Abstract
腎臓の血管（離れて糸球体からの）開発の形成と灌流が大幅に代役されている。脈管構造は、（主要な血管の外分岐される）は、血管形成および脈管形成（ 新生血管形成）を介して発展するにつれて、そのような生体内超音波イメージングの樹脂キャスト、および顕微解剖として灌流マッピング技術との間の密接な関係を実証するが限定されているこれら二つのプロセス及び胚内の腎臓の構造を開発。ここでは、腎臓の灌流の個体発生を測定するためにマウス胚に子宮内心臓超音波ガイド下FITC標識トマトレクチンマイクロインジェクションでの手順を説明します。トマトレクチン（TL）は、収穫胚および腎臓を通して灌流した。ネフロン前駆細胞、ネフロン構造、尿管上皮、および血管系：組織を含む様々な腎臓構造に共染色した。 E13.5から始まる大口径容器は、しかし、末梢灌流した船がunperfused残った。 E15.5およびE17.5では、小さな末梢血管だけでなく、糸球体は、灌流さになることを始めた。この実験的手法は、胚発生中の脈管構造と血流の役割を研究するために重要である。
Introduction
胚発生中に2つの別々の、まだ同時、血管のプロセスが行われます。血管新生、血管が住宅内皮前駆細胞1,2から血管のデノボ形成であり、主要な既存の容器、および脈管形成、から成長するプロセスを。後者は、主にそれが存在しない場合に起こると考えられている間に、それぞれ、前者は、血流と同義である。
血管形成への同時、腎臓前駆細胞合成、増殖、および分化の循環的かつダイナミックなプロセスは、胎生9.5（E9.5）上で展開を開始します。この時点で、尿管芽（UB）は、周囲の後腎間葉（MM）に背側に侵入し、出産3まで続く。急速に後腎キャップ間充織を凝縮にUBの繰り返しの分岐は腎臓の機能ユニットの形成、ネフロンを開始します。 UBとnephのすべての新世代ロンは、古い世代は、それらが、その後、主に血管密度の高い環境内でさらに成熟と分化を受け、内側皮質と髄質の地域、にずれている。ドレスラーらによって証明されるように、図3に、この発生学的プロセスは、UBとMMとの間のクロストーク、および細胞外因子3-6無数のように、誘導性シグナル伝達により沈殿させる。開発膵臓と腎臓内の二つの最近調査し、細胞外の要因は、酸素緊張と血流7,8が含まれています。後者は、腎臓の発生に関連して以下でさらに詳細に説明する。
血流は、潜在的ネフロン前駆細胞の分化、並びにの他の器官形成プロセス、胚血流マッピングの精密で正確な方法で果たす役割の誘導を露出させるために不可欠である。
血流を測る別の方法は、ulの処方を含むtrasoundイメージングと樹脂が9,10を投げかける。結論的に、これらのモードは、本質的に同時に、血流との間の時間的及び空間的な並置を発表し、幹細胞の分化する能力に欠けていることが示されている。レジンキャストは、例えば、成体組織内の血管パターニングの有効なモデルを提供する、しかしそのような胚の時点と同様に未熟船、で、血管が肉眼的に未発達及び漏出性である。そのため、樹脂は、しばしば多孔質の、小さな血管内に保持することができないキャスト。
これらの見かけ上の障害のために、とりわけ、我々は超音波ガイド下腎臓発生の私たちの調査に生体内で心臓内胚トマトレクチン（TL）マイクロインジェクションに組み込むことを選んだ。この手順では、同期E11.5、E13.5、E15.5およびE17.5の時点でのマウス胚の左心室にTL溶液2.5μlので満たされたマイクロピペット取り付けられた針を案内するために超音波プローブを利用する。 E17針がより発展した胚を貫通するのに十分な強さではありませんように0.5は、最新の発達時代です。
このマイクロインジェクション法の利点は豊富である。超音波ガイド下マイクロインジェクションは、動物の鼓動する心臓への胚性左心室、ソリューションの受動的かつ制御追放、心臓や周辺組織への最小限のダメージ、との突然の心不全と死の回避内注射針の正確な位置決めが可能胚全身灌流の前に。 FITC標識TLを使用することで、すべての灌流し、血管系は、内皮頂端膜に沿ってマーカーを維持します。免疫組織化学と組み合わせて、PECAM（CD31、血小板内皮細胞接着分子）、および様々な他の血管マーカーを利用して、我々は明らかに灌流および非灌流血管を区別するだけでなく、周囲の組織の任意の異常な染色を特徴付けることができる。
