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Chemistry

Metodología sintética para asimétrica Ferroceno derivados Sistemas de Bio-conjugadas vía sólida metodología a base de resina de fase

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52399
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Texas Christian University

Abstract

La detección temprana es la clave para el éxito del tratamiento de la mayoría de las enfermedades, y es particularmente imprescindible para el diagnóstico y el tratamiento de muchos tipos de cáncer. Las técnicas más comunes utilizados son Imaging modalidades tales como imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de Topografía (PET), y computarizada Topografía (TC) y son óptimas para la comprensión de la estructura física de la enfermedad, pero sólo se pueden realizar una vez cada cuatro a seis semanas debido a la utilización de agentes de formación de imágenes y el coste total. Con esto en mente, el desarrollo de "punto de atención" técnicas, como biosensores, que evalúan el estado de la enfermedad y / o la eficacia del tratamiento en el consultorio del médico y lo hacen de una manera oportuna, revolucionaría protocolos de tratamiento. 1 Como un medio para explorar biosensores basados ​​ferroceno para la detección de moléculas biológicamente relevantes 2, se han desarrollado métodos para producir bio-conjugados ferroceno-biotina descritos en este documento. Este informe se centrará en un sistema biotina-ferroceno-cisteína que puede ser inmovilizada sobre una superficie de oro.

Introduction

Los biosensores son dispositivos pequeños que emplean la tecnología de reconocimiento biomolecular como la plataforma para el análisis selectivo y se utilizan por su especificidad, velocidad y bajo costo. Biosensores electroquímicos para la detección de biomoléculas están a la vanguardia de este campo debido a su simplicidad, eficacia de costes, y alta sensibilidad. 1,3 La anatomía general de estos sensores es un electrodo equipado con una molécula de reconocimiento específica para el marcador biológico de interés . La unión del biomarcador por la molécula de reconocimiento se traduce en un cambio local de potencial o corriente que puede ser detectado por medición simple. Hasta la fecha, el fragmento de reconocimiento puede variar de enzimas, anticuerpos 4-8, 9-12 células enteras, 13-16, 17-20 receptores péptidos 21-23 y 24 de ADN y se han centrado en gran medida de mayor tamaño, las moléculas biológicas. 25-28 Investigación los esfuerzos en este campo se han concentrado principalmente en inmunosensores where una inmunoglobulina es inmovilizado con un núcleo activo redox (tal como ferroceno) y se utiliza para detectar un anticuerpo de interés. Estos estudios han sido excluidos de las aplicaciones clínicas debido a la escasa precisión y tiempo de consumo derivados de las complicaciones derivadas de la utilización de antígenos / anticuerpos. 1,3 creciente atención se ha centrado en la detección de moléculas pequeñas (menos de 1 kg / mol) de biomédica , la comida y el interés ambiental, además de la seguridad nacional. 29 Los ejemplos más conocidos de dispositivos biosensores son monitores de glucosa en la auto-prueba, que tienen serigrafiadas electrodos enzimáticos acoplados a un metro amperométrica bolsillo. Estos sistemas utilizan típicamente un método coulométrica donde se mide la cantidad total de carga generada por la reacción de oxidación de la glucosa durante un período de tiempo. Dispositivos negociables deben ser portátil, robusto y de mano para hacer un uso fácil para la población en general.

Etiquetas redox tales como ferroceno son necessary para proporcionar la detección electroquímica de biomarcadores o pequeñas moléculas en solución como la mayoría de los biomarcadores no son intrínsecamente electroquímicamente activo. 30-38 ferroceno es una molécula organometálica que es un estándar de oro para la electroquímica, lo que hace que sea una excelente opción para la integración en biosensores electroquímicos. Especies activas redox a base de ferroceno ya han ganado considerable atención debido a su pequeño tamaño, buena estabilidad, el acceso sintético conveniente, modificación química fácil, lipofilicidad relativa, y la facilidad de sintonización redox. 3,30-42 moléculas pequeñas basado en el núcleo ferroceno tiene han utilizado ampliamente como detectores de iones metálicos y moléculas pequeñas. 32-38,43 sistemas de focalización especies más grandes, tales como biomoléculas han utilizado la fijación de grandes anticuerpos o inmunoglobulinas a derivados del ferroceno que han sido incrustados en una superficie electroquímica. 1,3,39 , 44 En cada caso, la intensi potencial y actualty de la pareja redox Fe III / Fe II se alteró tras el acoplamiento molecular, produciendo de este modo un nuevo mango espectroscópica que indica la presencia de la molécula de analito. Este cambio se debe a la amplia superposición que se produce entre el sistema pi de los anillos de ciclopentadienilo y las de hierro orbitales d. Si el sistema pi se modifica, es decir, derivado o se hace reaccionar, a continuación, la interacción orbital, a su vez, el cambio. Esto afectará el núcleo Fe y puede ser observada como un cambio en el potencial del par Fe III / Fe II. 40,45,46 Estas propiedades hacen que un sistema de este tipo atractivo para su uso como un agente de cuantificación en un inmunoensayo electroquímico o biosensor.

