Abstract
गठन और (अलावा ग्लोमेरुली से) गुर्दे की रक्त वाहिकाओं के विकास का छिड़काव बहुत understudied कर रहे हैं। वाहिका संरचना ऐसी राल डाले, vivo में अल्ट्रासाउंड इमेजिंग, और माइक्रो विच्छेदन के रूप में छिड़काव मानचित्रण तकनीक के बीच अंतरंग संबंधों का प्रदर्शन में सीमित कर दिया गया है, (डी नोवो पोत गठन) और vasculogenesis (प्रमुख वाहिकाओं के बंद शाखाओं में बंटी है) angiogenesis के माध्यम के रूप में विकसित भ्रूण के भीतर इन दोनों प्रक्रियाओं और विकासशील गुर्दे संरचनाओं। यहाँ, हम गुर्दे छिड़काव की व्यक्तिवृत्त गेज करने के लिए माउस भ्रूण पर गर्भाशय इंट्रा-कार्डियक अल्ट्रासाउंड निर्देशित FITC लेबल टमाटर लेक्टिन microinjections में की प्रक्रिया का वर्णन। टमाटर लेक्टिन (टीएल) काटा भ्रूण और गुर्दे भर perfused किया गया था। नेफ्रॉन पूर्वज, नेफ्रॉन संरचनाओं, ureteric उपकला, और vasculature: ऊतकों सहित विभिन्न गुर्दे की संरचनाओं के लिए सह दाग रहे थे। E13.5 बड़े कैलिबर जहाजों पर प्रारंभ हो, हालांकि परिधीय perfused थेजहाजों unperfused बने रहे। E15.5 और E17.5 करके, छोटे परिधीय जहाजों के साथ ही ग्लोमेरुली perfused हो शुरू कर दिया। इस प्रयोगात्मक तकनीक भ्रूण के विकास के दौरान vasculature और रक्त के प्रवाह की भूमिका का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
Introduction
भ्रूण के विकास के दौरान दो असतत, अभी तक एक साथ, संवहनी प्रक्रियाओं जगह ले: एंजियोजिनेसिस, प्रक्रिया एक पोत आवासीय endothelial पूर्वज 1,2 से जहाजों के एक नए सिरे से गठन है, जो एक प्रमुख पूर्व मौजूदा पोत, और vasculogenesis से बढ़ता है जिससे। उत्तरार्द्ध में काफी हद तक यह के अभाव में जगह लेने के लिए सोचा है, जबकि क्रमश: पूर्व, रक्त प्रवाह के साथ पर्याय बन गया है।
रक्त वाहिनियों के गठन के लिए एक साथ, गुर्दे पूर्वज सेल संश्लेषण, प्रसार, और भेदभाव के एक चक्रीय और गतिशील प्रक्रिया भ्रूण दिन 9.5 (E9.5) पर प्रकट करने के लिए शुरू होता है। इस बिंदु पर ureteric कली (यूबी) metanephric mesenchyme (एम एम) के आस-पास में पीछे की ओर आक्रमण, और जन्म के 3 जब तक जारी है। तेजी से metanephric टोपी mesenchyme संघनक में यूबी की शाखाओं में बंटी दोहराया गुर्दे के कार्यात्मक इकाइयों, नेफ्रॉन के गठन शुरू होता है। यूबी और neph की हर नई पीढ़ी के साथरॉन, पुरानी पीढ़ी के वे तो मुख्य रूप से संवहनी घने वातावरण के भीतर आगे परिपक्वता और भेदभाव से गुजरना जहां भीतरी cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों में विस्थापित कर रहे हैं। Dressler एट अल। 3 से सबूत के रूप में, इस embryological प्रक्रिया ऐसी यूबी और मिमी, और बाह्य कारकों 3-6 के असंख्य बीच crosstalk के रूप में, प्रेरक संकेतन से उपजी है। दो हाल ही में जांच की कोशिकी विकासशील अग्न्याशय के भीतर कारकों और गुर्दे ऑक्सीजन तनाव और रक्त प्रवाह 7,8 शामिल हैं। उत्तरार्द्ध गुर्दे विकास के संबंध के साथ नीचे आगे विस्तार से चर्चा की जाएगी।
रक्त का प्रवाह संभावित नेफ्रॉन पूर्वज सेल भेदभाव, साथ ही साथ में अन्य जीवोत्पत्ति प्रक्रियाओं, भ्रूण रक्त प्रवाह मानचित्रण की सटीक और सही तरीकों में खेलता है कि प्रेरक भूमिका को बेनकाब करने के क्रम में आवश्यक है।
रक्त के प्रवाह को नापने के वैकल्पिक तरीकों उल के पर्चे में शामिलtrasound इमेजिंग और राल 9,10 डाले। अंतिम तौर से, इन मोड स्वाभाविक समकालीन रक्त के प्रवाह के बीच अस्थायी और स्थानिक juxtapositions अनावरण और सेल भेदभाव स्टेम करने के लिए अपनी क्षमता में कमी होने के लिए दिखाया गया है। राल डाले, उदाहरण के लिए, हालांकि इस तरह के भ्रूण समय बिंदुओं के रूप में साथ अपरिपक्व वाहिकाओं में, वयस्क ऊतकों के भीतर पोत patterning के एक वैध मॉडल उपलब्ध कराने, बर्तन निहायत अविकसित और टपकाया हैं। इसलिए, राल, बार बार झरझरा, छोटे जहाजों के भीतर पकड़ के लिए असफल डाले।
