Em Injeções Utero Intra-cardíaco Tomate-lectina em embriões de camundongos para calibre fluxo sangüíneo renal

Abstract

A formação e perfusão de desenvolver vasos sanguíneos renais (além de glomérulos) são muito escassos. Como vasculatura desenvolve através de angiogênese (que é o ramificando-se dos grandes vasos) e vasculogenesis (formação de novo navio), técnicas de mapeamento de perfusão, tais como moldes de resina, in vivo de imagens de ultra-som, e micro-dissecção foram limitadas em demonstrar as relações íntimas entre esses dois processos e desenvolvimento de estruturas renais dentro do embrião. Aqui, descrevemos o procedimento de In Utero intra-cardíacas guiada por ultrassom FITC identificados microinjeções lectina de tomate em embriões de camundongos para avaliar a ontogenia da perfusão renal. Lectina de tomate (TL) foi perfundido todo o embrião e os rins colhida. Os tecidos foram co-coradas para várias estruturas renais, incluindo: progenitores néfrons, as estruturas de néfrons, ureteral epitélio e na vasculatura. A partir de vasos de grande calibre E13.5 foram perfundidos, no entanto periféricavasos permaneceram não perfundidada. Por E15.5 e E17.5, vasos periféricos pequenas, bem como glomérulos começou a se tornar perfusão. Esta técnica experimental é fundamental para o estudo do papel da vasculatura e do fluxo sanguíneo durante o desenvolvimento embrionário.

Introduction

Durante o desenvolvimento embrionário, dois processos vasculares discretos, ainda simultâneas ter lugar: a angiogénese, o processo pelo qual um recipiente cresce a partir de um grande vaso, e vasculogénese pré-existente, que é a formação de novo de vasos de células progenitoras endoteliais residenciais ^1,2. Respectivamente, o primeiro é sinónimo de fluxo sanguíneo, enquanto que o último é pensado para ter lugar em grande parte na ausência da mesma.

Simultaneamente à formação de vasos sanguíneos, um processo cíclico e dinâmico da síntese renal de progenitor de células, proliferação, diferenciação e começa a desdobrar no dia embrionário 9,5 (E9.5). Neste ponto, o broto ureteral (UB) invade dorsal em torno mesenchyme metanephric (MM), e continua até o nascimento ^3. Repetido de ramificação da UB em rápida condensação mesênquima metanéfrico tampa começa a formação das unidades funcionais do rim, do nefrónio. Com cada nova geração de UB e nephron, as gerações mais velhas são deslocadas em regiões corticais e medular interno, onde, em seguida, submetidos a uma maturação e diferenciação dentro de ambientes principalmente vascular-densas. Como evidenciado por Dressler et al. ^3, este processo embrionário é precipitado pela sinalização indutiva, tais como a diafonia entre UB e MM, e uma miríade de factores extracelulares ^3-6. Dois fatores extracelulares recentemente investigado dentro do pâncreas e rins incluem o desenvolvimento de tensão de oxigênio e fluxo sanguíneo ^7,8. Este último irá ser discutido em mais detalhe a seguir com relação ao desenvolvimento do rim.

A fim de expor o papel indutor que o fluxo de sangue potencialmente desempenha no nefrónio diferenciação das células progenitoras, bem como em outros processos organogénese métodos precisos e exactos de embrionário mapeamento do fluxo é imperativo.

Métodos alternativos de aferir o fluxo de sangue incluem a prescrição de ulimagiologia trasound e resina molda ^9,10. Conclusivamente, estes modos demonstraram ser inerentemente falta na sua capacidade para desvendar contemporaneamente justaposições temporais e espaciais entre o fluxo de sangue e a diferenciação das células estaminais. Moldes de resina, por exemplo, fornecer um modelo válido de padronização navio dentro de tecidos adultos, no entanto, em vasos imaturos, como com momentos embrionárias, os navios são grosseiramente subdesenvolvido e gotejante. Portanto, resina lança deixar de manter dentro dos minúsculos, muitas vezes poroso, vasos.

