Abstract
早期発見は、ほとんどの疾患の治療の成功の鍵であり、多くの型の癌の診断および治療のために特に不可欠である。利用される最も一般的な技術は、磁気共鳴イメージング（MRI）、陽電子放射断層撮影（PET）、及びコンピュータ地形（CT）のようなモダリティを撮像し、疾患の物理的構造を把握するために最適であるが、一度だけ実行されるすべての4つまですることができている造影剤と全体的なコストを使用しているため6週間。同様にこのことを念頭に置いて、そのような臨床医のオフィスで、疾患の段階及び/又は治療の有効性を評価し、適時にそうバイオセンサ、などの「ポイントオブケア」の開発技術は、治療プロトコルに革命をもたらすであろう。1生物学的に関連する分子2の検出のためのフェロセンベースのバイオセンサーを探求する手段は、方法は、本明細書に記載フェロセン-ビオチンバイオコンジュゲートを生成するために開発された。このレポートは、金表面に固定化することができるビオチンフェロセン - システインシステムに焦点を当てます。
Introduction
バイオセンサは、選択的分析のためのプラットフォームとして、生体分子認識技術を採用し、その特異性、速度、および低コストのために利用される小型の装置である。生体分子の検出のための電気化学的バイオセンサは、そのシンプルさ、コスト効率、高感度のために、この分野の最前線にある。これらのセンサの1,3一般的な解剖学は、対象とする生物学的マーカーに特異的な認識分子を搭載した電極である。認識分子によりバイオマーカーの結合は、簡単な測定によって検出され得る電位または電流の局所的な変化をもたらす。認識部分とデートするには、酵素、4-8抗体、9-12細胞全体、13-16受容体、17-20ペプチド21-23とDNA 24の範囲とすることができる、大部分が大きく、生物学的分子に焦点を当ててきた。25-28リサーチこの分野での取り組みは、主にWHE免疫センサーに集中している免疫再（フェロセンなど）、レドックス活性コアを固定化し、目的の抗体を検出するために使用される。これらの研究は、抗原/抗体の使用に起因する合併症に起因する不良による精度と時間消費への臨床応用から除外されている。1,3栽培注意が生物医学の小分子の検出（未満1キロ/モル）に焦点を当てている、食品や国家安全保障に加えて、環境の関心。29バイオセンサーデバイスの最もよく知られている例は、ポケットサイズの電流測定メーターに接続されたスクリーン印刷された酵素電極を有するセルフテストグルコースモニター、である。これらのシステムは、典型的には、グルコース酸化反応で発生した電荷の総量は、ある期間にわたって測定された電量分析法を利用する。市場性のあるデバイスは、携帯用堅牢でなければならない一般の集団のために容易に利用するためにハンドヘルド。
フェロセン等のレドックスタグがnecessaですほとんどのバイオマーカーは、本質的に電気化学的に活性でないように、溶液中のバイオマーカーまたは小分子の電気化学的検出を提供するために、RY。30-38フェロセンは、電気化学的バイオセンサーへの統合のための優れた選択肢となり電気化学のゴールドスタンダードであり、有機金属分子である。フェロセンベースの酸化還元活性種はすでにサイズが小さいため、優れた安定性、便利な合成アクセス、容易な化学修飾、相対的な親油性、及び酸化還元チューニングのしやすさにかなりの注目を集めている。3,30-42小分子を有するフェロセンコアをベース金属イオンや小分子の検出器として広く使用され、このような生体分子のようなより大きな化学種を標的32-38,43システムは、電気化学的表面上に埋め込 まれたフェロセン誘導体大きな抗体または免疫グロブリンの結合を利用している。1,3,39 、それぞれの場合には44、潜在的な、現在のintensi鉄III / II鉄の酸化還元対のティは、このように、分析物分子の存在を示す新たな分光ハンドルを生成する、分子の結合の際に変化した。この変更は、シクロペンタジエニル環のπシステムと鉄のd軌道との間で発生した大規模なオーバーラップから生じる。パイ-システムが変更された場合、 すなわち、誘導体化するか、または、その後軌道相互作用が意志、順番に、変更を反応させた。これは、鉄芯に影響を与えるとFe III /鉄II対の電位の変化として観察することができる。40,45,46これらのプロパティは、電気化学的イムノアッセイまたはバイオセンサーで定量化剤として使用するためのそのようなシステムは魅力的である。