इन स्पष्ट बाधाओं के लिए, दूसरों के बीच में, हम अल्ट्रासाउंड निर्देशित गुर्दे विकास की हमारी जांच में इन विवो इंट्रा-हृदय भ्रूण टमाटर लेक्टिन (टीएल) microinjections में शामिल करने के लिए चुना है। इस प्रक्रिया में हम तुल्यकालिक E11.5, E13.5, E15.5, और E17.5 समय बिंदुओं पर माउस भ्रूण के बाएं वेंट्रिकल में टीएल समाधान के 2.5 μl से भरा एक घुड़सवार micropipette सुई मार्गदर्शन करने के लिए एक अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग। E17सुइयों और अधिक विकसित भ्रूण घुसना करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं कर रहे हैं के रूप में 0.5 नवीनतम विकास युग है।
इस microinjection के विधि के फायदे प्रचुर मात्रा में हैं। अल्ट्रासाउंड निर्देशित microinjection की सटीक भ्रूण बाएं वेंट्रिकल के भीतर एक इंजेक्शन की सुई की स्थिति, पशु, दिल को न्यूनतम क्षति और आसपास के ऊतकों के दिल की धड़कन में समाधान के निष्क्रिय और नियंत्रित निष्कासन, और अचानक हृदय की विफलता के परिहार और मृत्यु की अनुमति देता है भ्रूण पूरे शरीर छिड़काव करने से पहले। एक FITC लेबल टीएल के उपयोग के साथ, किसी भी perfused वाहिका अपने एन्दोथेलिअल शिखर झिल्ली के साथ मार्कर को बनाए रखना होगा। Immunohistochemistry के साथ संयोजन में, PECAM (CD31, प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु) और विभिन्न अन्य संवहनी मार्कर का उपयोग, हम स्पष्ट रूप से करने में सक्षम हैं perfused और संयुक्त राष्ट्र के perfused जहाजों के बीच अंतर है, साथ ही आसपास के ऊतकों के किसी भी न्यायपालिका धुंधला विशेषताएँ।
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Protocol
नोट: पिट्सबर्ग संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय के सभी प्रयोगों को मंजूरी दे दी।
अल्ट्रासाउंड-microinjection के उपकरण और भ्रूण के 1. तैयारी
- चरण, पर्वत, और जांच (चित्रा 1) के रूप में शल्य चिकित्सा उपकरण (चित्रा 2) की स्थापना की। एक 37 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग स्नान में जगह फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान (pH7.4)। इसके आधार के माध्यम से, एक दूसरे लचीला 25 जी सुई से जुड़ी एक मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर, खनिज तेल के साथ पूरी तरह से microinjection सुई भरें।
- रोटेशन पर सुई फिक्स हाथ माउंट, और खनिज तेल के समाधान के खाली सुई। टीएल समाधान के 2.5 μl के साथ फिर से भरना। कोई हवाई बुलबुले इंजेक्शन सुई के भीतर मौजूद हैं सुनिश्चित करें। दूर मंच से, दीवार की ओर सुई हाथ घुमाएँ।
- Isoflurane की निरंतर प्रेरणा के माध्यम से संज्ञाहरण कक्ष में गर्भवती माँ anesthetize। मां बेहोश गाया जाता है, तो सी पर तैनात नाक ट्यूब को संज्ञाहरण का स्थानांतरणनाक ट्यूब में थूथन के साथ लापरवाह स्थिति में audal मंच की तरफ, और जगह मां एक पूरी तरह से anesthetized राज्य के एक निरंतरता की अनुमति है।
- 45 डिग्री के कोण में, या हाथ और पैर के साथ टेप अंग विश्राम किया और ज़्यादा ईसीजी / तापमान पर नजर रखने टैब तैनात हैं। यह गर्भवती बांध लगातार कि संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जाती है कि यह महत्वपूर्ण है के लिए पर्याप्त है और आंखों को एप्लाइड में है कि मरहम सुखाने कम करने के लिए।
- धीरे किसी भी अतिरिक्त उत्पाद और बालों को हटाने के लिए एक 70% इथेनॉल संतृप्त कपास swabs के साथ तो फिर सूखी कपास swabs के साथ बंद पोंछे, और, माँ के पेट के निचले हिस्से भर में बालों को हटाने के उत्पाद को लागू करें। चीरा की साइट (चित्रा 3) में सभी बाल के बंद पेट की त्वचा साफ करने के लिए सुनिश्चित करें।
- ठीक सर्जिकल संदंश और कैंची का उपयोग गर्भवती मां पर एक laparotomy प्रदर्शन करते हैं। किसी भी बड़े जहाजों या आंत अंगों को काटने से बचने के लिए ध्यान रखना। 1.5-2 सेमी योनि से ऊपर, पहले epidermis के सीधे चीरा और approximat के लिए पसलियों की दिशा में कटौती जारीइली 2-3 सेमी। आंत अंगों और गर्भाशय सैक्यूल्स आंतरिक बेनकाब करने के लिए, एक ही लंबाई के साथ, चमड़े के नीचे झिल्ली बेनकाब linea अल्बा ("सफेद लाइन") (चित्रा 3) का पता लगाने, और प्रारंभिक चीरा के समानांतर काटा।
