Abstract
Формирование и перфузии развития почечной кровеносные сосуды (кроме клубочков) значительно изучено недостаточно. Как сосудистой развивается с помощью ангиогенеза (который ответвляется крупных сосудов) и васкулогенез (De Novo образования сосудов), методы картирования перфузии, такие как смолы слепков, в естественных условиях ультразвуковой визуализации и микро-рассечение были ограничены в демонстрации интимных отношений между эти два процесса и развития почечной структуры в зародыше. Здесь мы опишем процедуру внутриутробному внутри сердца под ультразвуковым контролем FITC-меченных томатов лектин микроинъекций на эмбрионах мыши, чтобы измерить онтогенез почечной перфузии. Томатный лектин (TL) заливают по всему эмбриону и почек урожая. Ткани совместно окрашивали для различных структур почек, включая: нефрона предшественников, нефрона структур, мочеточника эпителия и сосудов. Начиная с E13.5 крупных сосудов калибра перфузировали, однако периферическойсосуды оставались unperfused. По E15.5 и E17.5, небольшие периферические сосуды, а также клубочки начал становиться перфузии. Это экспериментальная методика имеет решающее значение для изучения роли сосудистой и кровотока во время эмбрионального развития.
Introduction
Во время эмбрионального развития два дискретные, но одновременно, сосудистые процессы происходят: ангиогенез, процесс, при котором сосуд растет от основной предварительно существующего судна, и васкулогенезе, который заново образование сосудов из жилых эндотелиальных клеток-предшественников 1,2. Соответственно, первое является синонимом кровотока, а второй, как полагают, в значительной степени имеют место в отсутствие него.
Одновременно с образованием кровеносных сосудов, циклический и динамичный процесс синтеза почек клеток-предшественников, пролиферации и дифференцировки начинает разворачиваться на день эмбрионального 9,5 (E9.5). На данный момент мочеточника бутон (UB) вторгается дорсально в окружающую метанефрической мезенхиму (мм), и продолжается до рождения 3. Повторное разветвление UB в быстро конденсации метанефрической крышки мезенхимы начинается формирование функциональных подразделений почек, нефрона. С каждым новым поколением УБ и НефРон, старшие поколения смещаются во внутренние коркового и мозгового регионах, где они затем подвергаются дальнейшему созреванию и дифференциации в первую очередь сосудисто-плотных средах. Как видно из Дресслера и др., 3, этот процесс эмбрионального осаждают индуктивной передачи сигналов, таких как перекрестные помехи между UB и ММ, и множество внеклеточных факторов 3-6. Два недавно исследовали внеклеточные факторы в рамках развивающегося поджелудочной железы и почки включают напряжение кислорода и кровоснабжение 7,8. Последнее будет обсуждаться более подробно ниже со отношению к развитию почек.
Для того, чтобы подвергать индуктивный роль, что поток крови потенциально играют в дифференциации клеток-предшественников нефрона, а также в других процессах органогенеза, точных и точных методов эмбрионального отображения кровотока является обязательным условием.
Альтернативные методы замера кровоток включают рецепт улtrasound изображений и смолы бросает 9,10. Окончательно, эти режимы, как было показано, чтобы быть по своей природе не хватает в их способности одновременно обнародует временные и пространственные сопоставления между кровотоком и дифференцировку стволовых клеток. Смола отливок, например, обеспечить действительное модель сосуда рисунка в тканях взрослого организма, однако в незрелых сосудов, таких как эмбриональные с моментами времени, сосуды сильно развиты и вытекающей. Таким образом, смола бросает не проведет в крошечных, часто пористый, сосудов.
Для этих очевидных препятствий, в частности, мы решили включить УЗИ наведением в естественных условиях внутри сердца эмбриональных помидор лектина (TL) микроинъекций в наших исследованиях развития почек. В этой процедуре мы используем ультразвуковой зонд синхронно направлять установленный микропипетки иглы, наполненный 2,5 мкл TL раствора в левый желудочек из мышиных эмбрионов в точках E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 и время. E170,5 является последняя возраст развитием, иглы не достаточно сильны, чтобы проникнуть в более развитый эмбрион.