バイオセンサーの能力のために特定のフェロセンを含むシステムを製造するためには、標的分子に特異的なバイオレセプター、ワンCp環を変更して、電気化学的読み出しまたはELECの分子テザーのような他のCp環を利用することが最適であるtrode（ 図1）。これらの非対称のフェロセン誘導体の合成は、副反応および分子間架橋の際に形成された二量体およびポリマー種の形成によって攻撃される。47が、アミド結合を生成するカップリング化学は、このような生物学的成分を含むフェロセンの単純な誘導体を提供するための最も直接的なルートであるペプチドおよびその代謝物など。したがって、第一のペプチド合成メリフィールドによって、1950年代に開発された固相技術は、フェロセンを含有する有機金属化合物に適用することができる。有する直交置換1'-のFmoc-アミノフェロセン-1-カルボン酸分子、受容体部分（ビオチン）、電気化学的な読み出し（フェロセン）と固定リンカー成分（システイン）を含むことができるフェロセンシステムの使用を介して構築され、本明細書に詳述されて。このバイオコンジュゲートの合成は、金表面上に固定化するための証拠としてだけでなく、議論されている。この作品のrepresenビオチン、フェロセン及び金表面上に固定化するためのアミノ酸から構成されるシステムの最初のプレゼンテーションのts。
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Protocol
ビオチンFcのシステインの1の合成（1）
- 樹脂に結合した1を製造する固相法。
- フリットシリンジにビオチンロードされた樹脂（250mgを、0.145ミリモル）を配置し、ジメチルホルムアミド（5ml）に策定し、20分間ラボシェーカー上で注射器を振盪することにより樹脂を膨潤させる。ソリューションを追放し、1より多くの時間を腫れジメチルホルムアミドを繰り返します。
- 振とうの10〜15分、続いて注射器に、ジメチルホルムアミド中20％ピペリジン4-6を加えてFmoc保護基を除去する。ピペリジンの別の4〜6ミリリットルで脱保護処理を繰り返します。 3×ホルムアミド、3倍のジメチルホルムアミド順序で樹脂を洗浄：メタノール（1：1）、3回メタノール：ジクロロメタン（1：1）、3回ジクロロメタン、約5 mlずつ。加熱時のブルーの存在によって成功した脱保護を確認するためにビーズの小さなサンプリング（〜10）にニンヒドリンテスト（+）を行います。
- 1'-のFmoc-アミノフェロセン-1-カルボン酸を含む溶液を混合する（203.3ミリグラム、0.4350ミリモル）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（58.8ミリグラム、0.413ミリモル）、ジイソプロピルカルボジイミド（0.0673ミリリットル、0.435ミリモル）、ジイソプロピルエチルアミン（0.0757ミリリットル、0.435ミリモル）、および4：ジクロロメタンの1：1混合物とジメチルホルムアミド。フリットシリンジにこれを描画し、軽く6時間ラボシェーカーで振る。その後、注射器からソリューションを追放し、前述のように洗う。
- カップリングを確認するために、上記のように - （）ニンヒドリンテストを実行します。ニンヒドリン試験は、まだ部分を含む鉄の結合から誘導されるビーズのオレンジ色にもかかわらず、結合を確認するのに有用であり得る。
- その後、ジメチルホルムアミド中20％ピペリジンを添加することによりFmoc基を除去し、上記のように洗浄した。ニンヒドリン試験（+）は、Fmoc除去を確認するために使用されるべきである。
- のFmoc-Cysの（Trt）と-OH（254.8ミリグラム、0.4350ミリモル）、ジイソプロピルカルボジイミド1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（58.8 mgの、0.4125ミリモル）、（0.0673ミリリットル、0.4350からなる溶液を準備ミリモル）、ジイソプロピルエチルアミン（0.0757ミリリットル、0.4350ミリモル）、および4：ジクロロメタンとジメチルホルムアミドの1：1混合物。このシステインカップリングカクテルのフリットシリンジを加え、穏やかに6時間振る。以前に記載されたプロトコルを使用して洗ってください。
- 20％ピペリジンと洗浄とのFmoc成分を除去し、（ - ）ニンヒドリン試験を用いてカップリングすることを確認します。ニンヒドリン試験（+）を使用して、アミン遊離ターミナルを確認してください。
- 樹脂からの1の切断。
- TFAの溶液（9.45ミリリットル）、水（0.25 ml）を、1,2-エタンジチオール（0.25 ml）を確認し、トリイソプロピルシラン（0.1mL）を、シリンジに追加し、4時間穏やかに振とうする。
- エッペンドルフチューブ中で、得られた赤茶色の溶液を収集し、空気流を用いてゆっくりとTFAを蒸発させる。
- 穏やかな撹拌を形成するであろう、1を沈殿さエッペンドルフチューブに冷ジエチルエーテル（〜15ml）に加える。遠心分離を介して生成物（1 gで5分）を単離する。 Tジエチルエーテル洗浄液（~60 mlの総）及び遠心分離機の鶏反復サイクルは、赤/褐色の固体として1を得た。
1の2。評価と解析
- アイデンティティは1 H（16スキャン）と重水素化メタノール（300μL）およびESI-MS分析における13 C NMR（512スキャン）を使用して、 図2に示す接続性や組成と一致していることを確認してください。
以下の結果を期待する：