Para esses obstáculos aparentes, entre outros, optou-se por incorporar in vivo intra-cardíacas embrionárias lectina de tomate (TL) microinjeções em nossas investigações do desenvolvimento renal guiada por ultra-som. Neste procedimento, utilizamos uma sonda de ultra-sons para guiar de forma síncrona uma agulha montada micropipeta cheia com 2,5 ml de solução de LT no ventrículo esquerdo de embriões de ratinho nos pontos de E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 e tempo. E170,5 é a última idade de desenvolvimento como as agulhas não são fortes o suficiente para penetrar o embrião mais desenvolvido.

As vantagens deste método de microinjecção são abundantes. Microinjeção guiada por ultra-som permite um posicionamento preciso de uma agulha de injeção dentro do ventrículo esquerdo embrionário, expulsão passiva e controlada de solução para o coração pulsante do animal, o mínimo de danos ao coração e tecidos circundantes, e evitar a insuficiência cardíaca súbita e morte do embrião antes da perfusão de corpo inteiro. Com o uso de uma LT com FITC, qualquer vasculatura perfundido irá manter o marcador ao longo da sua membrana apical endotelial. Em combinação com imuno-histoquímica, utilizando PECAM (CD31, plaquetas molécula de adesão das células endoteliais) e vários outros marcadores vasculares, somos capazes de distinguir claramente entre vasos perfundidos e un-perfusão, bem como caracterizar qualquer coloração anormal de tecidos circundantes.

Protocol

NOTA: The University of Pittsburgh Institutional Animal Care e do Comitê Use aprovado todos os experimentos.

1. Preparação de Instrumentos Ultrasound-microinjeção e embriões

1. Configure palco, montagem, e sonda (Figura 1), bem como os instrumentos cirúrgicos (Figura 2). Local solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) em um banho de 37 ° C de aquecimento. Encha agulha de microinjecção inteiramente com óleo mineral, usando seringa de 1 ml ligada a uma segunda agulha G 25 flexível, através da sua base.
2. Corrigir agulha na rotação do braço de montagem, ea agulha vazia de solução de óleo mineral. Re-encher com 2,5 ml de solução de TL. Certifique-se que não há bolhas de ar no interior da agulha de injeção. Gire agulha braço em direção à parede, longe do palco.
3. Anestesiar a mãe grávida na câmara de anestesia através de infusão contínua de isoflurano. Quando a mãe fica inconsciente, transferir a anestesia para tubo nariz posicionado no caudal lado do palco, e lugar mãe em decúbito dorsal com o focinho no tubo nariz para permitir a continuação de um estado totalmente anestesiado.
4. Membros fita em ângulos de 45 °, ou com as mãos e os pés descansados ​​e posicionado overtop ECG / monitor de temperatura guias. É importante que a barragem grávida é continuamente monitorizado para assegurar que a anestesia é suficiente e que a pomada aplicada no para os olhos para reduzir a secura.
5. Aplique o produto de remoção de pêlos em toda a parte inferior do abdômen da mãe, limpe suavemente com cotonetes secos, e, em seguida, novamente com um 70% de cotonetes saturado de etanol para remover qualquer excesso de produto e cabelo. Certifique-se de limpar a pele abdominal off de todos os pêlos no local da incisão (Figura 3).
6. Realize uma laparotomia na mãe grávida usando uma pinça e tesouras cirúrgicas finas. Tome cuidado para evitar o corte quaisquer vasos grandes ou órgãos viscerais. Faça primeiro, incisão reta de epiderme 1,5-2 cm acima vagina e continuar em direção a cortar costelas para approximatEly 2-3 cm. Expor a membrana subcutânea, localizar a linha alba ("linha branca") (Figura 3), e cortadas paralelamente à incisão inicial, ao longo do comprimento do mesmo, para expor interna órgãos viscerais e sáculo uterinas.