Преимущества этого метода микроинъекции в изобилии. Ультразвуковая руководствуясь микроинъекции позволяет точно позиционировать иглу для инъекций в течение эмбрионального левого желудочка, пассивный и контролируемое изгнание раствора в бьющееся сердце животного, минимальным ущербом для сердца и окружающих тканей, и во избежание внезапной сердечной недостаточности и смерти эмбрион до полного тела перфузии. С использованием FITC-меченого TL, любой перфузии сосудистой будет поддерживать маркер вдоль ее эндотелиальной апикальной мембране. В сочетании с иммуногистохимии, используя PECAM (CD31, тромбоцитов эндотелия молекулы клеточной адгезии) и различные другие сосудистые маркеры, мы можем четко различать перфузируемые и ООН-перфузии сосудов, а также охарактеризовать любые аберрантные окрашивание окружающих тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Питтсбургского университета Институциональные животных уходу и использованию комитета утвердил все эксперименты.
1. Подготовка Ультразвуковая микроинъекции инструменты и эмбрионов
- Настройка этап, горы, и зонд (рисунок 1), а также хирургические инструменты (Рисунок 2). Место фосфатный буферный раствор (PBS) раствор (рН 7,4) в C потепления бане 37 °. Заполните микроинъекции иглы полностью с минеральным маслом, с использованием 1 мл шприц, присоединенный к второй гибкой иглы 25 G, через его основание.
- Fix иглу на вращение крепление руку, и пустой игла раствором минеральной нефти. Залить 2,5 мкл TL решения. Убедитесь, что пузырьки воздуха не присутствуют в инъекционной иглы. Поверните иглу руку по направлению к стене, подальше от сцены.
- Обезболить беременной матери в анестезии камеры посредством непрерывной инфузии изофлюрана. Когда мать потерял сознание, перенести наркоз, нос трубки, расположенной на сaudal сторона сцены, и место матери в положении лежа на спине с рыла носом трубы, чтобы продолжение полностью под наркозом государства.
- Ленточные конечности в 45 °, или с руками и ногами отдохнувшим и позиционируется возвышаться ЭКГ вкладки / монитор температуры. Важно, что беременной плотины постоянно контролироваться, чтобы гарантировать, что анестезии является достаточным и что мазь, приложенного к глазам, чтобы уменьшить сушки.
- Применить Удаление волос по всей нижней части живота матери, нежно протрите сухим ватным тампоном, а затем снова с 70% этанола, насыщенных ватные тампоны, чтобы удалить излишки продукта и волосы. Убедитесь, чтобы очистить брюшную кожу от всех волос на месте разреза (рис 3).
- Выполните лапаротомии на беременной матери Использование тонких хирургических щипцов и ножниц. Будьте осторожны, чтобы избежать сокращения каких-либо серьезных судов или внутренних органов. Сделайте первый, прямой разрез эпидермиса 1,5-2 см выше влагалища и продолжают резать к ребрами для approximatЭли 2-3 см. Expose подкожной мембрану, найдите белой линии ("Белая линия") (Рисунок 3), и параллельно начальной разрез вдоль той же длины, чтобы разоблачить внутренний внутренних органов и матки мешочки.
2. Добыча эмбрионов
- Используйте 6-дюймовые ватным аппликаторы для маневра мать и эмбрионов. Аккуратно надавите (не заставляйте) на коже с аппликатором, чтобы манипулировать первый зародыш из отверстия разреза. После извлечения первого эмбриона мешочка, медленно и осторожно потяните оставшуюся часть рога матки через и на внешности матери. Избегайте потянув кишечника или других органах, через разрез на данном этапе.
- Количественная эмбрионов и осторожно положите левый рог матки обратно в матери. Тогда начнет размещение правильный рог матки обратно в матери, начиная с эмбриона мешочек, наиболее удаленном от влагалища на рога и двигаться вниз. Продолжайте это до тех пор только два эмбриона остаются открытыми (Fiфигура 4). Наконец, эмбрионы позиции в столбце выше и параллельно линии разреза, будучи осведомленным не отрезать приток матки.