1 H NMRスペクトル（CD 3 OD）δ/ ppmで：1.407から1.684（メートル、6H）、2.245（トン、2H）、2.665から3.150（メートル、12H）、4.015（トン、1H）、4.104の（d、2H ）、4.274（qは、1H）、4.426の（d、2H）、4.479（qは、1H）、4.595（tは、1 H）及び13 C NMRスペクトル（CD 3 OD）δ/ ppmで：24.644（CH 2）、25.472 （CH 2）、28.051（CH 2）、28.300（CH 2）、35.474（CH 2）、38.698（CH 2）、39.241（CH 2）、39.717（CH 2）、55.340 / 55.538（Cpのリング） 60.286（CH）、61.964（CH）、62.521 / 62.821（CPリング）、66.038 / 66.170（CPリング）、69.153 / 69.328（CPリング）、71.468 / 71.593（CPリング）、76.466（CH）、171.770 （C = O）、175.361（C = O）。
ESI-MS（M / z）は：実測：639.00 [1 +のNa] +、理論値：639.1 [1 +のNa] +とHR-MS（M / Z）：実測：617.2049 [1 + H] +、理論値： 617.1622 [1 + H] +。 - 孤立した1の組成を確認するために、HPLC、元素分析を行います。
C8を使用して実施するHPLCクロマトグラムを0.5ml /分の流速で100％MeOHを用いて逆相カラム。注：HPLC保持時間は以下の通りであった：3.198から4.674分。
金表面上の1の3の固定化
- 2〜0.25の正方形にポリマー担保金のスライドをカット。
- 1（〜1ミリモル）のDI水溶液で50mlのビーカーを埋める。
- ビーカーに金のスライドを追加し、時計皿でカバーしています。すべてフローガラススライドを撹拌せずに室温でO / Nインキュベートした。
- 溶液からの金のスライドを削除し、空気中のそれが乾燥許す。
- 1を固定化した観察する走査型電子顕微鏡（または同等品）を用いた走査型電子顕微鏡像を得る。
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Representative Results
1の樹脂結合形態は、 図2に示されている。フェロセン成分の共有結合により、鉄吸収とは異なり連続的な洗浄で永続と複合体を含む固定化された鉄の指標である樹脂ビーズのオレンジ色合いを生じさせる樹脂ビーズのPEG成分。 1の樹脂を含まない形態では、樹脂ビーズの色が同じである。樹脂ビーズから化合物を除去した後、方法から得られた純度および収率（68％）は、典型的な溶液法よりはるかに優れている。生成物の元素分析では、1が TFA塩として単離したことを示した：計算値（発見）C 26 H 36 FeNから6 O 4 S 2 4TFAのために：C、38.07（38.90）; H、3.76（4.20）; N、7.83（7.70）。典型的な反応から得られた収率（105.1ミリグラム、68％）を元素分析結果に基づいている。重水素化メタノールプロブでNMR分析IDED 1 H NMRスペクトル（CD 3 OD）δ/ ppmで：1.407から1.684（メートル、6H）、2.245（トン、2H）、2.665から3.150（メートル、12H）、4.015（トン、1H）、4.104（dは、 2H）、4.274（qは、1H）、4.426の（d、2H）、4.479（qは、1H）、4.595（tは、1 H）及び13 C NMRスペクトル（CD 3 OD）δ/ ppmで：24.644（CH 2） 25.472（CH 2）、28.051（CH 2）、28.300（CH 2）、35.474（CH 2）、38.698（CH 2）、39.241（CH 2）、39.717（CH 2）、55.340 / 55.538（Cpのリング） 、60.286（CH）、61.964（CH）、62.521 / 62.821（CPリング）、66.038 / 66.170（CPリング）、69.153 / 69.328（CPリング）、71.468 / 71.593（CPリング）、76.466（CH ）、171.770（C = O）、175.361（C = O）。 HPLC保持時間は以下の通りであった：3.198から4.674分。 HPLC分析で観察された複数のピークは、元素分析を用いて、上記のように1のTFA塩であることが確認された。 図2に示された構造に相関質量分析：ESI-MS（m / zを）：実測値：639.00 [1 +のNa] +、理論値：639.1 [1 +のNa] +およびHR-MS（のm / z）：実測値：617.2049 [1 + H] +、理論：617.1622 [1 + H] +。電子吸収スペクトルは、434（324.26） を水中で得られたλmaxが示された（ε、M -1 cm -1で）268（4,779.8）した。