2. Extracção de Embriões

1. Utilize aplicadores com ponta de algodão de 6 polegadas de manobrar mãe e embriões. Com cuidado, empurre (sem forçar) na pele com aplicador para manipular primeiro embrião de abertura da incisão. Após a extracção do primeiro sáculo embrião, cuidadosa e lentamente puxe o restante do corno uterino, através e para o exterior da matriz. Evite puxar intestino ou outros órgãos através da incisão nesta fase.
2. Quantificar embriões e coloque delicadamente corno uterino esquerdo de volta para a mãe. Em seguida, começar a colocar o corno uterino direito de volta para a mãe começando com o mais saccule embrião da vagina no chifre e se movendo para baixo. Continue até apenas dois embriões permanecem expostos (Fifigura 4). Por último, os embriões de posição em uma coluna acima e paralelo à incisão linha, sendo consciente para não cortar a circulação uterina.
3. Coloque blocos de argila e posição entre os braços e corpo, bem como pernas e cauda. Certifique-se de que as superfícies de argila são cerca de nível com incisão laparotomia. Molhe a placa de Petri fenestradas com 37 ° C PBS.
4. Segure estendem fórceps com a mão direita e fenestrated placa de Petri com a mão esquerda (fenestration paralelo aos embriões) e trazer fechado forceps ~ 5 cm através fenestration, a partir do topo da placa de Petri. Abertas forceps completamente sem rasgar malha fenestration.
5. Manobra mãos acima de embriões e foco vista sobre as duas sáculos embrião. Sem (ou levemente) tocando sáculos com entrosamento fenestration ou fórceps, deslize-os através de fenda e definir uma placa de Petri sobre abdômen da mãe. Com uma pinça ainda estendida, manipular malha fenestrado para encaixá-lo em ambos os lados e na base de cada embrião (Figura 5
6. Em seguida, coloque borracha azul contendo parede em uma placa de Petri, sem beliscar ou ferir embriões (Figura 6). Certifique-se de blocos de argila estão firmemente equilíbrio placa de Petri, embrião, e da parede contendo borracha. Por fim, preencher placa de Petri com 37 ° C PBS até que os embriões são completamente submerso (Figura 6), enquanto que o controle de vazamentos na malha fenestrado.

3. Injeção Procedimento

1. Lower fase de injeção com a mãe e os embriões para baixo, usando botão de ajuste de nível Z (Figura 1) e, em seguida, gire a agulha de injeção e braço montar e alinhar diretamente com sonda de ultra-som, com agulha ½ cm à esquerda e sob a ponta da sonda (Figura 7) . Empurre a agulha do braço (não agulha) 45 ° de distância da sonda. Tenha cuidado para não bater a ponta da agulha com a sonda de prato ou ultra-som.
2. Levante fase de injeção de volta à altura original, com ultra-som probe diretamente acima embriões Probe deve ser ligeiramente submersa e dentro de 3-4 mm do tecido embrionário. Use X & Y botões de ajuste de fase (Figura 8) para alterar a posição do embrião / mãe / estágio para localizar sistematicamente a embrionário do coração batendo.
3. Diretamente Centro de tela ultra-som observar um marcador alvo centro preto desenhado (*). Localize ventrículo esquerdo (preferível) ou átrio usando os X & Y botões de ajuste de fase (Figura 8) e, em seguida, aumentar ou diminuir o palco, usando o botão giratório no palco para posicionar-alvo injeção precisamente sobre o marcador de centro preto na tela do ultra-som.
4. Use X botão de ajuste de fase para mover embrião para a direita, fora da tela do ultra-som. Reposicionar agulha microinjeção e braço de volta no lugar, ½ cm de distância e 90 ° para a sonda de ultra-som (Figura 7).
5. Usando montar microinjeção botões de ajuste (Figura 9C-G), agulha de posição com a ponta claramente aligned com o marcador de centro. Ajuste o ângulo de injeção (usando botões na Figura 9C e EG), e X, Y, Z e vetores de micro-agulha para garantir a ponta da agulha está focada no plano correto. Retrair agulha microinjeção usando apenas o botão de "injeção" (Figura 9F), cuidado para não ajustar outras dimensões.
6. Mais uma vez, usando apenas o X de ajuste fino movimento botão fase de embrião de volta sob a sonda, com destino exatamente sobre o ponto central na tela do ultra-som. Certifique-se de que o ventrículo esquerdo é agora exactamente no mesmo X, Y, Z e plano.
7. Em seguida, com apenas o botão de "injecção" no micro-injecção de montagem, perfurar lentamente embrião com a agulha de microinjecção e gradualmente trazer ponta para o ventrículo esquerdo. Injectar o total de 2,5 ml de solução TL no ventrículo esquerdo ou até que os vazios sinais sonoros de alerta, ao considerar "vazia" e tocando "encher" uma vez (Figuras 2A e B). Neste momentoinjecção de observar uma sombra que emana a partir da ponta da agulha, a qual é o TL entrar para dentro da câmara cardíaca (Figura 10). Em sentido inverso, retrair rapidamente agulha microinjeção girando o botão de "injeção" (Figura 9F) sobre a microinjeção de montagem quando a injeção é completa.
8. Continue na próxima embrião e repetir este procedimento para embriões remanescentes após esta série de etapas e, finalmente, colocar os embriões finais de volta para o abdômen da barragem. Alterne anestesia para a caixa de câmara e mover suavemente mãe aqui para 15 min de tempo da última injecção.