भ्रूण की 2. निकालना
- मां और भ्रूण पैंतरेबाज़ी करने के लिए 6 इंच कपास इत्तला दे दी applicators का प्रयोग करें। धीरे चीरा उद्घाटन के बाहर पहले भ्रूण में हेरफेर करने के applicator के साथ त्वचा पर (बल नहीं है) धक्का। पहले भ्रूण सेक्युल की निकासी के बाद, और धीरे धीरे के माध्यम से और मां के बाहरी पर गर्भाशय सींग के शेष खींच। इस स्तर पर चीरा के माध्यम से आंत या अन्य अंगों खींच से बचें।
- भ्रूण यों और धीरे माँ में वापस छोड़ दिया गर्भाशय सींग जगह है। तब सींग पर योनि से भ्रूण सेक्युल दूर के साथ शुरू और नीचे की ओर आगे बढ़ वापस माँ में सही गर्भाशय सींग रखने लगते हैं। (केवल दो भ्रूण उजागर रहते हैं जब तक फाई इस जारी रखेंgure 4)। अन्त में, एक के ऊपर स्तंभ और समानांतर में स्थिति भ्रूण गर्भाशय बंद संचलन में कटौती नहीं करने जानकार जा रहा है, लाइन चीरा के लिए।
- हथियार और शरीर है, साथ ही पैर और पूंछ के बीच मिट्टी ब्लॉक और स्थिति रखें। मिट्टी सतहों laparotomy चीरा के साथ लगभग स्तर हैं सुनिश्चित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ fenestrated पेट्री डिश गीले।
- बाएं हाथ (भ्रूण को गवाक्षीकरण समानांतर) के साथ दाहिने हाथ और fenestrated पेट्री डिश के साथ विस्तार देने संदंश समझ और पेट्री डिश के ऊपर से, गवाक्षीकरण के माध्यम से बंद संदंश ~ 5 सेमी लाने के लिए। पूरी तरह से गवाक्षीकरण जाल फाड़ के बिना ओपन संदंश।
- भ्रूण के ऊपर हाथ पैंतरेबाजी और दो भ्रूण सैक्यूल्स पर नजर ध्यान केंद्रित। बिना (या हल्के) भट्ठा के माध्यम से उन्हें स्लाइड और मां के पेट पर पेट्री डिश सेट, गवाक्षीकरण meshing या संदंश के साथ सैक्यूल्स छू। संदंश अभी भी बढ़ाया के साथ, (दोनों तरफ और प्रत्येक भ्रूण के आधार पर यह सीट के लिए 5 चित्रा fenestrated जाल में हेरफेर
- अगला, चित्रा (6) बन्द रखो या भ्रूण घायल हुए बिना, पेट्री डिश में दीवार युक्त नीले रबर जगह है। सुनिश्चित करें कि मिट्टी ब्लॉक मजबूती पेट्री डिश, भ्रूण, और रबर युक्त दीवार संतुलन रहे हैं बनाओ। Fenestrated meshing पर लीक के लिए नियंत्रित करते हुए भ्रूण पूरी तरह से, चित्रा (6) जलमग्न कर रहे हैं जब तक अन्त में, 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ पेट्री डिश भरें।
3. इंजेक्शन प्रक्रिया
- तो कम इंजेक्शन मां और भ्रूण नीचे जेड स्तर समायोजन घुंडी (चित्रा 1) का उपयोग कर के साथ मंच और जांच टिप बाईं ओर और नीचे सुई साढ़े मुख्यमंत्री के साथ, इंजेक्शन की सुई से बारी बारी से और हाथ माउंट और अल्ट्रासाउंड जांच के साथ सीधे लाइन अप (चित्रा 7) । 45 डिग्री की दूरी पर जांच से सुई-हाथ नहीं है (सुई) पुश। डिश या अल्ट्रासाउंड जांच के साथ सुई की नोक हिट करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- अल्ट्रासाउंड पी के साथ, वापस मूल ऊंचाई को इंजेक्शन चरण उठाएँसीधे भ्रूण जांच से ऊपर बागे थोड़ा जलमग्न और भ्रूण ऊतक के 3-4 मिमी के भीतर होना चाहिए। उपयोग एक्स और वाई चरण समायोजन knobs (चित्रा 8) को व्यवस्थित पिटाई भ्रूण दिल का पता लगाने में भ्रूण / माता / चरण स्थिति में संशोधन करने के लिए।
- सीधे अल्ट्रासाउंड स्क्रीन के बीच तैयार की गई एक काला केन्द्र लक्ष्य मार्कर (*) का पालन। एक्स और वाई चरण समायोजन knobs का उपयोग बाएं वेंट्रिकल (बेहतर) या आलिंद (चित्रा 8) जानें और फिर बढ़ाने या अल्ट्रासाउंड स्क्रीन पर काले केंद्र मार्कर पर ठीक इंजेक्शन लक्ष्य की स्थिति के लिए मंच पर घूमने का उपयोग कर घुंडी चरण कम है।
- अल्ट्रासाउंड स्क्रीन से दूर, सही करने के लिए भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक्स चरण समायोजन घुंडी का प्रयोग करें। साढ़े दूर से सेमी और अल्ट्रासाउंड जांच के लिए 90 ° (चित्रा 7), microinjection सुई का स्थान बदलें और वापस जगह में हाथ।
