopola (F) "Injection". Manopola di regolazione (G) Corso X. (H) palcoscenico girevole manopola di regolazione in altezza.
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Figura 10. Ecografia immagine di E15.5 TL microiniezione. Tip Needle intra-cardiaca è posizionato all'interno della camera cardiaca, soluzione TL è indicato da un'ombra nera in due camere. Pericardio e la cavità pericardica sono facilmente distinguibili.
Figura 11. Aree tra perfusione, unperfusion, e la colorazione anomala discernimento. Il primo pannello mostra la macchia pecam. Il pannello centrale mostra la macchia TL sopra esattamente la stessa area di tessuto. Ureteric bud è aberrante macchiato; grandi navi sono racchiusi da linee bianche tratteggiate. L'ultimo pannello è l'unione. Frecce bianche indicano perdite nave, e le frecce grigie mostrano una transizione verso una nave diventando perfuso. Strutture gialle rappresentano vascolarizzazione completamente perfusione.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.
Figura 12. Embrioni e perfusione renale ontogenesi è indagato. (A) totale E11.5 embrione è perfuso, con i vasi molto periferici all'interno delle regioni di testa e di coda che fissano il TL. (B) navi perfuso sono stati osservati circostante, ma non inseriti nel rene di sviluppo a E11.5 in un modello nastriforme, vi è anche abbastanza una grande quantità di colorazione diffusa a questo punto. (C) E13.5 rene mostra grandi, grandi vasi di calibro sono perfusi tutto rene (freccia bianca e gialla), con perfusione assente nella zona nefrogenica (bianco linea tratteggiata). (D) E15.5 rene mostra perfusione tutta piccolo calibro, vasi periferici (frecce gialle),in alcuni glomeruli (frecce bianche), e ancora un'assenza di perfusione a mantello periferico reni. (E) E17.5 rene mostra vasto perfusione tutto glomeruli (frecce bianche) e piccoli vasi calibro (frecce gialle). La zona nefrogenica è indistinguibile dal resto del rene a questo ingrandimento. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.
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Discussion
Microiniezione anestesia e tempi
Per quanto riguarda anesthetization della madre, è essenziale per mantenere costante il flusso d'aria (2-3 L / min) e la bassa PSI. Il flusso del sedativo deve essere tenuto a circa 1,75-2 L / min. Contemporaneamente, tempi in cui le iniezioni hanno luogo devono essere attentamente monitorati e controllati per con ogni cucciolata. Per ogni cucciolata la procedura di iniezione deve essere tenuto sotto 45 min. L'importanza di tale termine è fondamentale per l'esperimento, poiché ogni embrione deve essere mantenuto entro una gamma normale frequenza cardiaca costante per facilitare perfusione controllato ed invariabile tutto il corpo e organo di interesse. Abbiamo scoperto che l'allungamento iniezioni risultati in risultati dubbi e le fluttuazioni nei modelli di perfusione tra embrioni e abbassa i tassi di iniezioni di successo (ad esempio, frequenza cardiaca, morte cardiaca). Infine, dopo l'ultima iniezione entro la lettiera, è essenzialeper consentire a circa 15 minuti prima che gli embrioni vengono raccolti per facilitare una corretta, perfusione completa all'interno di ogni embrione.
Trattamento e la cura degli embrioni procedurale
Durante l'estrazione degli embrioni, abbiamo trovato maggiori tassi di successo con iniezioni che sono ottiene costantemente curando la salute e l'integrità del rivestimento uterino e embrioni generale durante l'estrazione embrione. Utilizzando gli applicatori di cotone con punta delicati (saturi con PBS) per manipolare e manovrare il sacco uterina e sacculi sono indispensabile per garantire la sopravvivenza della madre e degli embrioni durante tutta la procedura. In primo luogo, è importante assicurare che l'integrità fisica dell'utero e della placenta è correttamente mantenuta. Evitare contorcersi le sacculi in un modo che ostacolare il flusso di sangue per gli embrioni o causare rotture significative in vasi sanguigni che forniscono il flusso di sangue alla placenta. Questo può essere ottenuto estraendo un maximum di 1-2 embrioni alla volta (a meno estraendo l'intero sac uterino per conteggio iniziale) e posizionando applicatori distanti principali vasi sanguigni alla base della placenta.
Posizione del sito di iniezione Embryonic
Guida l'ago microiniezione nella posizione corretta con la macchina ad ultrasuoni è anche fondamentale per ogni tentativo di iniezione. Particolare attenzione deve essere data al posizionamento e centraggio del ventricolo sinistro del centro. Successivamente, l'ago deve essere posizionato e centrato precisamente sul marcatore centro e per allineare l'ago e il sito di iniezione secondo lo stesso piano Y X e. Una volta che questo è completo, lentamente disegnare la punta dell'ago più vicino al sito di iniezione e di evitare l'applicazione di stress eccessivo per il pericardio e il cuore. Questo viene fatto consentendo l'ago di passare gradualmente attraverso strati di tessuto, piuttosto che forzare il passaggio dell'ago attraverso di loro. Durante l'iniezione, è anche importante look per un'ombra nera proveniente dalla punta dell'ago (Figura 10). Questo è indicativo della soluzione TL riempimento del ventricolo. Se la punta dell'ago è nella posizione corretta, l'ombra deve continuamente appaiono e scompaiono come TL viene espulso in aorta. Tuttavia, se la cavità pericardio sembra engorge, ciò è indicativo che l'ago è fuori del ventricolo sinistro e la soluzione TL sta riempiendo la cavità pericardico circonda il cuore. Questo è un errore comune che è facilmente correggibile riposizionando l'ago per l'iniezione sul suo X e Y piano, con eventuali piccoli aggiustamenti che si svolgono con l'ago ancora all'interno dell'embrione. Evitare estrarre l'ago dal embrione in questo stadio.