4. A colheita Embriões e Análise

1. Sacrifique barragem via luxação cervical. Expandir a incisão laparotomia para remover facilmente cornos uterinos da mãe. Mantenha os embriões dentro sac uterina. Coloque embriões em refrigerados PBS.
2. Dissecar embriões de sac uterino (se o tecido coleta necessária para genotipagem) e coloque todo o embrião in 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite, em seguida, em 30% de sacarose durante a noite, congelar no cryostat corte médio. Em seguida, corte o cryosection e colocá-lo em lâminas para análise imuno-histoquímica. Opcionalmente, usar tecidos para todo o monte por desidratação em 100% de metanol, subsequente à fixação, em PFA a 4%.
3. Para a análise imuno-histoquímica colocar os criosecções em PBS para remover o OCT. Em seguida, bloquear as secções com 10% de soro de burro normal, durante 30 min. Em seguida, adicionar PECAM anticorpo primário a diluição 1: 100 durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, lavar as lâminas em PBT 3 vezes durante 10 minutos cada e adicionar burro anti-rato secundária 594 e incubar durante 1 h à TA.
   NOTA: Esta é uma técnica altamente exigente que requer a otimização e coordenação de ultra-som e microinjecção. Há uma curva de aprendizado muito íngreme relacionados a essa técnica e requer de quatro a seis semanas de injeções mentor antes de a pessoa se torna proficiente.

Representative Results

Formação vascular precede fluxo no desenvolvimento do rim

A maioria do tecido embrionário (incluindo o rim) contem uma vasculatura densa (ambos não perfundidada e perfundidos), mesmo em pontos de tempo iniciais embrionárias. Para melhor calibre e analisar o fluxo de sangue dentro do rim desenvolvimento utilizamos um método de In Utero microinjeções intracardíacos embrionárias. Com o uso de um ultra-som de alta-resolução para identificar o coração embrionário E11.5 E17.5 através de, e após a extracção e a exposição de um único sáculo uterina por meio de uma laparotomia, fomos capazes de injectar 2,5 mL de LT (isotiocianato de fluoresceína (ITCF) conjugado a).

Nós descobrimos que o maior sucesso injetando E13.5 e E15.5 momentos embrionárias, com uma taxa de sucesso de cerca de ~ 80% e 90%, respectivamente. Devido à presença de um coração relativamente imatura em E11.5 e uma existência de cartilagem e densa formação de osso em E17.5, o ti periféricame pontos são comparativamente difíceis de injectar, com uma probabilidade de sucesso substancialmente inferior em comparação com os pontos de tempo de meia embrionárias. Pode-se esperar pelo menos ~ 50% e ~ 30% as taxas de sucesso com E11.5 e tempo E17.5 pontos, respectivamente.

Por tecido co-marcação com PECAM (CD31), um marcador endotelial universal, somos capazes de categorizar qualitativamente vasos fluorescentes e tecidos em três grupos: vasculatura perfusão (PECAM positivo & TL positivo), vasculatura não perfundidada (PECAM positivo), e aberrante de perfusão estruturas (TL positivo). Este padrão de coloração especial nos permite distinguir espacialmente entre áreas de perfusão e un-perfusão (Figura 11).