- Поместите глиняных блоков и положение между руками и туловищем, а также ноги и хвост. Убедитесь, что глинистые поверхности примерно на одном уровне с лапаротомии разрез. Смочите Фенестрированные чашку Петри с 37 ° C PBS.
- Возьмите, проходящих щипцы с правой стороны, и Фенестрированные чашки Петри с левой стороны (фенестрация параллельно эмбрионов) и принести закрытую щипцы ~ 5 см через оконных, из верхней части чашки Петри. Открытые щипцы полностью, не разрывая светопрозрачных сетку.
- Маневр руки над эмбрионами и сосредоточиться взгляд на двух эмбрионов мешочков. Без (или слегка) касание мешочки с оконных сетки или пинцетом, сдвиньте их через щель и установить чашку Петри на животе матери. С щипцы еще расширен, манипулировать Фенестрированные сетку, чтобы усадить его на обе стороны, и в основании каждого эмбриона (рис 5
- Далее, поместите синий каучук, содержащий стену в чашку Петри, без защемления или ранения эмбрионов (Рисунок 6). Убедитесь, что глиняные блоки прочно балансировки чашку Петри, эмбрион, резино-содержащие стену. Наконец, заполнить чашку Петри с 37 ° C PBS до эмбрионы полностью погружены (рисунок 6), в то время как контроль на герметичность в фенестрированной сетки.
Процедура 3. Инъекции
- Нижняя ступень впрыска с матерью и эмбрионов вниз, используя ручку регулировки Z-уровень (Рисунок 1), а затем поверните инъекционной иглы и установите руку и выстраиваются непосредственно с ультразвукового зонда, с иглой ½ см слева и под зонда (рис 7) , Нажмите игольчатые руку (не иглы) 45 ° вдали от зонда. Будьте осторожны, чтобы не ударить кончик иглы с блюдом или ультразвукового зонда.
- Поднимите этап инъекций Вернуться к первоначальной высоты, с ультразвуковым рхалат прямо над эмбрионов зонд должен быть слегка погружен в пределах 3-4 мм от эмбриональной ткани. Использовать рентгеновские & Y ступень регулирующего ручки (Рисунок 8) внести изменения в положение эмбриона / мать / Stage систематически местонахождение избиения эмбрионального сердца.
- Непосредственно центр ультразвуковой экране наблюдать черную центр целевой маркер обращается (*). Найдите левого желудочка (предпочтительно) или атриум с помощью ручки регулировки этап X и Y (рис 8), а затем поднять или опустить стадию с использованием ручки вращающийся на сцену, чтобы конечное положение впрыска точно над черным центрального маркера на экране ультразвука.
- Используйте ручку регулировки этап X, чтобы переместить эмбрион вправо, от экрана ультразвука. Повторно микроинъекции иглу и руки обратно на место, ½ см от 90 ° до ультразвукового зонда (рис 7).
- Использование микроинъекции крепления ручек регулировки (рис 9C-G), то положение иглы с наконечником ясно альigned с центральной маркера. Отрегулируйте угол впрыска (с помощью ручки на рисунке 9C и EG), и X, Y, и Z векторы микро-иглы для обеспечения кончик иглы ориентирована в правильном плоскости. Уберите микроинъекции иглу с помощью исключительно на "инъекцию" ручку (рис 9F), стараясь не изменить другие размеры.
- Опять же, используя исключительно X тонкой ручкой регулировки этап перемещения эмбриона обратно под зондом, с целью точно на центральной меткой на экране ультразвука. Убедитесь, что левый желудочек теперь точно на том же X, Y, и Z плоскости.
- Далее, только с "инъекции" ручку на микроинъекции крепление, медленно проколоть эмбриона с микроинъекции иглы и постепенно довести наконечник в левый желудочек. Вводите полные 2,5 мкл TL раствора в левый желудочек или до пустых звуков предупреждающий сигнал, путем проведения "пустой" и нажав "заполнить" один раз (рис 2А & B). В это времявпрыска наблюдать тень, исходящую от кончика иглы, которая TL ввода в сердечной камеры (рисунок 10). В обратном направлении, быстро убрать микроинъекции иглу вращающийся "инъекции" ручку (рис 9F) на микроинъекции установить, когда инъекция завершена.