Ecoguidata in limitazioni microiniezione vivo
Intrinsecamente, la microiniezione ecografia possiede un certo numero di limitazioni tecniche fondamentali. In primo luogo, il volume ago microiniezioneCapacità restringe la fascia d'età di iniezioni a E17.5 nel topo. 2,5 ml di soluzione TL è stato dimostrato nei nostri studi di perfusione completamente embrioni fino a E15.5. Tuttavia, proprio seguendo questo punto di tempo, il TL in rapporto al volume di sangue diventa a minuscoli e diluita di taggare efficacemente membrane endoteliali renali periferici. Così, un'immagine diminuito del flusso di sangue è presente al punto temporale iniezioni successive. Inoltre, la formazione di osso e cartilagine nell'embrione crea una barriera naturale per la punta dell'ago, determinando in tal modo i tempi di iniezione allungate e frequenti crepe nella testa dell'ago. Tali limiti possono essere superati utilizzando un sistema iniezioni nuovi con maggiori capacità di resistenza dell'ago e di volume.
Tecniche di mappatura del flusso sanguigno embrionali alternativi
Ad oggi, i metodi alternativi di mappatura embrionale flusso di sangue del mouse includono l'attuazione di calchi in resina, immunoistochimica colorazione, e alta resolut ion ecografia. Come calchi resina (con l'integrazione di tecniche di imaging avanzate) sono attualmente l'alternativa più popolare, questo sarà discusso in maggior dettaglio di seguito. Calchi in resina consentono la creazione di tre rappresentazioni tridimensionali accurate di flusso all'interno di organi dopo la nascita. Tuttavia, poco successo è stato avuto con tessuto renale prenatale di imaging a causa porosa vascolarizzazione del sangue e le limitazioni in risoluzione. In confronto, macchie TL coniugati consentono bonding endoteliali antigeni di membrana che portano ad un elevato grado di precisione. In altri casi, resina viscosità tronca prematuramente flusso in vasi glomeruli e piccoli capillari, creando limitazione in fase di sperimentazione a ingrandimenti elevati. A ingrandimenti inferiori, questa tecnica è chiaramente praticabile a stabilire modelli di flusso nelle regioni in via di sviluppo. Al contrario, TL consente l'analisi ad alta risoluzione del flusso di sangue rispetto a strutture di sviluppo a livello cellulare.
ent "> La futura applicazione e le indicazioniI nostri dati suggeriscono che il flusso di sangue e l'ossigenazione sono fattori critici per quanto riguarda la differenziazione nefrone progenitore. Per chiarire ulteriormente il loro ruolo nello sviluppo renale, indagini future devono delineare meccanismi anatomici sottostanti precipitanti questo processo fisiologico come pure esaminare vie di segnalazione trascrizionali che mediano questo fenomeno pure. Una ipotesi, per quanto riguarda colmare il divario tra fenomeno e il meccanismo, è che la cellula muscolare e periciti aggregati lisce giocano un ruolo contributivo nell'orchestrare il troncamento transitorio del flusso sanguigno in regioni di cellule staminali di organi in via di sviluppo. Per testare questa, un'ulteriore colorazione e l'analisi di immunofluorescenza devono essere condotte con particolare attenzione su questi tipi di cellule, al confine della zona nefrogenica. In termini di future indagini sottostanti vie di segnalazione, vorremmo esplorare il ruolo dell'ipossia fattori inducibili eVon Hippen Lindau vie di segnalazione. Entrambi sono stati in gran parte implicata in tutta la letteratura come giocare ruoli importanti induttivi nel mantenimento ipossico e ambienti ossigenati all'interno delle regioni di cellule staminali (in gran parte visto essere ipossico) e aree di differenziazione (aree più bisognose di ossigenazione), rispettivamente. Inoltre, vorremmo interrogare il ruolo di eritropoietina (EPO), nel mediare i processi di angiogenesi e vasculogenesi durante lo sviluppo vascolare del rene. EPO è una glicoproteina renale che svolge un ruolo critico nel differenziamento endoteliale e manutenzione. Il suo ruolo nel sangue mediata differenziazione endoteliale è in gran parte sconosciuto. Infine, vorremmo condurre esperimenti di microiniezione vivo con composti vasodilatazione per rafforzare ulteriormente la validità di queste indagini.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5,000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5 µl / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
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