No E11.5, descobrimos que os navios perfundidos encapsular desenvolvimento do rim em um padrão web-like sem realmente penetrar no órgão (Figura 12b). Por E13.5, grandes vasos foram perfundidos com alguns dos mais pequenosvasos acessórios coloração com TL (Figura 12C). Coloração também poderia ser visto ao longo de parte do epitélio uretérico, este pode ser qualquer um de glomérulos que já são perfundidos ou devido à inerente leakiness de vasos embrionários iniciais. Ao E15.5 grandes vasos foram perfundidos, no entanto, um grande número de glomérulos também pode ser observado que prende a mancha TL, sugerindo que está a ocorrer filtragem significativa (Figura 12D). Também nessa época apontam uma série de vasos de menor calibre aparecer perfundidos, embora uma parte significativa da zona nephrogenic exterior parece ser desprovido de fluxo sanguíneo. Por fim, no entanto, por uma maioria de E17.5 o rim foi submetido a perfusão com excepção para a vasculatura da zona nefrogénica, que é predominantemente desprovida de perfusão (no entanto densa em vasos positivos PECAM) indicando assim uma ausência de angiogénese em regiões periféricas. Vasos de menor calibre conter TL e do número médio de glomérulos perfundidos tem dramaticamente nosvincado em comparação com pontos de tempo anteriores (Figura 12E).

Sonda Figura 1. Ultrasound, fase cirúrgica, sistema de microinjeção, sistema ferroviário, e ECG / monitorização de temperatura configuração básica.

Figura 2. O equipamento necessário cirúrgica, soluções e dispositivos. (A) aplicadores com ponta de algodão. (B) Extensão (anel) fórceps. (C) tesouras cirúrgicas. Fórceps (D) atraumáticas. (E) pinça fina. (F) Microinjection Needle (Origio, # C060609). (H) Injection / Preencha controlador. (I) em salino tamponado com fosfato (PBS). (J) Óleo Mineral (Sigma Aldrich).

Figura 3. A 2 cm laparotomia é realizada em mãe anestesiado, expondo a camada subcutânea (parede abdominal) acima do útero. Utilizando os tesoura cirúrgica e uma pinça fina, expor a linha alba e fazer incisão paralela ao epidérmica corte. Por favor, clique aqui para visualizar uma versão maior da figura.

Figura 4. 02/01 E15.5 sáculos uterinas extraído através de uma incisão de laparotomia e exposto. Por favor, clique aqui para ver um maiorversão da figura.

Figura 5. Exposed sáculos uterinas guiado através de fenda na placa de Petri fenestrated usando uma pinça que se estendem. Fenestrated engrenar assentos confortavelmente na base dos sáculos.

Figura 6. Azul contendo parede colocada à direita de sáculo uterinas. Prato de Petri cheio com 37 ° C até PBS contendo embriões e parede são completamente submerso. Blocos de argila colocado firmemente sob placa de Petri / embrião entre braços e corpo, pernas e cauda.

Figura 7. Positio sistema de injeção ned ½ cm para a esquerda e abaixo, e 90 ° a sonda de ultra-sons.

Figura 8. Fase X e Y mecanismos de ajustamento.

Figura 9. vazio / Preencha dispositivo, sistema de microinjeção, e palco de montagem. Botão (A) Fill. (B) Botão Injetar. (C) agulha Circular botão de ajuste do ângulo. (E) Belas X botão de ajuste. (F) Botão de "injeção". (G) Course X botão de ajuste. (H) palco giratório botão de ajuste de altura.

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Figura 10. Imagem de ultra-som de E15.5 ponta da agulha intra-cardíaca TL microinjeção. É posicionado dentro da câmara cardíaca, solução TL é indicado pela sombra negra dentro de duas câmaras. Pericárdio e cavidade pericárdica são facilmente diferenciadas.

Figura 11. Áreas entre perfusão, unperfusion e coloração aberrante discernido. O primeiro painel mostra a mancha PECAM. O painel do meio mostra a mancha TL sobre exatamente a mesma área de tecido. Ureteric bud é aberrante manchado; grandes vasos são encerradas por linhas pontilhadas brancas. O último painel é a mesclagem. As setas brancas indicam vazamento de navio, e setas cinzentas demonstrar uma transição para uma embarcação fique perfusão. Estruturas amarelas representam vasculatura totalmente perfusão.oad / 52398 / "target =" _ 52398fig11large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior da figura.