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Protocol
注：ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会は、すべての実験を承認した。
超音波マイクロインジェクションインスツルメンツおよび胚の作製
- ステージを設定し、マウントして、プローブ（ 図1）と同様に手術器具（ 図2）。 37℃の加温槽内の場所のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（pH7.4）で。そのベースを介して、第二の柔軟な25 G針に付着した1mlシリンジを使用して、鉱油を完全にマイクロインジェクション針を埋める。
- 回転上に針を修正アームをマウントし、鉱油溶液の空の針。 TL溶液を2.5μlの再埋める。気泡が注射針内に存在しないことを確認してください。離れてステージから、壁に向かって針アームを回転させます。
- イソフルランの連続注入を介して麻酔室で妊娠中の母親を麻酔。母親が無意識にレンダリングされると、C上に位置する鼻チューブに麻酔を転送audalステージの側面、そして完全に麻酔をかけた状態の継続を可能にするために鼻のチューブに鼻と仰臥位で母親を置く。
- 45°の角度で、または手や足にテープ手足は休息と頭上ECG /温度モニタのタブを配置。これは、妊娠中のダムが継続的にその麻酔を確実に監視することが重要であるのに十分であり、眼への印加中にその軟膏は、乾燥を軽減する。
- 優しく余分な製品と毛を除去するために70％エタノール飽和綿棒で再度乾燥した綿棒で拭き取っ、そして、母親の下腹部全体に脱毛製品を適用します。切開部位（ 図3）で、すべての髪のオフ腹部の皮膚をきれいにすることを確認してください。
- 細かい外科鉗子やハサミを使って妊娠中の母親に開腹を行います。すべての主要な血管や内臓器官を切断しないように注意してください。 1.5〜2センチメートル膣の上に、第一表皮のストレート切開を作成し、approximatためのリブに向けてカットを継続エリー2-3センチ。内臓器官および子宮球形嚢の内部を露出させるために、同じ長さに沿って、皮下膜を公開白線（「白線」）（ 図3）を探して、最初の切開に平行に切断。
胚の2.抽出
- 母と胚を操縦するために6インチの綿棒アプリケーターを使用してください。静かに切開口から最初の胚を操作するアプリケータを用いて皮膚に（強制しない）押してください。最初の胚球形嚢の抽出後、静かにゆっくりと通過して、母親の外側に子宮角の残りの部分を引っ張る。この段階で切開を通って腸または他の臓器を引っ張っては避けてください。
- 胚を定量化し、優しく母親に戻す左子宮角に配置します。そして、ホーンに膣から胚球形嚢遠いから始まって下方向に移動バック母に右子宮角を配置し始める。唯一の2胚を露出されたままになるまでこれを続けます（FIグレ4）。最後に、切開線に上記と平行の列の位置の胚は、子宮の循環を遮断しないように認識している。
- 粘土ブロックと腕と体の間の位置に配置し、だけでなく、足や尾。粘土表面は開腹切開とほぼレベルであることを確認してください。 37℃のPBSで有窓ペトリ皿を湿ら。
- 左手（胚に開窓パラレル）で右手と有窓シャーレに鉗子を拡張つかみ、ペトリ皿の上から、窓を通して〜5cmのクローズ鉗子を持って来る。完全に開窓メッシュを引き裂くことなくオープン鉗子。
- 胚の上に手を操縦し、2胚球形嚢に視力を集中。なし（または軽く）スリットを介してそれらをスライドさせ、母親の腹部上にシャーレを設定し、開窓メッシングまたは鉗子で球形嚢に触れる。鉗子はまだ延長すると、いずれかの側に、それぞれの胚のベース（ 図5でそれを着座させる有窓メッシュを操作する
- 次に、（ 図6）つまんまたは胚を傷つけることなく、シャーレに壁を含む青いゴムを配置します。確認粘土ブロックはしっかりとペトリ皿、胚、およびゴム含有壁をバランスされていることを確認。有窓メッシングで漏れを制御しながら、胚が完全に、（ 図6）水没するまで最後に、37℃のPBSでペトリ皿を埋める。
3.注入手順
- 次に、下部注入母胚ダウンZレベル調整つまみ（ 図1）を使用して、ステージとプローブ先端左と下針1/2センチで、注射針を回転させ、アームをマウントし、超音波プローブに直接並ぶ（ 図7） 。 45°離れたプローブからの針アーム（しない針）を押します。皿または超音波プローブを用いて針の先端をヒットしないように注意してください。