- Продолжить на следующей эмбриона и повторите эту процедуру для оставшихся эмбрионов, следующих за этим ряд шагов, и, наконец, поставить окончательные эмбрионов обратно в живот плотины. Включите анестезии в камеру коробки и осторожно двигаться сюда мать в течение 15 мин со времени последней инъекции.
4. Сбор эмбрионов и анализ
- Жертвоприношение плотину с помощью смещения шейных позвонков. Развернуть лапаротомия разрез с легкостью удалять рога матки от матери. Держите эмбрионов в матки мешка. Поместите эмбрионы в охлажденном PBS.
- Проанализируйте эмбрионов из матки мешка (при необходимости собирать ткань для генотипирования) и поместите весь эмбрион яп 4% параформальдегид (PFA) в течение ночи, а затем в 30% сахарозы в одночасье, заморозить в криостат секционирования среду. Затем вырежьте cryosection и поместить его на слайды для иммуногистохимического анализа. Возможно, использовать ткани для целого монтажа путем дегидратации в 100% метанола, после фиксации в 4% PFA.
- Для иммуногистохимического анализа поместить криосрезы в PBS, чтобы удалить октября Затем блок секции 10% нормальной сыворотки осла в течение 30 мин. Затем добавить РЕСАМ первичного антитела в разведении 1: 100 в течение ночи при 4 ° С. На следующий день, мыть слайдов в PBT 3 раза по 10 мин каждый и добавить осла против крысу 594 среднее и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень требовательных техника требует оптимизации и координации ультразвука и микроинъекции. Существует очень крутой кривой обучения, связанные с этой технологией и требует 5:56 недель обучил инъекций, прежде чем становится опытным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сосудистые образования предшествует поток в развитии почек
Большинство из эмбриональной ткани (в том числе почки) содержит плотную сосудистую (как unperfused и перфузии), даже на ранних эмбриональных моменты времени. Чтобы лучше калибра и анализа кровотока в развивающихся почек мы использовали метод внутриутробному эмбриональных внутрисердечной микроинъекций. С использованием ультразвука высокого разрешения для выявления эмбриональных сердце в E11.5 через E17.5 и после извлечения и воздействия одного матки мешочка через лапаротомии, мы смогли внедрить 2,5 мкл TL (флуоресцеинизотиоцианат (FITC) -conjugated).
Мы нашли самый большой успех для инъекций E13.5 и E15.5 эмбриональных моменты времени, с вероятностью успеха примерно ~ 80% до 90%, соответственно. Из-за присутствия относительно незрелых сердца у E11.5 и наличием плотного хряща и образованием кости в E17.5, периферийное тия точки сравнительно трудно ввести, с существенно более низкой вероятностью успеха в сравнении с средним эмбриональных моменты времени. Можно ожидать, по крайней мере, ~ 50% и ~ 30% ставки успеха с E11.5 и время E17.5 пунктов соответственно.
СО-маркировки ткани с PECAM (CD31), универсальной эндотелия маркера, мы можем качественно классифицировать люминесцентные сосуды и ткани на три группы: перфузии сосудистой (PECAM положительный и TL положительный), unperfused сосудистой (PECAM положительный), и аномально перфузируемые структуры (TL положительным). Это определенный шаблон окрашивание позволяет пространственно различать между областями перфузии и ООН-перфузии (Рисунок 11).