Figura 12. Embrião e perfusão renal ontogenia é investigado. (A) Total embrião E11.5 é perfundido, com os vasos muito periféricas na região de cabeça e cauda segurando o TL. (B) Os navios perfusão foram vistos ao redor, mas não incorporada no rim desenvolvendo em E11.5 em um padrão web-like, também há uma quantidade bastante grande de coloração difusa neste momento. (C) rim E13.5 mostra grandes, vasos de grande calibre são perfundidos todo rim (seta branca e amarela), com perfusão ausente na zona nephrogenic (linha pontilhada branca). (D) rim E15.5 mostra perfusão ao longo de pequeno calibre, vasos periféricos (setas amarelas),em alguns glomérulos (setas brancas) e novamente uma ausência de perfusão no rim manto periférico. (E) rim E17.5 mostra vasta perfusão todo glomérulos (setas brancas) e vasos de pequeno calibre (setas amarelas). A zona nephrogenic se confunde com o resto do rim com este aumento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.

Discussion

Anestesia Microinjection e prazo

Com relação à anestesia da mãe, que é essencial para manter constante o fluxo de ar (2-3 l / min) e em baixo PSI. O fluxo do sedativo deve ser mantida a cerca de 1,75-2 l / min. Ao mesmo tempo, os prazos em que as injeções ocorrem devem ser cuidadosamente monitorizados e controlados para com cada ninhada. Para cada ninhada a técnica de injecção deve ser mantido sob 45 min. A importância deste limite de tempo é fundamental para a experiência, uma vez que cada embrião deve ser mantida dentro de um intervalo de taxa normal do coração constante, a fim de facilitar a perfusão controlada e invariável em todo o corpo e órgão de interesse. Descobrimos que o alongamento injeções resulta em resultados duvidosos e flutuações nos padrões de perfusão entre embriões e reduz as taxas de injeções de sucesso (ou seja, batimentos cardíacos lentos, morte cardíaca). Por último, após a injecção final dentro do lixo, é essencialpara permitir que cerca de 15 min antes de embriões são colhidos para facilitar a correcta, perfusão completo dentro de cada embrião.

Tratamento processual e cuidados de embriões

Durante a extração dos embriões, nós encontramos maiores taxas de sucesso com injeções que são realizados por constantemente atender à saúde em geral e da integridade do revestimento do útero e embriões durante a extração do embrião. Usando os aplicadores com ponta de algodão delicados saturados com PBS () para manipular e manobrar o sac uterino e sáculo são imperativo assegurar a sobrevivência da mãe e embriões durante todo o procedimento. Em primeiro lugar, é importante para assegurar que a integridade física do útero e da placenta é mantido adequadamente. Evite contorcendo de sáculos de uma maneira que irá obstruir o fluxo sanguíneo para os embriões ou provocar quebras significativas nos vasos sanguíneos que fornecem o fluxo de sangue para a placenta. Isto pode ser conseguido por extracção de um maximum 1-2 de embriões de cada vez (a menos que extrair o saco inteiro uterina para contagem inicial) e posicionando aplicadores de distância a partir de grandes vasos sanguíneos na base da placenta.

Localização do Injection Embryonic site

Guiando a agulha microinjeção no local adequado com a máquina de ultra-som também é fundamental para cada tentativa de injeção. Deve ser dada especial atenção à localização e centralização do ventrículo esquerdo no marcador centro. Após isso, a agulha deve ser localizada e centrado com precisão sobre o centro do marcador, bem como para alinhar a agulha no local de injecção e sobre o mesmo plano de X e Y. Quando isso for concluído, se arrastam lentamente a ponta da agulha mais próximo do local da injeção e evitar a aplicação de tensão indevida ao saco pericárdio e do coração. Isto é feito permitindo que a agulha passe gradualmente através de camadas de tecido, em vez de forçar a passagem da agulha através deles. Durante a injecção, é também importante para look para fora para uma sombra preta que emana a partir da ponta de agulha (Figura 10). Isto é indicativo da solução TL enchimento do ventrículo. Se a ponta da agulha está na posição correcta, a sombra deve aparecer e desaparecer continuamente como TL é ejectado para dentro da aorta. No entanto, se a cavidade pericárdica parece absorver, isto é indicativo de que a agulha está fora do alvo do ventrículo esquerdo e a solução TL está a encher a cavidade pericárdica que envolve o coração. Este é um erro comum que pode ser facilmente corrigido por reposicionamento da agulha de injeção em seu X e Y avião, com quaisquer pequenos ajustes que ocorrem com a agulha ainda dentro do embrião. Evitar a extracção da agulha a partir do embrião nesta fase.

