Abstract
ההיווצרות וזלוף, יצירת כלי דם כליות (מלבד glomeruli) הם understudied מאוד. ככלי דם מתפתח באמצעות אנגיוגנזה (שהוא מתפצלים כלי גדולים) וvasculogenesis (היווצרות כלי דה נובו), טכניקות מיפוי זלוף כגון יציקות שרף, in vivo הדמיה אולטרסאונד, ומיקרו לנתיחה היו מוגבלות במפגינות יחסים האינטימיים בין שני תהליכים אלו ומבני כליות מתפתחים בתוך העובר. כאן, אנו מתארים את ההליך של בmicroinjections הרחם תוך-לב מודרך-אולטרסאונד FITC שכותרתו עגבניות לקטינים בעוברי עכבר כדי לאמוד את ontogeny של פרפוזיה. קטיני עגבניות (TL) היה perfused לאורך העובר והכליות שנקטפו. רקמות שיתוף מוכתמות עבור מבנים שונים בכליות כוללים: אבות נפרון, מבני נפרון, האפיתל ureteric, וכלי דם. החל מ E13.5 כלי קליבר גדולים היו perfused, ציוד היקפי ואולםכלי נשארו unperfused. על ידי E15.5 וE17.5, כלי היקפיים קטנים, כמו גם glomeruli התחילו להיות perfused. טכניקה ניסויית זה היא קריטי ללימוד התפקיד של כלי דם וזרימת דם במהלך התפתחות עוברית.
Introduction
במהלך התפתחות עוברית שני תהליכים נפרדים, עדיין בו-זמנית, כלי דם יתקיימו: אנגיוגנזה, התהליך שבו גדל כלי מכלי שיט, וvasculogenesis גדולים קיימים מראש, שהוא במערך דה נובו של כלי מאבות אנדותל מגורים 1,2. בהתאמה, לשעבר הוא שם נרדף לזרימת דם, ואילו הוא חשב שהאחרון לקחת במידה רבה את המקום בהעדרו.
במקביל להיווצרות כלי דם, תהליך מחזורי ודינמי של סינתזת אב כליות תא, התפשטות, ובידול מתחיל להתפתח ביום עוברי 9.5 (E9.5). בשלב זה ניצן ureteric (UB) פולש dorsally למקיף mesenchyme metanephric (MM), וממשיך עד לידת 3. חזר הסתעפות של UB למהירות עיבוי mesenchyme כובע metanephric מתחילה ההיווצרות של היחידות פונקציונליות של הכליות, נפרון. עם כל דור חדש של UB וnephרון, דורות מבוגרים הם עקורים לאזורים בקליפת המוח והלשדיים פנימיים, שבו הם לאחר מכן לעבור הבשלה והתמיינות נוספות בתוך סביבות בעיקר כלי דם צפופים. כפי שמעיד דרסלר et al. 3, תהליך עוברי זה, מוגבר על ידי איתות אינדוקטיביים, כגון crosstalk בין UB וMM, ומספר עצום של גורמים תאיים 3-6. שני גורמים שנחקרו לאחרונה תאיים בתוך לבלב הפיתוח וכליות כוללים מתח חמצן וזרימת דם 7,8. האחרון יידון בפירוט בהמשך ביחס לפיתוח כליות.
על מנת לחשוף את התפקיד אינדוקטיביים שזרימת דם שעלול להיות משחקת בבידול אב נפרון תא, כמו גם בתהליכי organogenesis אחרים, שיטות מדויקות ומדויקות של זרימת דם מיפוי העוברי הוא הכרחי.
שיטות חלופיות של מדידת זרימת דם כוללות את המרשם של ulההדמיה trasound ושרף מטילים 9,10. באופן חד משמעי, מצבים אלה הוכחו להיות מטבע חסר יכולתם לחשוף זמנית צירופים של זמן ומרחב בין זרימת דם וגזע התמיינות תאים. יציקות שרף, למשל, לספק מודל תקף של דפוסי כלי בתוך רקמות בוגרות, אולם בכלי בשלה, כמו עם נקודות זמן עובריים, כלים הם גס מפותחים ודולפים. לכן, שרף מטיל מצליח להחזיק בתוך כלי הזעירים, לעתים קרובות נקבוביים,.