В E11.5, мы обнаружили, что перфузируемые суда инкапсуляции развивающихся почек в виде ленты, узор, фактически не проникая в орган (рис 12б). По E13.5, крупные сосуды вливают несколько меньше,аксессуары суда окрашивание TL (рис 12С). Окрашивание также может рассматриваться в течение часть мочеточника эпителия, это может быть либо из клубочков, которые уже перфузии или из-за присущей неплотности ранних эмбриональных сосудов. По E15.5 основные сосуды перфузией, однако большое число клубочков также можно было наблюдать проведении TL пятно, предполагая, что значительное фильтрации происходит (рис 12г). Также в это время отмечают ряд более мелких сосудов калибра появляются перфузии, хотя значительная часть внешней нефрогенной зоны, как представляется, лишена кровотока. Наконец, однако, E17.5 большинство почки заливают в сосудистой сети нефрогенной зоны, которая является преимущественно лишена перфузии (менее плотной в РЕСАМ положительных сосудов), таким образом, указывающий на отсутствие ангиогенеза в периферийных областях, кроме. Небольшие суда калибра содержать TL и среднее число перфузии клубочков резко вувеличилась по сравнению с предыдущими временных точках (рис 12е).
Рисунок 1. Ультразвукового зонда, хирургический этап, система микроинъекции, топливная система и ЭКГ / температуры монитор базовый набор до.
Рисунок 2. Необходимо хирургическое оборудование, решения и устройства. (A) ватным аппликаторы. (B) Продление (кольцо) щипцами. (C) Хирургические ножницы. (D) с тупым концом пинцета. (E) тонким пинцетом. (F) Микроинъекция иглы (ORIGIO, # C060609). (H) Раствор для инъекций / Fill контроллер. (I), забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). (J) Минеральное масло (Sigma Aldrich).
Рисунок 3. 2 см лапаротомия выполняется на наркоза матери, подвергая подкожный слой (передней брюшной стенки) выше матки. Используя хирургические ножницы и тонких щипцов, подвергают белой линии и сделать разрез параллельно, чтобы сократить эпидермиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию рисунка.
Рисунок 4. 1-2 E15.5 матки мешочки выводится через лапаротомии разрез и экспозиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеверсия рисунка.
Рисунок 5. Открытые матки мешочки направляется через щель в фенестрированной чашке Петри с использованием проходящих щипцами. Фенестрированные сетки места ожидающий на базе мешочков.
Рисунок 6. Голубой содержащий стена находится справа от матки мешочков. Петри не заполнен 37 ° C PBS до эмбрионов и содержащий стенку полностью погружен в воду. Глиняные блоки размещены надежно под чашки Петри / эмбриона между руками и туловищем и ногами и хвостом.
Рисунок 7. Система впрыска позиционированием Нед ½ см слева и ниже, и 90 ° к ультразвукового зонда.
Рисунок 8. Стадия X и механизмы регулирования Y.
Рисунок 9. Пустой / Fill устройство, систему микроинъекции и стадии крепление. Кнопку () Заполните. (B) кнопку Inject. (C) Ручка регулировки угла круговые спицы. (E) Штраф X ручка регулировки. (F) "Injection" ручку. (G) курс X ручка регулировки. (H) Этап поворотный переключатель высоты регулировки.
98fig10.jpg "/>
Рисунок 10. Ультразвуковое изображение E15.5 внутри-сердечной TL микроинъекции. Кончика иглы расположен внутри сердечной камеры, решение TL указывается черной тенью в течение двух палат. Перикард и полости перикарда легко отличить.