- 超音波pで、元の高さに噴射ステージを上げる直接プローブがわずかに沈めなければならない胚上方および胚組織3-4 mm以内ローブ。使用X＆Yステージ調整ノブ（ 図8）体系的に破って、胚の心を見つけるための胚/母/ステージ位置を修正する。
- 直接超音波画面の中央には、描かれた黒、センター標的マーカー（*）を観察する。 （ 図8）X＆Yステージ調整ノブを使用して、左心室（望ましい）またはアトリウムを見つけて、超音波画面上の黒いセンターマーカーの上に正確に注入ターゲットを配置するために、ステージ上の回転ノブを使用して、ステージを上げるか、下げる。
- 超音波画面から、右に胚を移動するXステージ調整ノブを使用してください。 1/2離れてからCMと、超音波プローブに90°（ 図7）、マイクロインジェクション針の位置を変更し、元の位置に戻し腕。
- マイクロインジェクションを使用すると、アル明らかに調整つまみ（ 図9C-G）、先端を位置の針をマウントセンターマーカーでigned。針の先端が正しい平面内に集束されるように（ 図9CおよびEGでノブを使用して）噴射角を調整し、マイクロニードルのX、Y、およびZベクター。他の寸法を調整しないように注意し、単に「注射」ノブ（ 図9F）を使用して、マイクロインジェクション針を撤回。
- ここでも、正確に超音波画面上の中心マークのみにターゲットを持つバックプローブ下のX微調整段階つまみ移動胚を、使用して。左心室が全く同じX、Y、Zの平面上になっていることを確認してください。
- 次に、マイクロインジェクションに単に「注射」ノブでマウント、ゆっくりとマイクロインジェクション針で胚を穿刺し、徐々に左心室に先端をもたらす。 「空」を保持し、（ 図2A＆B）いったん「埋める」をタップして、左心室にまたは空の警告ビープ音がするまで、TL·ソリューションの完全な2.5μLを注入。現時点では注射の心臓の室に入るTL（ 図10）である針の先端から発せられる影を観察する。逆に、すぐに注入が完了したときにマイクロインジェクションの「注射」ノブ（ 図9F）がマウント回転マイクロインジェクション針を撤回。
- 次の胚に進みとこの一連の以下の残りの胚について、この手順を繰り返し、最終的に戻ってダムの腹部への最終胚を置きます。チャンバーボックスに麻酔を切り替えて、静かに最後の注射の時から15分間、ここで母を移動します。
4.収穫胚および分析
- 頸椎脱臼を経由してダムを生け贄に捧げる。簡単に母親から子宮角を除去するための開腹切開を展開します。子宮嚢の中の胚にしてください。チルドPBS中で胚を置きます。
- （あれば遺伝子型判定のために必要な収集組織）子宮嚢から胚を解剖し、全胚を置くI一晩30％ショ糖に一晩、その後nは4％パラホルムアルデヒド（PFA）、クライオスタット切片媒体中で凍結する。その後、凍結切片をカットし、免疫組織化学的分析のためにスライド上に置きます。必要に応じて、組織のために使用し、100％メタノール中で脱水し、4％PFAで固定に従って全体をマウント。
- 免疫組織化学的分析のために10月を除去するためにPBSに凍結切片を置く。その後、30分間、10％正常ロバ血清でセクションをブロックする。 4℃で一晩100希釈：次に1でPECAM一次抗体を追加します。翌日、10分毎にPBTで3回スライドを洗浄し、二次ロバ抗ラット594を追加し、室温で1時間インキュベートする。
注：これは、超音波およびマイクロインジェクションの最適化と調整を必要とする非常に厳しい技術です。あり、この技術に関連した非常に急な学習曲線があり、1つが堪能になる前に指導し、注射の4〜6週間が必要です。
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Representative Results
血管形成は、腎臓の開発フローに先行
（腎臓を含む）胚組織の大部分はあっても初期胚の時点で、密な血管系（unperfusedと灌流さの両方）が含まれています。よりよいゲージに、我々は子宮内胎児の心臓内マイクロインジェクションでの方法を利用した開発腎臓内の血流を分析。 E17.5を通してE11.5で胚の心を識別するために、高解像度の超音波の使用により、および開腹介して単一子宮球形嚢の抽出と暴露後、我々はTLの2.5μLを注入することができました（フルオレセインイソチオシアネート（FITC）が）結合。