למכשולים נראות לעין אלה, בין יתר, בחרנו לשלב בmicroinjections vivo תוך-לב לקטינים עגבניות עובריים (TL) לחקירות של פיתוח כליות שלנו מונחה אולטרסאונד. בהליך זה אנו מנצלים בדיקה אולטרסאונד כדי להנחות את מחט micropipette רכובה מלאה 2.5 μl של פתרון TL לתוך החדר השמאלי של עכבר עובר בנקודות E11.5, E13.5, E15.5, וזמן E17.5 סינכרוני. E17.5 הוא הגיל ההתפתחותי האחרון כמחטים הן לא חזקות מספיק כדי לחדור את העובר מפותח יותר.
היתרונות של שיטה זו הם בשפע microinjection. microinjection מודרך אולטראסאונד מאפשר מיקום מדויק של מחט זריקה בתוך החדר השמאלי העוברי, גירוש פסיבי ושליטה מלאה של פתרון ללב הפועם של בעלי החיים, נזק מינימאלי ללב ורקמות הסובבות, והימנעות מכישלון לב הפתאומי ומותו של עובר לפני זלוף גוף מלא. עם השימוש בTL FITC שכותרתו, כל כלי דם perfused ישמור את הסמן לאורך קרום פסגת אנדותל. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, ניצול PECAM (CD31, מולקולת הידבקות תא אנדותל טסיות דם) וסמנים אחרים של כלי דם שונים, אנו יכולים להבחין בבירור בין כלי perfused ו- perfused un, כמו גם לאפיין כל כתמים חריגים של רקמות הסובבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישרה את כל הניסויים.
1. הכנת מכשירי אולטרסאונד-microinjection ועוברים
- הגדר את הבמה, הר, ובדיקה (איור 1), כמו גם מכשירי ניתוח (איור 2). פתרון פוספט המקום שנאגרו מלוח (PBS) (pH7.4) באמבט התחממות 37 ° C. מלא מחט microinjection לחלוטין עם שמן מינרלים, באמצעות מיליליטר המזרק 1 מצורף ל-25 גמישים מחט G שנייה, דרך הבסיס שלה.
- תקן את המחט על סיבוב הר זרוע, ומחט ריקה של פתרון שמן מינרלים. למלא מחדש עם 2.5 μl של פתרון TL. ודא שאין בועות אוויר נמצאות בתוך מחט הזריקה. סובב את זרוע מחט לכיוון קיר, הרחק מהבמה.
- להרדים את האמא בהריון בתא הרדמה באמצעות עירוי מתמשך של isoflurane. כשאמא שלו אבדה את ההכרה, להעביר את ההרדמה לצינור האף ממוקם בגצד audal של השלב, ואמא של מקום במצב שכיבה עם חוטם בצינור האף כדי לאפשר המשך מצב בהרדמה מלאה.
- גפיים קלטת ב -45 מעלות זוויות, או עם ידיים ורגליים נחו ואת מיקומו כרטיסיות / צג טמפרטורת overtop ECG. חשוב שהסכר בהריון מנוטר כל הזמן כדי להבטיח הרדמה שמספיק והמשחה שביישומים לעיניים להפחתת ייבוש.
- החל מוצר להסרת שיער על פני בטן תחתונה של האמא, לנגב בעדינות את עם צמר גפן יבש, ולאחר מכן שוב עם צמר גפן רווי אתנול 70% כדי להסיר כל מוצר ושיער עודפים. ודא לנקות את עור בטן של כל השיער באתר של חתך (איור 3).
- בצע laparotomy על האמא בהריון באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס ומספריים. תשמור על עצמך כדי להימנע מחיתוך כל כלי גדולים או איברים פנימיים. הפוך ראשון, חתך ישר של האפידרמיס 1.5-2 סנטימטר מעל הנרתיק וממשיך לחתוך לכיוון צלעות לapproximatסנטימטר Ely 2-3. לחשוף את הקרום תת-עורי, לאתר את alba linea ("הקו לבן") (איור 3), ולחתוך במקביל לחתך ראשוני, יחד באותו האורך, לחשוף פנימי איברים פנימיים וsaccules רחם.