- Microinjection के स्पष्ट रूप से टिप अल के साथ समायोजन knobs (चित्रा 9C-जी), स्थिति सुई माउंट का प्रयोगकेंद्र मार्कर के साथ igned। सुई टिप सही विमान में ध्यान केंद्रित किया है सुनिश्चित करने के लिए है, और एक्स, वाई, और सूक्ष्म सुई के Z वैक्टर (चित्रा 9C और ईजी में knobs का उपयोग) इंजेक्शन कोण समायोजित करें। केवल "इंजेक्शन" घुंडी (चित्रा 9 फ) का उपयोग microinjection सुई वापस लेना, सावधान नहीं अन्य आयामों को समायोजित करने के लिए।
- फिर, बिल्कुल अल्ट्रासाउंड स्क्रीन पर केंद्र निशान पर लक्ष्य के साथ वापस जांच के तहत केवल एक्स ठीक समायोजन चरण घुंडी चाल भ्रूण का उपयोग करते हुए। बाएं वेंट्रिकल वास्तव में एक ही एक्स, वाई, जेड और विमान पर अब है कि सुनिश्चित करें।
- Microinjection पर सिर्फ "इंजेक्शन" घुंडी माउंट के साथ अगला, धीरे-धीरे microinjection सुई के साथ भ्रूण पंचर और धीरे-धीरे बाएं वेंट्रिकल में टिप ले आओ। एक बार (आंकड़े 2A एंड बी) "खाली" पकड़े और "भरने" दोहन करके, खाली चेतावनी बीप ध्वनियों बाएं वेंट्रिकल में या जब तक टीएल समाधान का पूरा 2.5 μl इंजेक्षन। इस समयइंजेक्शन के हृदय कक्ष में प्रवेश करने टीएल (चित्रा 10) है जो सुई की नोक से निकलती एक छाया निरीक्षण करते हैं। रिवर्स में, जल्दी से इंजेक्शन पूरा हो गया है जब microinjection पर "इंजेक्शन" घुंडी (चित्रा 9 फ) माउंट घूर्णन microinjection सुई वापस लेना।
- अगले भ्रूण पर जारी और कदम की इस श्रृंखला के बाद शेष भ्रूण के लिए इस प्रक्रिया को दोहराने और अंततः वापस बांध के पेट में अंतिम भ्रूण जगह है। चैम्बर बॉक्स के लिए संज्ञाहरण स्विच और धीरे पिछले इंजेक्शन के समय से 15 मिनट के लिए यहाँ माँ चाल है।
4. फसल काटने भ्रूण और विश्लेषण
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से बांध बलिदान। आसानी से माँ से गर्भाशय सींग हटाने के लिए laparotomy चीरा का विस्तार करें। गर्भाशय थैली के अंदर भ्रूण रखें। ठंडा पीबीएस में भ्रूण रखें।
- (अगर जीनोटाइपिंग के लिए आवश्यक इकट्ठा ऊतक) गर्भाशय थैली से भ्रूण काटना और पूरे भ्रूण जगह मैं4% paraformaldehyde (पीएफए) रातोंरात, तब में 30% सूक्रोज रातोंरात, मध्यम सेक्शनिंग cryostat में फ्रीज। तब cryosection कटौती और immunohistochemical विश्लेषण के लिए स्लाइड पर जगह है। वैकल्पिक रूप से, के लिए ऊतकों का उपयोग, 100% मेथनॉल में dehydrating 4% पीएफए में निर्धारण का पालन करके पूरे माउंट।
- Immunohistochemical विश्लेषण के लिए अक्टूबर को दूर करने के लिए पीबीएस में cryosections जगह है। फिर 30 मिनट के लिए 10% सामान्य गधा सीरम के साथ वर्गों ब्लॉक। फिर 1 पर PECAM प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें: 100 कमजोर पड़ने रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर। अगले दिन, 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीटी में 3 बार स्लाइड्स धोने और माध्यमिक गधा विरोधी चूहा 594 जोड़ने और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
नोट: यह अल्ट्रासाउंड और microinjection के अनुकूलन और समन्वय की आवश्यकता होती है एक अत्यधिक मांग की तकनीक है। इस तकनीक से संबंधित एक बहुत ही तेजी से सीखने की अवस्था है और एक कुशल हो जाता से पहले mentored इंजेक्शन के चार से छह सप्ताह की आवश्यकता है।
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Representative Results
संवहनी गठन गुर्दे के विकास में प्रवाह पछाड़
(गुर्दे सहित) भ्रूण ऊतक का बहुमत भी जल्दी भ्रूण समय बिंदुओं पर, एक घने वाहिका (unperfused और perfused दोनों) शामिल हैं। विकासशील गुर्दे के भीतर बेहतर गेज और विश्लेषण रक्त प्रवाह करने के लिए हम गर्भाशय भ्रूण intracardiac microinjections में करने की एक विधि का उपयोग किया। एक laparotomy के माध्यम से निकासी और एक भी गर्भाशय सेक्युल के प्रदर्शन के बाद E17.5 के माध्यम से E11.5 पर भ्रूण दिल की पहचान करने के लिए एक उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड का उपयोग करते हैं, और के साथ, हम टीएल के 2.5 μl इंजेक्षन करने में सक्षम थे (fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC)) संयुग्मित।