我々は、それぞれ、90％〜約80％の成功率との最大の成功注入E13.5およびE15.5胚の時点を、発見した。そのためE11.5で比較的未熟心の存在とE17.5での密な軟骨および骨の形成の有無、辺境のTi私のポイントは、中央の胚の時点と比較して、成功の略下確率で、注入する比較的困難である。一つは、それぞれ、E11.5およびE17.5時間ポイントと少なくとも〜50％、約30％の成功率を期待することがあります。
PECAM（CD31）、ユニバーサル内皮マーカーとの同時標識組織によって、我々は質的に三つのグループに蛍光血管や組織を分類することができます：灌流し、血管系（PECAMポジティブ＆TL正）、unperfused血管系（正のPECAM）、および異常に灌流構造（TLポジティブ）。この特定の染色パターンは、私たちは空間的に灌流および非灌流（ 図11）の領域を区別することができます。
E11.5で、我々は灌流血管が実際に臓器（ 図12B）に侵入することなく、ウェブ状に発展腎臓をカプセル化することを発見。 E13.5では、主要な血管は、より小さな数で灌流したTL（ 図12C）での染色付属品の容器。尿管上皮の一部が、これはどちら既に灌流またはによる初期胚血管の固有の漏出性にされた糸球体であることができる全体染色も見られた。 E15.5によって主要な血管は、しかしながら、糸球体の数が多いにも有意なフィルタリングが（ 図12D）が発生していることを示唆し、TL汚れを保持観察することができ、灌流した。外側腎ゾーンのかなりの割合が、血流を欠くように思われるが、この時点で小さな口径血管の数は、灌流現れる。最後に、しかし、E17.5によって腎臓の大部分は、周辺領域における血管新生がないことを示すため、主に灌流を欠いている腎性ゾーン、（PECAM陽性血管内が密な）の血管系を除いて灌流した。小さな口径容器はTLを含み、灌流糸球体の平均数は劇的に有する以前の時点（ 図12E）と比較して折り目。
図1。超音波プローブ、外科的ステージ、マイクロインジェクションシステム、レールシステム、及びECG /温度モニター基本セットアップ。
図2。必要な手術用機器、ソリューション、およびデバイス。（A）綿棒アプリケーター。 （B）（リング）鉗子を拡張。 （C）外科用ハサミ。 （D）ブラント先端が鉗子。 （E）ファイン鉗子。 （F）マイクロインジェクション針（Origio、＃のC060609）。 （H）注入/コントローラを埋める。 （I）のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 （J）ミネラルオイル（シグマアルドリッチ）。
図3。2 cmの開腹子宮上記皮下層（腹壁）を露出、麻酔をかけた母親に対して実行される。外科用ハサミと細かい鉗子を利用して、白線を露出し、表皮のカットに切開を平行にしてください。 こちらをクリックしてください図の拡大版を表示します。
図4。1-2 E15.5子宮球形嚢開腹切開を通して抽出され、露出した。 拡大表示するには、ここをクリックしてください図のバージョン。
図5。拡張する鉗子を使用して、有窓ペトリ皿にスリットを介して導かれた子宮球形嚢を露出。有窓は球形嚢の基部にぴったりと席を噛み合う。
図6。胚および壁を含むが完全に浸漬されるまで、37℃のPBSで満たされた子宮球形嚢の右側に配置された壁を含むブルー。シャーレ。クレイブロックは、腕と体と脚と尾の間にペトリ皿/胚の下にしっかりと置か。
図7。インジェクションシステムpositio NED½cmの超音波プローブの左側と下、90°である。
図8。ステージX及びY調整機構。
図9.空/デバイス、マイクロインジェクションシステム、ステージマウントを埋める。（A）ボタンを埋める。 （B）ボタンを注入。 （C）円形の針の角度調整ノブ。 （E）ファインX調整ノブ。 （F）「インジェクション」ノブ。 （G）コースX調整ノブ。 （H）ステージリボルビング高さ調節ノブ。
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図10。E15.5の心臓内TLマイクロインジェクション。ニードルチップの超音波画像が 、心臓チャンバ内に配置され、TL溶液が二つのチャンバ内で黒い影で示されている。心膜と心膜空洞が簡単に区別されている。