2. הפקה של עוברים
- השתמש בהחלה מכותנת שקצה 6 אינץ 'לתמרן אמא ועוברים. דחפו בעדינות (לא מכריח) על עור עם המוליך לתמרן עובר ראשון מתוך פתיחת חתך. לאחר החילוץ של שקיק העובר הראשון, בעדינות ולאט לאט למשוך את יתרת קרן הרחם דרך ועל חיצוני של האם. הימנע ממשייכת מעי או לאיברים אחרים דרך חתך בשלב זה.
- לכמת עוברים ומניחים בעדינות קרן רחם עזב בחזרה לאמא. לאחר מכן להתחיל בהצטרפות לקרן רחם הזכות חזרה אל אמא מתחילה עם מרוחק שקיק עובר מהנרתיק על הצופר ולנוע כלפי מטה. תמשיך את זה עד שרק שני עוברים יישארו חשופים (Fiתרשים 4). לבסוף, עוברי עמדה בטור לעיל ומקביל לחתך קו, להיות מודע לא לנתק את זרימת דם ברחם.
- מניחים בלוקים חימר ועמדה בין זרועות וגוף, כמו גם את הרגליים וזנב. ודא שמשטחי החימר כ רמה עם חתך laparotomy. להרטיב את צלחת פטרי fenestrated עם 37 ° C PBS.
- לתפוס מלקחיים הארכה עם יד ימין וצלחת פטרי עם fenestrated יד שמאל (במקביל אשנוב לעוברים) ולהביא מלקחיים ~ 5 סנטימטר סגור דרך אשנוב, מהחלק העליון של צלחת פטרי. מלקחיים פתוחים לחלוטין מבלי לקרוע רשת אשנוב.
- לתמרן את הידיים מעל עוברים ולהתמקד מראה על שני saccules העובר. ללא (או קל) נוגע saccules עם התמזגות אשנוב או מלקחיים, להחליק אותם דרך חריץ ולהגדיר צלחת פטרי על הבטן של אמא. עם מלקחיים עדיין מורחבים, לתפעל רשת fenestrated להושיב אותו על שני צדדים ובבסיסו של כל עובר (איור 5
- השלב הבא, במקום גומי כחול המכיל קיר בצלחת פטרי, בלי לצבוט או פצעו עוברים (איור 6). הפוך לוקי חימר בטוחים בתקיפות מאזנים צלחת פטרי, עובר, וקיר המכיל גומי. לבסוף, למלא צלחת פטרי עם 37 מעלות צלזיוס PBS עד עובר הם שקועים לחלוטין (איור 6), תוך פיקוח על דליפות בהתמזגות fenestrated.
נוהל 3. הזרקה
- שלב תחתון הזרקה עם אמו ועוברים למטה באמצעות כפתור כוונון הרמה-Z (איור 1) ולאחר מכן לסובב מחט זריקה ולעלות זרוע והשורה ישירות עם הבדיקה אולטרסאונד, עם סנטימטר ½ מחט משמאל ומתחת לקצה הבדיקה (איור 7) . לדחוף מחט-זרוע (לא מחט) 45 ° מהבדיקה. היזהר שלא פגע בקצה המחט עם חללית הצלחת או אולטרסאונד.
- להעלות שלב הזרקה חזרה לגובה מקורי, עם p אולטרסאונדגלימה ישירות מעל Probe עוברים חייבת להיות שקועה מעט ובתוך 3-4 מ"מ של הרקמה העוברית. כפתורי התאמת שלב השימוש X & Y (איור 8) לתיקון מצב עובר / אמא / במה כדי לאתר את הלב העוברי להכות באופן שיטתי.
- ישירות מרכז של מסך אולטרסאונד להתבונן טוש שחור יעד המרכז נמשך (*). אתר חדר השמאלי (עדיף) או אטריום באמצעות כפתורי התאמת שלב X & Y (איור 8) ולאחר מכן להגדיל או להקטין את השלב באמצעות ידית מסתובבת על הבמה למצב את יעד הזרקה בדיוק מעל הסמן המרכזי בצבע השחור על מסך אולטרסאונד.