हम क्रमश: 90% करने के लिए लगभग ~ 80% की सफलता दर के साथ सबसे बड़ी सफलता इंजेक्शन लगाने E13.5 और E15.5 भ्रूण समय अंक, मिल गया है। क्योंकि E11.5 पर एक अपेक्षाकृत अपरिपक्व दिल की उपस्थिति और E17.5 पर घने उपास्थि और हड्डी के गठन की एक अस्तित्व, दूरस्थ तिवारी कीमुझे अंक मध्य भ्रूण समय अंक की तुलना में सफलता का एक काफी कम संभावना के साथ, इंजेक्षन करने के लिए अपेक्षाकृत कठिन हैं। एक क्रमशः, E11.5 और E17.5 समय बिंदुओं के साथ ~ 30% सफलता दर ~ कम से कम 50% की उम्मीद है और हो सकता है।
PECAM (CD31), एक सार्वभौमिक endothelial मार्कर के साथ सह-लेबलिंग ऊतक करके, हम गुणात्मक तीन समूहों में फ्लोरोसेंट वाहिकाओं और ऊतकों को वर्गीकृत करने में सक्षम हैं: perfused वाहिका (PECAM सकारात्मक एवं टीएल सकारात्मक), unperfused वाहिका (PECAM सकारात्मक), और aberrantly perfused संरचनाओं (टीएल सकारात्मक)। यह विशेष रूप से धुंधला पैटर्न हमें स्थानिक छिड़काव और संयुक्त राष्ट्र के छिड़काव (चित्रा 11) के क्षेत्रों के बीच भेद करने के लिए अनुमति देता है।
E11.5 में, हम perfused जहाजों वास्तव में अंग (चित्रा 12B) में प्रवेश के बिना एक वेब-तरह के पैटर्न में विकासशील गुर्दे encapsulate की खोज की। E13.5 करके, प्रमुख वाहिकाओं छोटे से कुछ के साथ perfused थेटीएल (चित्रा 12C) के साथ धुंधला हो जाना गौण वाहिकाओं। Ureteric उपकला के कुछ है, यह या तो पहले से ही perfused या कारण जल्दी भ्रूण वाहिकाओं के निहित leakiness करने के लिए कर रहे हैं कि ग्लोमेरुली से हो सकता है भर में धुंधला हो जाना भी देखा जा सकता है। E15.5 प्रमुख जहाजों perfused थे करके, ग्लोमेरुली की लेकिन एक बड़ी संख्या में भी महत्वपूर्ण है कि छानने (चित्रा 12D) उत्पन्न हो रही है, सुझाव टीएल दाग पकड़े मनाया जा सकता है। बाहरी वृक्कजनक क्षेत्र का एक महत्वपूर्ण अनुपात रक्त प्रवाह से रहित होना प्रतीत होता है, हालांकि इसके अलावा इस समय में दिखाई देते हैं, perfused छोटे कैलिबर जहाजों की संख्या इशारा करते हैं। अन्त में, हालांकि, E17.5 से गुर्दे के बहुमत इस प्रकार परिधीय क्षेत्रों में angiogenesis के अभाव का संकेत छिड़काव के मुख्यतः रहित है जो वृक्कजनक क्षेत्र, (PECAM सकारात्मक वाहिकाओं में हालांकि घने) की वाहिका संरचना के लिए छोड़कर perfused किया गया था। छोटे कैलिबर जहाजों टीएल होते हैं और perfused ग्लोमेरुली की औसत संख्या में नाटकीय रूप में हैपहले के समय अंक (चित्रा 12E) की तुलना में बढ़ गई।
चित्रा 1। अल्ट्रासाउंड जांच, शल्य चिकित्सा मंच, microinjection प्रणाली, रेल प्रणाली, और ईसीजी / तापमान पर नजर रखने के बुनियादी सेट अप।
चित्रा 2। आवश्यक सर्जिकल उपकरण, समाधान, और उपकरणों। (ए) कपास इत्तला दे दी applicators। (बी) (रिंग) संदंश का विस्तार। (सी) शल्य कैंची। (डी) संदंश कुंद इत्तला दे दी। (ई) ठीक संदंश। (एफ) microinjection सुई (Origio, # C060609)। (एच) इंजेक्शन / नियंत्रक भरें। (मैं) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)। (जे) खनिज तेल (सिग्मा Aldrich)।
चित्रा 3। एक 2 सेमी laparotomy गर्भाशय से ऊपर चमड़े के नीचे की परत (पेट की दीवार) उजागर संवेदनाहृत मां पर किया जाता है। शल्य कैंची और ठीक संदंश का उपयोग, linea अल्बा को बेनकाब और एपिडर्मल कटौती करने के लिए चीरा समानांतर बनाने के। के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 4। 1-2 E15.5 गर्भाशय सैक्यूल्स laparotomy चीरा के माध्यम से निकाला जाता है और अवगत कराया। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़े के संस्करण।