図11。灌流、unperfusion、および識別異常な染色の間の領域。最初のパネルはPECAM染色を示している。中央のパネルは、組織の全く同じ領域にわたってTL汚れが表示されます。尿管芽が異常に染色されている。主要な血管は、白い点線で包まれている。最後のパネルには、マージです。白い矢印は、血管漏出を示し、灰色矢印は灌流つつ容器への移行を示す。黄色の構造が完全に灌流し、血管系を表している。OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg「ターゲット= "_空白">図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図12.胚および腎臓灌流個体発生が検討されている。（A）全体E11.5胚は、頭と尾領域内の非常に末梢血管がTLを保持し、灌流される。 （B）灌流血管は周囲の見えが、ウェブ状のパターンでE11.5の現像腎臓に組み込まれておらず、この時点での拡散染色の非常に大きな量もある。 （C）E13.5腎臓は主要な、大口径の血管が腎性ゾーン（白い点線）内の不在灌流で、腎臓（白と黄色の矢印）を通して灌流されている示しています。 （D）E15.5腎臓は、小口径を通して灌流を示し、末梢血管（黄色の矢印）、いくつかの糸球体（白矢印）し、再び周辺腎臓のマントルピースでの灌流の不在で。 （E）E17.5腎臓は糸球体を通して広大な灌流（白矢印）と小口径血管（黄色の矢印）を示している。腎性ゾーンはこの倍率で腎臓の残りの部分と区別がつかない。 図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
マイクロインジェクション麻酔と時間枠
母親の麻酔に関しては、それは気流定数（2-3 L /分）と低PSIに保つことが不可欠である。鎮静剤の流れは、約1.75から2 L / minで保持されなければならない。同時に、注射が行われている時間枠を綿密に監視し、各ごみとのために制御されなければならない。各ごみための注射の手順は45分以下に抑えます。各胚が身体と関心のある器官全体を制御し、不変の灌流を容易にするために一定の、正常な心拍数の範囲内に維持されなければならないので、この制限時間の重要性は、実験に最も重要である。我々は、胚の間に灌流パターンの疑わしい結果や変動における注射結果を長くするとすると、成功した注射（ すなわち、遅い心拍数、心臓死）の発生率を低下させることを見出した。最後に、リター内の最後の注射の後、それが不可欠である胚の前に約15分を可能にするために、各胚内の適切な、完全な灌流を容易にするために収穫される。
胚の手続き治療とケア
胚の抽出の間、我々は常に胚抽出中に子宮内膜と胚の全体的な健康状態との整合性に出席することによって達成されている注射での成功の大きな率を発見した。子宮嚢と球形嚢を操作し、操縦する（PBSで飽和）繊細な綿棒アプリケーターを使用すると、作業中は母と胚の生存を確保することが不可欠である。第一に、それは子宮と胎盤の物理的な整合性が適切に維持されていることを確認することが重要です。胚への血流を妨げるか、胎盤への血流を供給する血管の著しい破損の原因となるようにして球形嚢をcontorting避ける。これはmaximuを抽出することによって達成することができる当時の1-2胚のM（初期カウント全体子宮嚢を抽出していない限り）と胎盤の基部に離れて主要な血管からアプリケーターを配置することによって。
胚性注射部位の場所
超音波装置との適切な場所にマイクロインジェクション針を案内することも、各注入の試みのために重要である。細心の注意を払うことが、センターマーカー上の左心室の位置決め及びセンタリングを考慮しなければならない。これに続いて、針が配置されている必要があり、同一のXおよびY平面上の針及び注射部位を位置合わせするだけでなく、中央のマーカーを正確にセンタリング。これが完了すると、ゆっくりと注射部位に近い針の先端を描き、心膜嚢と心臓に過度のストレスを加えない。これは、針が徐々に組織層を通過させるのではなく、それらを介して針の通過を強制することによって行われる。注入時に、それはまたリットルに重要であるOOKニードルチップ（ 図10）から発せられる黒い影のために外。これは、心室の充填TL溶液を示す。針の先端が正しい位置にある場合、影が連続的に現れるべきであり、TLは、大動脈内に排出されるように消える。心膜腔はガブガブ飲むようであればしかし、これは、針がオフになっている左心室の対象とTL溶液は、心臓を囲む心膜腔を充填していることを示している。これは、簡単に微調整がまだ胚内針で起こると、そのXおよびY平面上の注射針を再配置することによって補正される一般的な間違いである。この段階で胚から針を抽出することは避けてください。