- השתמש בכפתור כוונון שלב X לעבור עובר בצד הימין, מעל מסך אולטרסאונד. מיקום מחדש מחט microinjection וזרוע אחורית למקום, סנטימטר וחצי מו -90 מעלות לבדיקת אולטרסאונד (איור 7).
- באמצעות microinjection הר כפתורי התאמה (איור 9 ג-G), מחט עמדה עם הקצה בבירור אלigned עם הסמן המרכזי. להתאים את זווית הזרקה (תוך שימוש בידיות באיור 9 ג וEG), ו- X, Y, Z ווקטורים של מיקרו-מחט על מנת להבטיח במטוס הנכון קצה מחט מתמקד. לחזור בו מחט microinjection באמצעות אך ורק את הכפתור "זריקה" (איור 9F), נזהר שלא להתאים ממדים אחרים.
- שוב, באמצעות רק את עובר X עדין התאמת מהלך ידית שלב בחזרה מתחת לבדיקה, עם היעד בדיוק על סימן המרכז על מסך אולטרסאונד. ודא שהחדר השמאלי הוא עכשיו בדיוק באותו X, Y, Z ומטוס.
- בשלב הבא, רק עם הידית "ההזרקה" על microinjection הר, לנקב לאט עובר עם מחט microinjection ולהביא בהדרגה קצה לתוך החדר השמאלי. הזרק 2.5 μl המלא של פתרון TL לתוך חדר השמאלי או עד שצלילי צפצוף אזהרה הריקים, על ידי החזקה "ריק" וקשה "למלא" פעם אחת (איורים 2 א & B). בשלב זההזרקה להתבונן צל שייוצר מקצה המחט שהוא TL נכנסים לתוך תא הלב (איור 10). בכיוון הפוך, לחזור בו במהירות מחט microinjection סיבוב ידית "הזריקה" (איור 9F) על microinjection הר כאשר ההזרקה היא מלאה.
- תמשיך לעובר הבא ולחזור על הליך זה עבור עוברים שנותרו לאחר סדרה זו של צעדים ולבסוף מניחים את העוברים הסופיים חזרה לבטן של הסכר. לעבור הרדמה לחדר תיבה ועדינות להעביר אמא כאן במשך 15 דקות מהזמן של הזריקה האחרונה.
4. קציר עוברים וניתוח
- להקריב את הסכר באמצעות נקע בצוואר הרחם. להרחיב את חתך laparotomy להסיר בקלות קרנות רחם מהאם. שמור את העוברים בתוך שק רחם. הנח עוברים בPBS המקורר.
- לנתח עובר מן שק רחם (אם רקמת גוביינא הכרחית לגנוטיפ) ולמקם את כל העובר iParaformaldehyde n 4% (PFA) לילה, ואז לתוך 30% סוכרוז לילה, להקפיא בcryostat חתך בינוני. ואז לחתוך את cryosection ולמקם אותו על גבי שקופיות לניתוח immunohistochemical. לחלופין, להשתמש ברקמות לכל הר על ידי ההתייבשות במתנול 100%, לאחר הקיבוע בPFA 4%.
- לניתוח immunohistochemical למקם את cryosections לPBS להסיר אוקטובר אז לחסום את החלקים עם 10% חמורים בדם נורמלי למשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף נוגדן ראשוני PECAM ב 1: 100 דילול הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את השקופיות בPBT 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ולהוסיף עכברוש אנטי חמור 594 משניים ודגירה עבור שעה 1 ב RT.
הערה: זוהי טכניקה מאוד תובענית הדורשת אופטימיזציה ותיאום של אולטרסאונד וmicroinjection. יש עקומה למידה תלולה מאוד הקשורים לטכניקה זו ודורשת ארבעה עד שישה שבועות של זריקות מורה רוחניות לפני אחד הופך מיומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היווצרות כלי דם מקדימה זרימה בפיתוח בכליות
רוב הרקמות עובריים (כולל הכליות) מכיל כלי דם צפופים (שני unperfused וperfused), אפילו בנקודות זמן עובריים מוקדמות. כדי לאמוד ולנתח טובים יותר את זרימת דם בתוך הכליה הפיתוח אנו מנוצלים שיטה בmicroinjections intracardiac העוברי ברחם. עם השימוש באולטרסאונד ברזולוציה גבוהה כדי לזהות את הלב העוברי בE11.5 באמצעות E17.5, ולאחר המיצוי והחשיפה של שקיק רחם יחיד באמצעות laparotomy, שהיינו מסוגל להזריק 2.5 μl של TL (isothiocyanate והעמסת (FITC) -conjugated).