चित्रा 5। उजागर गर्भाशय सैक्यूल्स का विस्तार संदंश का उपयोग fenestrated पेट्री डिश में छेद के माध्यम से निर्देशित। Fenestrated सैक्यूल्स के आधार पर snuggly सीटें meshing।
चित्रा 6। गर्भाशय सैक्यूल्स के अधिकार के लिए रखा ब्लू युक्त दीवार। पेट्री डिश भ्रूण तक 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ भरा है और दीवार युक्त पूरी तरह से जलमग्न कर रहे हैं। मिट्टी ब्लॉक हथियार और शरीर और पैर और पूंछ के बीच पेट्री डिश / भ्रूण के तहत सुरक्षित रूप से रखा।
चित्रा 7। इंजेक्शन प्रणाली पदों नेड साढ़े सेमी छोड़ दिया और नीचे, और अल्ट्रासाउंड जांच करने के लिए 90 ° करने के लिए।
8 चित्रा। स्टेज एक्स और वाई समायोजन तंत्र।
चित्रा 9. खाली / डिवाइस, microinjection प्रणाली, भरें और माउंट मंच। (ए) के बटन भरें। (बी) के बटन इंजेक्षन। (सी) परिपत्र सुई कोण समायोजन घुंडी। (ई) ललित एक्स समायोजन घुंडी। (च) "इंजेक्शन" घुंडी। (जी) कोर्स एक्स समायोजन घुंडी। (एच) स्टेज ऊंचाई समायोजन घुंडी परिक्रामी।
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10 चित्रा। E15.5 इंट्रा-हृदय टीएल microinjection। सुई की नोक के अल्ट्रासाउंड छवि हृदय कक्ष के भीतर तैनात है, टीएल समाधान दो कक्षों के भीतर काली छाया ने संकेत दिया है। पेरीकार्डियम और पेरिकार्डियल गुहा आसानी से भेदभाव कर रहे हैं।
11 चित्रा। छिड़काव, unperfusion, और discerned न्यायपालिका धुंधला के बीच के क्षेत्रों। पहला पैनल PECAM दाग को दर्शाता है। मध्यम पैनल के ऊतकों की वास्तव में एक ही क्षेत्र पर टीएल दाग प्रदर्शित करता है। Ureteric कली aberrantly सना हुआ है; प्रमुख जहाजों सफेद बिंदीदार लाइनों द्वारा रखा जाता है। पिछले पैनल मर्ज है। व्हाइट तीर पोत रिसाव का संकेत मिलता है, और ग्रे तीर एक पोत की दिशा में एक संक्रमण perfused बनने प्रदर्शित करता है। पीला संरचनाओं पूरी तरह से perfused वाहिका संरचना का प्रतिनिधित्व करते हैं।oad / 52,398 / 52398fig11large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
12 चित्रा भ्रूण और गुर्दे छिड़काव व्यक्तिवृत्त जांच की है। (ए) पूरे E11.5 भ्रूण perfused है, टीएल पकड़े सिर और पूंछ क्षेत्रों के भीतर बहुत परिधीय वाहिकाओं के साथ। (बी) perfused जहाजों के आस-पास देखा है, लेकिन एक वेब-तरह के पैटर्न में E11.5 पर विकासशील गुर्दे में शामिल नहीं किया गया था, इस बिंदु पर फैलाना धुंधला की काफी बड़ी राशि भी नहीं है। (सी) E13.5 गुर्दे प्रमुख, बड़े कैलिबर जहाजों वृक्कजनक क्षेत्र (सफेद बिंदीदार रेखा) के भीतर अनुपस्थित छिड़काव के साथ, गुर्दे (सफेद और पीले तीर) भर perfused कर रहे हैं पता चलता है। (डी) E15.5 गुर्दे छोटे कैलिबर भर छिड़काव से पता चलता है, परिधीय वाहिकाओं (पीले तीर),कुछ ग्लोमेरुली (सफेद तीर), और फिर परिधीय गुर्दे mantel पर छिड़काव की अनुपस्थिति में। (ई) E17.5 गुर्दे ग्लोमेरुली (सफेद तीर) के दौरान विशाल छिड़काव और छोटे कैलिबर वाहिकाओं (पीले तीर) से पता चलता है। वृक्कजनक क्षेत्र इस बढ़ाई गुर्दे के बाकी हिस्सों से अप्रभेद्य है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
Microinjection संज्ञाहरण और समय सीमा
मां की anesthetization का संबंध है, यह airflow के निरंतर (2-3 एल / मिनट) और कम साई में रखने के लिए आवश्यक है। शामक के प्रवाह / मिनट लगभग 1.75-2 एल में आयोजित किया जाना चाहिए। इसके साथ ही, इंजेक्शन जगह ले जिसमें समय-सीमा बारीकी से नजर रखी और हर कूड़े के साथ के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए। प्रत्येक कूड़े के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया 45 मिनट के तहत रखा जाना चाहिए। प्रत्येक भ्रूण शरीर और हित के अंग भर में नियंत्रित और अचल छिड़काव को सुविधाजनक बनाने के क्रम में एक स्थिर, सामान्य दिल की दर सीमा के भीतर बनाए रखा जाना चाहिए के रूप में इस समय सीमा का महत्व है, प्रयोग करने के लिए सर्वोपरि है। हम भ्रूण के बीच छिड़काव पैटर्न में संदिग्ध परिणाम और उतार-चढ़ाव में इंजेक्शन के परिणामों लंबी और सफल इंजेक्शन (यानी, धीमी गति से दिल की दर, हृदय की मौत) की दरों को कम करती है कि मिल गया है। अन्त में, कूड़े के भीतर अंतिम इंजेक्शन के बाद, यह आवश्यक हैलगभग 15 मिनट की अनुमति के लिए भ्रूण प्रत्येक भ्रूण के भीतर उचित, पूर्ण छिड़काव की सुविधा के लिए काटा जाता है पहले।