Рисунок 11. Области между перфузии, unperfusion и аномальным окрашивания различить. Первая панель показывает PECAM пятно. Средняя панель отображает TL пятно над точно так же участка ткани. Мочеточников бутон аберрантно пятнами; основные сосуды заключены белыми пунктирными линиями. Последняя панель является слияние. Белые стрелки показывают утечку сосудов, а серые стрелки показывают переход в сторону судна становится перфузии. Желтые структуры представляют собой полностью перфузии сосудов.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Рисунок 12. Эмбрион и почек перфузии онтогенез исследованы. () Всего E11.5 эмбриона перфузии, с очень периферических сосудов внутри головы и хвоста регионах, занимающих TL. (B) перфузируемые суда были замечены вокруг, но не включены в развивающихся почек на E11.5 в виде ленты, узор, есть также довольно большое количество диффузного окрашивания в этой точке. (C) E13.5 почек показывает основные, крупные сосуды калибра перфузируют всей почек (белого и желтого стрелкой), с перфузией отсутствующего в нефрогенного зоны (белый пунктир). (D) E15.5 почек показывает перфузии в течение малого калибра, периферических сосудов (желтые стрелки),в отдельных клубочков (белые стрелки), и снова отсутствием перфузии в периферийной каминной полке почек. (E) E17.5 почек показывает огромный перфузии всей клубочков (белые стрелки) и мелкие сосуды калибра (желтые стрелки). Нефрогенная зона ничем не отличается от остальной части почки в этом увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микроинъекция анестезия и временные рамки
Что касается анестезии матери, важно, чтобы поток воздуха константу (2-3 л / мин) и при низкой PSI. Поток успокоительное должно быть проведено примерно в 1.75-2 л / мин. Одновременно, сроки, в которых инъекции происходят должны быть тесно мониторинг и контроль над с каждого помета. Для каждого помета процедура инъекции должен находиться под 45 мин. Важность этого срока имеет первостепенное значение для эксперимента, так как каждый эмбрион должен поддерживаться в пределах постоянной, нормальной диапазоне частоты сердечных сокращений, чтобы облегчить контролируемый и неизменный перфузии по всему телу и органа интересов. Мы обнаружили, что удлинение инъекции результатов в сомнительных результатов и колебаний в структуре перфузии между эмбрионов и снижает тарифы успешных инъекций (например, медленно сердечного ритма, сердечная смерть). Наконец, после последней инъекции в помете, очень важночтобы примерно 15 мин до эмбрионы собирают в целях содействия надлежащему, полный перфузии в течение каждого эмбриона.
Процессуальное лечение и уход эмбрионов
Во время извлечения эмбрионов, мы нашли более высокие темпы успеха с помощью инъекций, которые проделанной постоянно посещать для общего здоровья и целостности оболочки матки и эмбрионов во время извлечения эмбрионов. Используя тонкие ватным аппликаторы (насыщенного PBS), чтобы манипулировать и маневрировать матки мешок и мешочки являются обязательными для обеспечения выживания матери и эмбриона в течение всей процедуры. Во-первых, важно обеспечить, чтобы физическая целостность матки и плаценты надлежащим образом. Избегайте кривя в мешочки таким образом, что будет препятствовать притоку крови к эмбрионов или вызвать значительные разрывы в кровеносных сосудов, снабжающих приток крови к плаценте. Это может быть достигнуто путем извлечения Maximuм 1-2 эмбрионов, в то время (если извлечение весь маточный мешок для начального отсчета) и позиционирования аппликатора от крупных кровеносных сосудов у основания плаценты.
Расположение в месте инъекции эмбриональных
Руководящие микроинъекции иглу в нужное место с машиной ультразвука также имеет важное значение для каждой попытки введения. Особое внимание следует уделить обнаружения и центровки левого желудочка на центральный маркер. После этого игла должна быть расположена и по центру точно по центру, а маркер выровнять иглу и место инъекции в тот же X и Y плана. После завершения этого процесса, медленно сделать кончик ближе к месту инъекции иглу и избегать применения чрезмерных нагрузок на перикард и сердца. Это можно сделать, позволяя игла постепенно проходит через ткани слоев, а не заставляя прохождение иглы через них. Во время инъекции, важно также, чтобы лООК за черной тенью, исходящей от кончика иглы (Рисунок 10). Это свидетельствует о TL решения, заполняющего желудочка. Если кончик иглы находится в правильном положении, тень должна постоянно появляются и исчезают, как TL выбрасывается в аорту. Однако, если полость перикарда, кажется, поглощать, это свидетельствует, что игла слишком поторопился с левого желудочка и TL решение заполнения полости перикарда, окружающей сердце. Это распространенная ошибка, что легко исправляется путем перестановки инъекционной иглой на его X и Y плоскости с любыми небольшими изменениями, происходящими с иглой еще в зародыше. Избегать извлечения иглы из эмбриона на этой стадии.