מצאנו E13.5 הגדול ביותר להצלחת הזרקה וE15.5 נקודות זמן עוברית, עם שיעור הצלחה של כ ~ 80% עד 90%, בהתאמה. בגלל הנוכחות של לב יחסית בשלה בE11.5 והקיום של סחוס ועצם היווצרות צפוף בE17.5, ti הפריפריהשלי נקודות קשות יחסית להזריק, בהסתברות נמוכה באופן משמעותי להצלחה בהשוואה לנקודות זמן העוברית אמצע. ניתן לצפות לפחות ~ 50% ו~ שיעורי הצלחה של 30% עם נקודות E11.5 וזמן E17.5, בהתאמה.
על ידי רקמת שיתוף עם תיוג PECAM (CD31), סמן אנדותל אוניברסלי, אנו יכולים לסווג איכותיים כלים ורקמות פלורסנט לשלוש קבוצות: כלי דם perfused (PECAM חיובי וTL חיובי), כלי דם unperfused (PECAM חיובי), וaberrantly perfused מבנים (TL חיובי). דפוס צביעה מיוחד זה מאפשר לנו להבחין במרחב שבין תחומי זלוף ובלתי-זלוף (איור 11).
בE11.5, גילו שכלי perfused לתמצת את הכליות מתפתחות בדפוס-כמו אינטרנט מבלי לחדור לאיבר (איור 12 ב). על ידי E13.5, כלי גדולים היו perfused עם כמה קטן יותרכלי אבזר צביעה עם TL (12C איור). מכתים גם נצפו בחלק מאפיתל ureteric, זה יכול להיות גם מglomeruli שכבר perfused או עקב הדליפות הטבועות של כלי עובריים המוקדמים. על ידי E15.5 כלי גדולים היו perfused, אך מספר גדול של glomeruli יכול להיות גם ציין מחזיק את כתם TL, המצביע על כך סינון משמעותי מתרחש (איור 12D). גם בשלב זה להצביע על מספר כלי שיט בקוטר קטן יותר מופיעים perfused, למרות שחלק משמעותי מאזור nephrogenic החיצוני נראה נטול זרימת דם. לבסוף, לעומת זאת, על ידי E17.5 רוב הכליות היה perfused למעט כלי דם של אזור nephrogenic, שהוא ברובה נטול זלוף (אולם הצפוף בכלי חיוביים PECAM) ובכך מצביע על היעדר אנגיוגנזה באזורי פריפריה. כלי קליבר קטנים יותר להכיל TL והמספר הממוצע של glomeruli perfused יש באופן דרמטי במקומט בהשוואה לנקודות מוקדם יותר זמן (איור 12E).
בדיקה איור 1. אולטראסאונד, שלב כירורגית, מערכת microinjection, מערכת רכבות, וערכת בסיסית עד א.ק.ג. / צג טמפרטורה.
איור 2. ציוד הכרחי כירורגית, פתרונות, והתקנים. Applicators כותנה שקצה (). (ב) הרחבת מלקחיים (טבעת). (C) מספריים כירורגיות. שקצהו בלאנט (D) מלקחיים. (E) Fine מלקחיים. (F) Microinjection מחט (Origio, # C060609). (H) הזרקה / מלא בקר. (I) בופר פוספט (PBS). (J) שמן מינרלים (סיגמא אולדריץ ').
איור 3. Laparotomy 2 סנטימטר מבוצע על אמא בהרדמה, וחושף את השכבה התת עורית (דופן בטן) מעל הרחם. ניצול המספריים כירורגיות ומלקחיים עדינים, לחשוף את alba linea ולעשות במקביל לקיצוץ חתך אפידרמיס. אנא לחץ כאן ל להציג גרסה גדולה יותר של הדמות.