प्रक्रियात्मक उपचार और भ्रूण की देखभाल
भ्रूण की निकासी के दौरान, हम लगातार भ्रूण निकासी के दौरान समग्र स्वास्थ्य और गर्भाशय अस्तर और भ्रूण की अखंडता के लिए भाग लेने के द्वारा पूरा कर रहे हैं कि इंजेक्शन के साथ सफलता की अधिक से अधिक दरों मिल गया है। गर्भाशय थैली में हेरफेर और पैंतरेबाज़ी करने के लिए (पीबीएस के साथ संतृप्त) नाजुक कपास इत्तला दे दी applicators का प्रयोग और सैक्यूल्स प्रक्रिया के दौरान मां और भ्रूण के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए जरूरी हैं। सबसे पहले, यह गर्भाशय और नाल की शारीरिक अखंडता ठीक से बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। भ्रूण में रक्त के प्रवाह में बाधा डालती है या प्लेसेंटा से रक्त के प्रवाह की आपूर्ति है कि रक्त वाहिकाओं में महत्वपूर्ण टूट-फूट के कारण होगा कि एक तरह से सैक्यूल्स contorting से बचें। यह एक maximu निकालने के द्वारा पूरा किया जा सकता हैएक समय में 1-2 भ्रूण के मीटर (प्रारंभिक गणना के लिए पूरे गर्भाशय थैली निकालने जब तक) और अपरा के आधार पर दूर प्रमुख रक्त वाहिकाओं से applicators स्थिति से।
भ्रूण इंजेक्शन साइट के स्थान
अल्ट्रासाउंड मशीन के साथ उचित स्थान में microinjection सुई गाइडिंग भी प्रत्येक इंजेक्शन के प्रयास के लिए महत्वपूर्ण है। सावधान ध्यान केंद्र मार्कर पर बाएं वेंट्रिकल का पता लगाने और एकत्रित करने के लिए दिया जाना चाहिए। इस के बाद, सुई स्थित होना चाहिए और एक ही एक्स और वाई योजना पर सुई और इंजेक्शन साइट के लिए पंक्ति में के रूप में अच्छी तरह से केंद्र मार्कर पर ठीक केंद्रित। एक बार यह पूरा, धीरे-धीरे इंजेक्शन स्थल के करीब सुई टिप आकर्षित और पेरिकार्डियल थैली और दिल के लिए अनुचित दबाव लागू करने से बचें। यह सुई धीरे-धीरे ऊतक परतों के माध्यम से पारित करने की अनुमति है, बजाय उन के माध्यम से सुई के पारित होने के लिए मजबूर किया जाता है। इंजेक्शन के दौरान, यह भी एल के लिए महत्वपूर्ण हैook सुई टिप (चित्रा 10) से निकलती एक काली छाया के लिए बाहर। इस निलय भरने टीएल समाधान का संकेत है। सुई टिप सही स्थिति में है, तो छाया लगातार दिखाई देनी चाहिए और टीएल महाधमनी में अलग हो जाता है के रूप में गायब हो जाते हैं। पेरिकार्डियल गुहा लालच से खाना करने लगता है, तो सुई बाएं वेंट्रिकल की लक्ष्य से दूर है और टीएल समाधान दिल आसपास के पेरिकार्डियल गुहा भरने है कि हालांकि, इस सूचक है। यह आसानी से भ्रूण के भीतर अभी भी सुई के साथ जगह लेने के लिए किसी भी मामूली समायोजन के साथ, अपने एक्स और वाई विमान पर इंजेक्शन की सुई repositioning द्वारा सही है कि एक आम गलती है। इस चरण में भ्रूण से सुई निकालने से बचें।
विवो microinjection के सीमाओं में अल्ट्रासाउंड निर्देशित
स्वाभाविक है, अल्ट्रासाउंड microinjection के मौलिक तकनीकी सीमाओं के एक नंबर के पास। और सबसे पहले, microinjection सुई मात्राक्षमता माउस में E17.5 करने के लिए इंजेक्शन की आयु सीमा प्रतिबंधित करता है। टीएल समाधान के 2.5 μl पूरी तरह से E15.5 भ्रूण ऊपर छिड़कना करने के लिए हमारे अध्ययन में दिखाया गया है। हालांकि, अभी इस समय बिंदु निम्नलिखित, रक्त की मात्रा के अनुपात को टीएल मामूली और प्रभावी ढंग से परिधीय गुर्दे एन्दोथेलिअल झिल्ली टैग करने के लिए पतला हो जाता है। इस प्रकार, रक्त प्रवाह की एक कम तस्वीर बाद में समय बिंदु इंजेक्शन में मौजूद है। इसके अतिरिक्त, भ्रूण में हड्डी और उपास्थि के गठन इस प्रकार lengthened इंजेक्शन टाइम्स और सुई सिर में लगातार दरारें के लिए अग्रणी, सुई टिप के लिए एक प्राकृतिक बाधा पैदा करता है। इन सीमाओं को अधिक से अधिक सुई शक्ति और मात्रा क्षमता के साथ एक उपन्यास इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग करके दूर किया जा सकता है।