Ультразвуковая ориентироваться в естественных условиях ограничений микроинъекции
По своей сути, УЗИ микроинъекции имеет ряд принципиальных технических ограничений. Прежде всего, объем иглы микроинъекциимощность ограничивает возрастной диапазон инъекций до E17.5 у мыши. 2,5 мкл раствора TL, как было показано в наших исследований, чтобы полностью заливать эмбрионов до E15.5. Тем не менее, только после этого момента времени, TL к объему крови становится ничтожна и разбавляли эффективно пометить периферийных почек эндотелиальные мембраны. Таким образом, уменьшается картина кровотока присутствует в более поздний момент времени инъекции. Кроме того, формирование кости и хряща у эмбрионов создает естественный барьер для кончика иглы, что приводит к удлиненным времени впрыска и частых трещин в головке иглы. Эти ограничения могут быть преодолены путем использования системы новые инъекций больших мощностей прочности иглы и объема.
Альтернативные методы отображения эмбриональные кровотока
На сегодняшний день, альтернативные методы отображения эмбрионального потока крови мышей включать осуществление смолы слепков, окрашивание иммуногистохимии и высокий resolut ионная ультразвуковое исследование. Как смол бросает (с интеграцией передовых методов визуализации) в настоящее время наиболее популярной альтернативой, этот вопрос будет обсуждаться более подробно ниже. Смола отливок позволяют для создания точных трехмерных представлений потока в послеродовой органов. Однако, мало успех был имел с изображения пренатальной почечной ткани вследствие пористой сосудистой крови и ограничений в разрешении. Для сравнения, конъюгированные TL пятна обеспечить сцепление с эндотелиальными мембранные антигены, ведущие к более высокой степени точности. В других случаях, вязкость смолы, которые бросили преждевременно обрезает поступать в клубочки сосудов и мелких капилляров кровати, создавая исследуемого ограничение на высоких увеличениях. При более низких увеличениях, этот метод, очевидно, жизнеспособным на установление структуры потока в отношении развивающихся регионах. С другой стороны, TL позволяет с высокой разрешающей анализ кровотока по отношению к развития структур на клеточном уровне.
ЛОР "> Будущее применение и направленияНаши данные показывают, что кровоток и насыщение кислородом являются критическими факторами по отношению к нефрона дифференциацию клеток-предшественников. Для дальнейшего выяснения их роли в почечной развития, будущие исследования должны очертить основные анатомические механизмы провоцирующих эту физиологический процесс, а также изучить транскрипции сигнальные пути, которые обеспечивают этому явлению. Одна из гипотез, в отношении преодоления разрыва между явлением и механизма является то, что гладкомышечных клеток и перицитов агрегаты играть способствующих роль в оркестровки переходного усечение кровотока в стволовых клеток регионах развивающихся органов. Для того, чтобы проверить это, дальнейшего иммунофлуоресцентного окрашивания и анализ должны проводиться с акцентом на этих типах клеток в нефрогенного границе зоны. С точки зрения будущих исследований, лежащая в основе сигнальных путей, мы хотели бы изучить роль индуцируемого гипоксией факторов иФон Hippen Линдау сигнальных путей. Оба эти были в значительной степени вовлечены в течение литературе играют важную индуктивные роли в поддержании гипоксии и насыщенным кислородом среды в стволовых клеток регионах (в основном рассматриваются как гипоксическая) и участков дифференциации (областей, в наибольшей степени нуждаются в оксигенации), соответственно. Кроме того, мы хотели бы допросить роль эритропоэтина (ЭПО) в опосредовании процессов ангиогенеза и васкулогенеза в ходе развития почек сосудистой. ЭПО почечная гликопротеин, который играет важнейшую роль в эндотелиальных дифференциации и технического обслуживания. Его роль в крови опосредуется эндотелиальной дифференциации в значительной степени неизвестно. Наконец, мы хотели бы провести в естественных условиях экспериментов микроинъекции с сосудорасширяющих соединений в целях дальнейшего укрепления обоснованность этих исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5,000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5 µl / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
- Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
- Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
- Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
- Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
- Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
- Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
- Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
- Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).