איור 4. 1-2 saccules רחם E15.5 שהושג באמצעות חתך laparotomy וחשוף. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותרגרסה של הדמות.
saccules רחם איור 5. חשוף מודרך דרך חריץ בצלחת פטרי באמצעות מלקחיים fenestrated הארכה. Fenestrated meshing מושבי מלבב בבסיס של saccules.
איור 6. קיר המכיל Blue ממוקם בצד הימין של saccules רחם. צלחת פטרי מלא 37 ° C PBS עד עוברים ומכיל קיר שקוע לחלוטין. בלוקים חימר ממוקמים באופן מאובטח תחת צלחת פטרי / עובר בין זרועות וגוף ורגליים וזנב.
איור 7. Positio מערכת ההזרקה נד ½ סנטימטר בצד השמאל ולמטה, ו -90 מעלות לבדיקת אולטרסאונד.
איור 8. X שלב ומנגנוני התאמת Y.
איור 9. ריק / מלא מכשיר, מערכת microinjection, ולביים הר. (א) מלא כפתור. (ב) להזריק כפתור. כפתור כוונון זווית מחט עגולה (C). כפתור כוונון (E) Fine X. ידית (F) "הזרקה". כפתור כוונון (G) הקורס X. (H) שלב מסתובב ידית כוונון גובה.
98fig10.jpg "/>
איור 10. תמונת אולטראסאונד של TL microinjection. קצה מחט התוך-לב E15.5 ממוקם בתוך תא לב, פתרון TL הוא הצביע על ידי צל שחור בתוך שני חדרים. קרום הלב וחלל קרום הלב נבדלים בקלות.
איור 11. תחומי בין זלוף, unperfusion, ומכתימים חריגים להבחין. הפנל הראשון מציג את כתם PECAM. הפנל באמצע מציג את כתם TL על אותו האזור בדיוק של רקמה. ניצן Ureteric הוא aberrantly צבעוני; כלי גדולים נארזים על ידי קווים מקווקווים לבנים. הפנל האחרון הוא המיזוג. חצים לבנים מצביעים על דליפת כלי, וחיצים אפורים להפגין מגמת מעבר לכלי הופך perfused. צהובים מבנים מייצגים כלי דם perfused באופן מלא.OAD / 52,398 52398fig11large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
איור העובר 12. וontogeny זלוף הכליות נחקר. (א) העובר E11.5 כולו הוא perfused, עם כלי מאוד היקפיים בתוך אזורי ראש והזנב מחזיקים TL. כלי (B) perfused נראו מסביב אבל לא שולבו בכליות מתפתחות בE11.5 בדפוס-כמו אינטרנט, יש גם כמות גדולה למדי של מכתים מפוזר בשלב זה. כליות (C) E13.5 תערוכות כלי גדולים, גדולים קליבר הם perfused ברחבי כליות (חץ לבן וצהוב), עם זלוף נעדר בתוך אזור nephrogenic (קו מקווקו לבן). כליות (D) E15.5 תערוכות זלוף ברחבי קליבר קטן, כלי היקפיים (חיצים צהובים),בחלק glomeruli (חצים לבנים), ושוב העדר זלוף באח כליות היקפי. כליות (E) E17.5 תערוכות זלוף ענקי בכל רחבי glomeruli (חצים לבנים) וכלי דם קטנים בקוטר (חיצים צהובים). אזור nephrogenic הוא נבדל משאר הכליות בהגדלה זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הרדמה Microinjection ומסגרת זמן
בכל הקשור להרדמה של האמא, זה חיוני כדי לשמור על זרימת אוויר קבוע (2-3 L / min) ובPSI הנמוך. הזרימה של ההרגעה חייבת להיות מוחזקת בכ 1.75-2 L / min. במקביל, לוחות זמנים שבי הזריקות יתקיימו חייבים להיות תחת פיקוח הדוק ומבוקר לעם כל המלטה. לכל המלטה הליך ההזרקה צריך להיות כל הזמן תחת 45 דקות. חשיבותה של מגבלת זמן זה היא בעל חשיבות עליונה לניסוי, כפי שכל עובר חייב להישמר בטווח קבוע, קצב לב נורמלי על מנת להקל זלוף מבוקר ובלתי משתנה בכל הגוף והאיבר של עניין. מצאנו כי הארכת תוצאות זריקות בתוצאות מפוקפקות ותנודות בדפוסי זלוף בין עוברים ומורידה את שיעורי זריקות מוצלחות (כלומר, קצב לב איטי, מוות לבבי). לבסוף, לאחר ההזרקה הסופית בתוך החול, זה חיוניכדי לאפשר כ -15 דקות לפני עוברים נקצרים כדי להקל זלוף הנכון, מלא בכל עובר.