वैकल्पिक भ्रूण रक्त प्रवाह मानचित्रण तकनीक
तिथि करने के लिए, मानचित्रण भ्रूण माउस रक्त के प्रवाह के वैकल्पिक तरीकों राल डाले के कार्यान्वयन, immunohistochemistry के धुंधला हो जाना, और उच्च resolut शामिल आयन अल्ट्रासाउंड इमेजिंग। (उन्नत इमेजिंग तकनीक के एकीकरण के साथ) राल डाले वर्तमान में सबसे लोकप्रिय विकल्प हो रहे हैं, इस से नीचे आगे विस्तार से चर्चा की जाएगी। राल डाले प्रसव के बाद अंगों के भीतर प्रवाह की सटीक तीन आयामी अभ्यावेदन के निर्माण के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, छोटी सफलता के कारण संकल्प में झरझरा रक्त वाहिका संरचना और सीमाओं के इमेजिंग जन्म के पूर्व गुर्दे ऊतक के साथ की थी किया गया है। इसकी तुलना में, संयुग्मित टीएल दाग परिशुद्धता के एक उच्च डिग्री के लिए अग्रणी झिल्ली एंटीजन endothelial करने के संबंध सक्षम। अन्य मामलों में, राल डाली चिपचिपापन समय से पहले उच्च आवर्धन पर अनुसंधानात्मक सीमा बनाने, ग्लोमेरुली वाहिकाओं और छोटे केशिका बेड में प्रवाह truncates। कम आवर्धन पर, इस तकनीक के विकासशील क्षेत्रों के संबंध में प्रवाह पैटर्न की स्थापना में स्पष्ट रूप से व्यवहार्य है। इसके विपरीत, टीएल सेलुलर स्तर पर विकास संरचनाओं के लिए रक्त के प्रवाह को रिश्तेदार के उच्च संकल्प विश्लेषण की अनुमति देता है।
ईएनटी "> भविष्य के आवेदन और दिशाओंहमारे डेटा रक्त प्रवाह और oxygenation पूर्वज भेदभाव नेफ्रॉन के संबंध के साथ महत्वपूर्ण कारक हैं कि पता चलता है। आगे गुर्दे विकास में अपनी भूमिका को स्पष्ट करने के लिए, भविष्य जांच इस शारीरिक प्रक्रिया precipitating अंतर्निहित शारीरिक तंत्र को चित्रित करने के साथ ही के रूप में अच्छी तरह से इस घटना कि मध्यस्थता ट्रांसक्रिप्शनल संकेत दे रास्ते की जांच होगी। घटना और तंत्र के बीच की खाई को पाटने के लिए संबंध के साथ एक परिकल्पना, चिकनी पेशी सेल और pericyte समुच्चय विकासशील अंगों के स्टेम सेल क्षेत्रों में रक्त के प्रवाह के क्षणिक ट्रंकेशन orchestrating में अंशदायी भूमिका निभाते हैं। इस परीक्षण करने के लिए, आगे immunofluorescent धुंधला और विश्लेषण वृक्कजनक जोन सीमा पर इन प्रकार की कोशिकाओं पर ध्यान देने के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। संकेत दे रास्ते अंतर्निहित के भविष्य की जांच के संदर्भ में, हम हाइपोक्सिया inducible कारकों और की भूमिका का पता लगाने के लिए करना चाहते हैंवॉन Hippen Lindau रास्ते संकेतन। इन दोनों ने काफी हद तक क्रमश: (ऑक्सीजन की सबसे बड़ी जरूरत क्षेत्रों) स्टेम सेल (मोटे तौर पर hypoxic हो देखा) क्षेत्रों और भेदभाव के क्षेत्र के भीतर hypoxic और ऑक्सीजन के वातावरण को बनाए रखने में महत्वपूर्ण प्रेरक की भूमिका निभाने के खेल के रूप में साहित्य में फंसाया गया है। इसके अलावा, हम गुर्दे संवहनी विकास भर में angiogenesis और vasculogenesis की प्रक्रिया में मध्यस्थता में erythropoietin (ईपीओ) की भूमिका से पूछताछ करना चाहते हैं। ईपीओ एन्दोथेलिअल भेदभाव और रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि एक गुर्दे ग्लाइकोप्रोटीन है। रक्त की मध्यस्थता एन्दोथेलिअल भेदभाव में इसकी भूमिका काफी हद तक अज्ञात है। अन्त में, हम आगे इन जांच की वैधता को मजबूत करने के लिए वाहिकाप्रसरण यौगिकों के साथ विवो microinjection के प्रयोगों में संचालन करने के लिए करना चाहते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5,000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5 µl / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
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