Guiada por ultrassom em limitações microinjeção vivo

Intrinsecamente, a microinjeção de ultra-som possui uma série de limitações técnicas fundamentais. Em primeiro lugar, o volume agulha microinjeçãocapacidade restringe a faixa etária de injeções para E17.5 no mouse. 2,5 ul de solução de TL tem sido mostrado nos nossos estudos para perfundir completamente embriões até E15.5. No entanto, apenas seguindo este ponto do tempo, o TL em relação ao volume de sangue torna-se a minúscula e diluída para marcar efetivamente membranas endoteliais renais periféricos. Assim, uma imagem reduzida do fluxo de sangue está presente em injeções nos pontos de tempo posteriores. Além disso, a formação de osso e cartilagem no embrião cria uma barreira natural para a ponta da agulha, conduzindo assim a injecção vezes alongados e fendas frequentes na cabeça da agulha. Estas limitações podem ser ultrapassadas pela utilização de um sistema de novas injecções com maiores capacidades de resistência e de volume agulha.

Embrionárias técnicas alternativas de mapeamento de fluxo de sangue

Até o momento, os métodos alternativos de mapeamento embrionário fluxo sanguíneo do mouse incluem a implementação de moldes de resina, a coloração imuno-histoquímica, e alta resolut ultra-sonografia ion. Como moldes de resina (com a integração de técnicas avançadas de imagem) são atualmente a alternativa mais popular, isso será discutido em mais detalhes abaixo. Moldes de resina permitem a criação de três representações dimensionais fluxo dentro dos órgãos pós-natais. No entanto, pouco sucesso foi tido com tecido renal pré-natal de imagem devido à vascularização sanguínea poroso e limitações na resolução. Em comparação, as manchas TL conjugados permitir ligação a antigénios de membrana endotelial que conduzem a um maior grau de precisão. Em outros casos, a viscosidade do elenco resina prematuramente trunca fluir em vasos glomérulos e minúsculos capilares, criando limitação investigação com ampliações superiores. Em ampliações menores, esta técnica é claramente viável o estabelecimento de padrões de fluxo em relação a regiões em desenvolvimento. Por outro lado, TL permite a análise de alta resolução de fluxo sanguíneo em relação às estruturas de desenvolvimento, ao nível celular.

ent "> Future aplicação e instruções

Nossos dados sugerem que o fluxo sanguíneo e oxigenação são fatores críticos no que diz respeito à diferenciação Nephron progenitor. Para melhor elucidar os seus papéis no desenvolvimento renal, futuras investigações devem delinear mecanismos anatômicas subjacentes precipitantes este processo fisiológico, bem como examinar as vias de sinalização de transcrição que medeiam este fenômeno também. Uma das hipóteses, com relação a fazer a ponte entre fenômeno e mecanismo, é que agregados de células musculares lisas e pericyte desempenham papéis contributivos na orquestração da truncagem transitória do fluxo sanguíneo em regiões de células-tronco de órgãos em desenvolvimento. Para testar isso, ainda mais a coloração e análise de imunofluorescência deve ser conduzida com foco nesses tipos de células na fronteira zona nephrogenic. Em termos de futuras investigações subjacente vias de sinalização, gostaríamos de explorar os papéis de hipóxia fatores induzidos eaSinalização Von Hippen Lindau vias. Ambos foram amplamente implicado em toda a literatura como desempenhando papéis importantes na manutenção indutivos hipóxica e ambientes oxigenados dentro das regiões de células-tronco (em grande parte, visto ser hipóxica) e áreas de diferenciação (áreas com maior necessidade de oxigenação), respectivamente. Além disso, gostaríamos de interrogar o papel de eritropoietina (EPO) na mediação dos processos de angiogênese e vasculogenesis ao longo do desenvolvimento vascular renal. EPO é uma glicoproteina renal que desempenha um papel crítico no processo de diferenciação endotelial e manutenção. Seu papel no sangue mediada diferenciação endotelial é em grande parte desconhecido. Por fim, gostaria de realizar em experimentos microinjeção vivo com compostos de vasodilatação para fortalecer ainda mais a validade destas investigações.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10