バイオコンジュゲート1の溶液中の小さな金スライドをインキュベートするために使用される方法は、図3の概略図に示されている。金の薄層裏面ポリマー材料と1の溶液に添加し、O / Nでインキュベートした。金次いで、スライドをDI水で洗浄し、乾燥させた。付随して、金スライドをDI水で共インキュベートし、同様に洗浄した。 図4に示す2つのサンプルのSEM画像は、金スライド1との共インキュベーションの表面が変更されたことを示した。これがあることを示し1のチオレートの相互作用は、金表面への結合のアンカーを提供する。
バイオセンサーの1基本図。電気化学的バイオセンサの具体的な例は、直接溶液中で標的を検出する。
バイオコンジュゲート1の溶液中の小さな金スライドをインキュベートするために使用される1の方法を生成するために使用される図2の合成法は、図3の概略図に示されている。バックポリマー材料と金の薄層の溶液に添加した1及びO / Nをインキュベートした。金次いで、スライドをDI水で洗浄し、乾燥させた。付随して、金スライドをDI水で共インキュベートし、同様に洗浄した。 2つのサンプルのSEM像図4に示すように、金スライド1との共インキュベーションの表面が変更されたことを示した。これは、1のチオレートの相互作用が金表面への結合のアンカーを提供することを示している。
金スライド上に1の固定化を示す図3の概略図は 、処理は 、水にバイオコンジュゲートを溶解させ、金スライドを加えることを含む。インキュベーションO / Nスライドの洗浄が続く。成功した固定化のための分析は、図4に示す走査型電子顕微鏡を用いて行われる。
プラスチック、ポリマーフィルム上に層状に金の図4のSEM画像（A）インキュベーションサンセリフ 1及び（B）のfollowing水O / N 1とのインキュベーション、および水ですすぐ。
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Discussion
非対称のフェロセン誘導体の合成は、溶液中に挑戦されている。例えば、溶液中の1を製造する試みは、所望の生成物（20％未満）の低い収率をもたらした。同様に、1'-アミノフェロセンカルボン酸（ サンセリフのFmoc）および樹脂結合ビオチンを利用する反応はBaristic らによって報告重合生成物と一致して不溶性生成物をもたらした。そして最小限の製品。47これをさらにフェロセンによって複雑とその誘導体は光感受性であるとアミノ酸同族体は、溶液中で二量体化する傾向があることをされている。これらの問題は、大規模な反応や精密検査を難しくする。しかし、この反応性は、最初のペプチドの合成のためのメリフィールドによって開発された固相法を用いて回避することができる。フェロセン-ペプチドシステムの合成は、いくつかのグループによって注目を集めていると非対称のペプチド-フェロセンシステムのライブラリーにつながっている。46,48-52仕事ビオチン - フェロセンシステインを含む第1の非対称フェロセンバイオコンジュゲートの合成は、本明細書に詳細に記載。この化合物は、他の小分子の受容体は、生物学的に関連する分子の検出のために考慮することができたを通じてモデルとして役立つ。本研究では金表面に固定化テザーとして利用した。
合成の第一段階は、アミンベースのリンカーを用いて固体樹脂上に固定化されたビオチンコアを得ることであった。 N -Biotin- N '-Fmoc-エチレンジアミン樹脂は、ビオチンNovaTag樹脂として商業的に購入することができ、バイオコンジュ1の基盤として使用された。 Fmoc-アミノ酸保護基の脱保護の成功を確認したニンヒドリン試験ジメチルホルムアミド中のピペリジンの20％溶液と陽性（青）を用いて除去した。樹脂に結合したビオチンの遊離アミンは、次いで、ジイソプロピルエチルアミンからなるカップリングカクテルを使用して、フェロセンを固定するために使用されたジイソプロピルカルボジイミド、および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物。40,46フェロセン前駆体などの種々の目的のために利用可能であり、フェロセンカルボン酸1'- Fmoc-アミノ酸、フェロセンカルボン酸が挙げられる。旧システムの使用は、1つのビオチン付属物で修飾されたシクロペンタジエニル環のを有するモノ置換バイオコンジュゲートを生成する。後者のフェロセン誘導体は、カルボン酸およびFmoc保護アミノ基を有するシクロペンタジエニル環の直交置換で構成されている。このような置換は、例えば1バイオコンジュゲートを生成するためにシクロペンタジエニル環の個別の修正を可能にフェロセンコアの拡張非対称的な修飾を可能にする。 図2に示すように、淡黄色のビーズがビオチン樹脂コアにフェロセンのカップリングが成功時に明るいオレンジ色の色相に変化した。