生体内マイクロインジェクションの制限に超音波ガイド下
本質的に、超音波マイクロインジェクションは、基本的な技術的な限界の数を有している。何よりもまず、マイクロインジェクション針ボリューム容量は、マウスにおいてE17.5に注射の年齢範囲を制限します。 TL溶液を2.5μlを完全にE15.5に胚を灌流する私たちの研究で示されています。しかし、ちょうどこの時点の後、血液量比TLは非常に小さいと効果的に末梢腎内皮膜をタグ付けするために希釈することになる。従って、血流の減少画像は後の時点注射で存在する。さらに、胚における骨や軟骨の形成は、このように長く噴射時間と針の頭の中で頻繁に亀裂につながる、針の先端のための天然バリアを作成します。これらの制限は、より大きな針強度および体積容量を有する新規な注射システムを利用することによって克服することができる。
代替胚血流マッピング技術
現在までに、マウス胎児の血流をマッピングする別の方法は、樹脂キャストの実装、免疫組織化学染色、および高RESOLUTを含むイオン音波イメージング。 （高度なイメージング技術の統合）樹脂キャストは、現在最も人気のある代替物であるように、これは、以下でさらに詳細に議論される。レジンキャストは出生後の臓器内の流れの正確な3次元表現の作成を可能にする。しかし、ほとんど成功は解像度における多孔血液血管系と制限によるイメージング出生前の腎組織としていたされています。比較では、共役TL汚れがより高精度につながる膜抗原を内皮接着を可能にする。他の場合には、樹脂キャスト粘度が早期より高い倍率での治験制約を作成、糸球体血管及び小さな毛細血管床に流入切り捨て。低い倍率で、この技術は、開発途上地域の関係で流れパターンを確立することで明らかに実行可能である。逆に、TLは、細胞レベルでの発達の構造への血流の相対的な高分解能の分析を可能にする。
ENT ">今後のアプリケーションと方向性我々のデータは、血流及び酸素化ネフロン前駆細胞分化に関しての重要な因子であることを示唆している。さらに腎開発における役割を解明するために、今後の調査がこの生理学的プロセスを沈殿させる基本的な解剖学的メカニズムを描くだけでなく、同様に、この現象を仲介する転写シグナル伝達経路を調べる必要があります。現象と機構との間のギャップを埋めるに関しての一つの仮説は、平滑筋細胞および周皮細胞凝集体が開発器官の幹細胞領域への血流の一時的切り捨てを組織に寄与する役割を果たしていることである。これをテストするために、さらに免疫染色および分析は、腎性ゾーン境界におけるこれらの細胞型を中心に行われなければならない。シグナル伝達経路の基礎となるの将来の研究の面では、低酸素誘導因子との役割を探求したいシグナル伝達経路フォンHippenリンダウ。これらの両方は、主に幹細胞領域（主に低酸素であると見られる）及び分化の領域（酸素の最大の必要とする領域）内で低酸素および酸素環境を維持する上で重要な誘導性の役割を果たしていると文献を通じて関与している。さらに、我々は腎臓の血管の開発を通して血管新生および血管形成の過程を媒介にエリスロポエチン（EPO）の役割を調べるしたいと思います。 EPOは内皮分化と維持に重要な役割を果たしている腎糖タンパク質である。血液を介した内皮分化におけるその役割はほとんど知られていない。最後に、我々は、さらに、これらの調査の有効性を強化するために血管拡張性化合物と生体内マイクロインジェクション実験で行いたい。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5,000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5 µl / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
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