טיפול וטיפוח של עוברים פרוצדורלי
במהלך החילוץ של העוברים, שמצאנו שיעורים גבוהים יותר להצלחה עם זריקות שנעשו על ידי כל הזמן דאגה לבריאות ולשלמותה של רירית הרחם, ועוברים הכלליים במהלך חילוץ העובר של. באמצעות החלת העדינה כותנה שקצה (רוויה PBS) כדי לתפעל ולתמרן את שק הרחם וsaccules הם הכרחיים כדי להבטיח את הישרדותם של האם ועוברים לאורך כל ההליך. ראשית, חשוב לוודא כי השלמות הפיסית של הרחם ושלית מתוחזק כראוי. הימנע contorting saccules באופן שיקשה את זרימת דם לעוברים או לגרום שבר משמעותי בכלי דם המספקים את זרימת דם לשליה. זה יכול להיות מושלם על ידי חילוץ maximuמ 'של 1-2 עובר בכל פעם (אלא אם כן לחילוץ כל שק הרחם לספירה ראשונית) ועל ידי מיקום applicators מכלי דם גדולים בבסיס השליה.
מיקומו של אתר ההזרקה העוברית
המנחה את מחט microinjection במיקום הנכון עם המכונה אולטרסאונד הוא גם קריטי עבור כל ניסיון זריקה. תשומת לב קפדנית צריכה להינתן לאיתור והמרכוז של החדר השמאלי על סמן המרכז. בעקבות זאת, המחט צריכה להיות ממוקמת ומרוכזת בדיוק על סמן המרכז, כמו גם כדי ליישר את המחט ואתר הזרקה באותו X ו- Y תכנית. ברגע זה הוא מוחלט, לצייר לאט את קצה המחט קרוב יותר לאזור ההזרקה והימנע מהפעלת לחץ מופרז לצק ולב קרום הלב. הדבר נעשה על ידי מתן אפשרות למחט לעבור בהדרגה דרך שכבות רקמה, ולא לכפות את המעבר של המחט דרכם. במהלך ההזרקה, זה גם חשוב לlook החוצה לצל שחור שיוצא מקצה המחט (איור 10). זה מעיד על פתרון TL מילוי החדר. אם קצה המחט הוא במיקום הנכון, הצל צריך ברציפות מופיע ונעלמים כTL ייפלט לתוך אב העורקים. עם זאת, אם נראה חלל קרום הלב להצטבר, זה מעיד שהמחט היא לא לכיוון של החדר השמאלי ופתרון TL ממלא את חלל קרום הלב המקיף את הלב. זוהי טעות נפוצה שאפשר לפתור בקלות על ידי למקם מחדש את מחט הזריקה על X ו- Y מטוס, עם כל התאמות קלות המתרחשות עם המחט עדיין בתוך העובר. הימנע חילוץ המחט מן העובר בשלב זה.
אולטראסאונד מודרך במגבלות microinjection vivo
מטבע, microinjection אולטרסאונד בעל מספר המגבלות טכניות בסיסיות. בראש ובראשונה, microinjection מחט הנפחקיבולת מגבילה את טווח הגילים של זריקות לE17.5 בעכבר. 2.5 μl של פתרון TL הוכח במחקרים שלנו לינקב עוברים לחלוטין עד E15.5. עם זאת, רק לאחר נקודה זו בזמן, TL יחס נפח דם הופך לזעיר ומדולל לתייג ביעילות קרומי אנדותל כליות היקפיים. לפיכך, תמונה פחתה של זרימת דם היא הווה בזריקות נקודת זמן מאוחר יותר. בנוסף, היווצרות העצם והסחוס בעובר יוצרת מחסום טבעי לקצה המחט, וכך מובילה לזמני הזרקה התארכו וסדקים תכופים בראש המחט. מגבלות אלה ניתן להתגבר על ידי ניצול מערכת זריקות רומן עם יכולות כוח המחט ונפח גדולות יותר.