合成の次の段階では種々のリンカーを取り付けることができる樹脂に結合したフェロセン同族体の遊離アミンへ。それはアミノ酸を含むチオラートであるので、このシステムの目的のために、システインを利用した。後述するようにチオラート成分は、金表面へのバイオコンジュゲートの結合を可能にする。のFmoc-Cysの（MMT）-OHを持つ樹脂結合系の反応によって進行したシステインと変更。ジメチルホルムアミド中20％ピペリジンでFmoc基の除去は、1の樹脂結合形態をもたらす。樹脂に結合したバイオコンジュゲートは、トリフルオロ酢酸（TFA）、水及びトリイソプロピルシランの溶液を用いて、バイオ有機金属系の開裂により、固体支持体から除去した。元素及びNMR分析によって確認されるように酸性溶液と冷ジエチルエーテルの添加を蒸発させて、1の赤橙色の固体に決定するためのTFA塩としてのバイオ結合体1を得た。純度は、HPLC分析によって確認した。
のための原理の証明を表示するには金表面上のバイオコンジュゲート1,1の堆積のための取付テザーを提供するシステイン成分を調査した。よく知られたAu-Sの親和性は、ポリマー担保金表面上の1の容易な固定化を可能にします。この実験において、金表面を洗浄し、穏やかに研磨した。次いで、スライドを1〜1 mMの水溶液に浸漬し、O / Nに設定した。 Au表面を蒸留水で洗浄し、キムワイプで乾燥した。金次いで、スライドをSEMを用いて、修飾のために評価した。 図4に示されている画像は、金表面上に形成された1の単分子層の代表的なものである。表面の欠陥は、1の単層の「穴」の結果であると仮定し、私たちのグループによるさらなる調査中であるされている。
全体的に、合成法は、その缶フェロセンバイオコンジュゲートを生成する金表面上に固定化することが報告されている。作業は、非対称フェロセン化合物のその合成における新規な低い収率および純度をもたらす副反応のアレイによって挑戦である。 1と同様フェロセン-バイオコンジュゲートは、潜在的なバイオセンサーなどのアプリケーションを持っているように、これらの合成の困難を克服することは最も重要です。固相ペプチド合成に類似した固相方法を用いて、ビオチン-フェロセン-システインを含んでよく特徴付けバイオコンジュゲート1は、製造されている。また、SEMは、このシステムは金表面にシステイン成分のチオ部分のおかげで接着することができることを示すために使用された。全体として、本明細書に提供される単純な合成方法論を容易にするペプチド配列とアプリケーションのアレイのためのバイオコンジュゲートのシステムのために改変することができる。
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Acknowledgments
KGは、RAウェルチ財団補助金P-1760、（KG）は数学と科学教育のTCUアンドリュース研究所、（KG）はTCU研究と創造活動グラントと（JHSへ）TCU SERCグラントによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin Novatag Resin | NovaBiochem | 8550510001 | |
| TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe | Fisher | NC9299151 | |
| piperidine | Acros | P/3520/PB05 | |
| ninhydrin test | Sigma-Aldrich | 60017-1ea | |
| 1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid | Omm Scientific | Special Order | |
| N,N′-Diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407-5G | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Novabiochem | 8520080025 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T5408 | |
| 1,2-ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 2930 | |
| triisopropyl silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Eppendorf tubes (20 ml) | any source | ||
| methanol | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dichloromethane | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dimethylformamide | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| centrifuge | any source |
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