טכניקות מיפוי אלטרנטיביות עוברי זרימת דם
נכון להיום, שיטות חלופיות של זרימת דם עוברית עכבר מיפוי כוללות את היישום של יציקות שרף, מכתים אימונוהיסטוכימיה, וגבוה resolut ההדמיה אולטרסאונד יון. כיציקות שרף (עם השילוב של טכניקות הדמיה מתקדמות) הן כיום האלטרנטיבה הפופולרית ביותר, זה יידון בפירוט בהמשך. יציקות שרף לאפשר את הקמתה של שלושה ייצוגים ממדיים מדויקים של זרימה בתוך איברים לאחר לידה. עם זאת, הצלחה קטנה כבר הייתה עם רקמת כליה לפני לידה הדמיה בשל כלי דם נקבוביים דם ומגבלות ברזולוציה. לשם השוואה, כתמי TL מצומדות לאפשר מליטה לאנדותל אנטיגנים קרום מוביל לדרגה גבוהה יותר של דיוק. במקרים אחרים, צמיגות יצוקה שרף בטרם עת חותכת לזרום לתוך כלי glomeruli ומיטות נימים זעירות, יצירת הגבלה מחקרית בהגדלות גדולות יותר. בהגדלה נמוכה, טכניקה זו היא בר-קיימא בהקמת תבניות זרימה ביחס לאזורי פיתוח באופן ברור. לעומת זאת, TL מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של זרימת דם ביחס למבנים התפתחותיים ברמה התאית.
אף אוזן גרון "> יישום וכיוונים עתידייםהנתונים שלנו מצביעים על כך שזרימת דם וחמצון הם גורמים קריטיים בכל הקשור לנפרון בידול אב. כדי להבהיר עוד יותר את תפקידם בהתפתחות כליות, חקירות עתיד חייבים להתוות מנגנונים אנטומיים בסיסי מזרז תהליך פיסיולוגי זה, כמו גם לבחון מסלולי איתות תעתיק שמתווכים את התופעה הזאת גם כן. השערה אחת, בכל הקשור לגישור על הפער בין התופעה ומנגנון, היא שאגרגטים תא השריר וpericyte חלקים לשחק תפקידים תורמים במנצחים עיצור החולף של זרימת דם לאזורים בתאי גזע של איברים מתפתחים. כדי לבדוק זאת, מכתים immunofluorescent נוסף וניתוח חייבים להתנהל תוך התמקדות בסוגי התאים בגבול האזור nephrogenic. במונחים של חקירות עתידיות של בסיס מסלולי איתות, ברצוננו לחקור את התפקידים של גורמים ועין מתנהלת היפוקסיהפון Hippen Lindau מסלולי איתות. שני אלה במידה רבה היו מעורבים בכל ספרות כמשחק תפקידים אינדוקטיביים חשובים בשמירה על חוסר חמצן וסביבות מחומצן באזורים של תאי גזע (ראו במידה רבה להיות חוסר חמצן) ובאזורים של בידול (אזורים בצורך הגדול ביותר של חמצון), בהתאמה. יתר על כן, ברצוננו לחקור את תפקידו של אריתרופויאטין (EPO) בתיווך התהליכים של אנגיוגנזה וvasculogenesis לאורך התפתחות כלי דם בכליות. EPO הוא גליקופרוטאין כליות שמשחק תפקידים קריטיים בבידול אנדותל ותחזוקה. תפקידה בבידול האנדותל דם בתיווך הוא במידה רבה לא ידוע. לבסוף, ברצוננו לערוך ניסויים בmicroinjection vivo עם תרכובות התרחבות לחזק את תוקפו של חקירות אלה נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5,000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5 µl / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
- Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
- Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
- Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
- Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
- Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
- Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
- Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
- Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).