Con el fin de producir sistemas de ferroceno que contiene específicas para capacidades de biosensores es óptimo para modificar un anillo de Cp con el específico para una molécula diana bio-receptor y utilizar el otro anillo Cp como una correa de sujeción molecular para la lectura electroquímica o elecelectrodo (Figura 1). La síntesis de estos derivados de ferroceno asimétricas es desafiada por reacciones secundarias y la formación de especies diméricas y poliméricas formadas sobre la reticulación intermolecular. 47 Sin embargo, la química de acoplamiento de la producción de un enlace amida es la ruta más directa para proporcionar derivados simples de ferroceno que implican componentes biológicos tales como péptidos y sus metabolitos. Por lo tanto, las técnicas de fase sólida desarrollados por primera vez en la década de 1950 por Merrifield de síntesis de péptidos se pueden aplicar a los compuestos organometálicos que contienen ferroceno. Mediante el uso de la molécula de ácido 1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico ortogonalmente sustituido, un sistema de ferroceno que puede contener un resto receptor (biotina), lectura electroquímica (ferroceno), y el componente de inmovilización-enlazador (cisteína) tiene ha construido y se detalla en este documento. La síntesis de este bio-conjugado se discute, así como pruebas para la inmovilización en una superficie de oro. Este represen trabajots la primera presentación de un sistema compuesto de biotina, ferroceno y un aminoácido para la inmovilización en una superficie de oro.

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Protocol

1. Síntesis de biotina-Fc-cisteína (1)

  1. Métodos en fase sólida para producir unidos a la resina 1.
    1. Coloque resina cargada biotina (250 mg, 0,145 mmol) en una jeringa de vidrio fritado y se hinchan la resina mediante la elaboración de dimetilformamida (5 ml) y agitando la jeringa en un agitador de laboratorio durante 20 min. Expulsar a la solución y repita dimetilformamida hinchazón una vez más.
    2. Eliminar el grupo protector Fmoc mediante la adición de 4-6 ml de 20% de piperidina en dimetilformamida a la jeringa seguido de 10-15 min de agitación. Repita el proceso de desprotección con otro 4-6 ml de piperidina. Lavar la resina con una secuencia de 3x dimetilformamida, 3x dimetilformamida: metanol (1: 1), metanol 3x: diclorometano (1: 1), 3x diclorometano, ~ 5 ml cada uno. Hacer una prueba de la ninhidrina (+) en una pequeña muestra (~ 10) de las perlas para confirmar la desprotección con éxito por la presencia de azul después del calentamiento.
    3. Mezcle una solución que contiene ácido 1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico(203,3 mg, 0,4350 mmol), 1-hidroxibenzotriazol hidrato (58,8 mg, 0,413 mmol), diisopropil carbodiimida (0,0673 ml, 0,435 mmol), diisopropiletilamina (0,0757 ml, 0,435 mmol), y una mezcla 4: 1 de diclorometano y dimetilformamida. Dibuje esta en la jeringa poroso y agite suavemente en un agitador de laboratorio durante 6 horas. Entonces expulsar la solución de la jeringa y lavar como se describió anteriormente.
    4. Realizar la prueba de la ninhidrina (-) como se describe anteriormente para confirmar acoplamiento. La prueba de la ninhidrina todavía puede ser útil para confirmar acoplamiento a pesar del color anaranjado de la perla derivado de la unión del resto que contiene hierro.
    5. A continuación, eliminar el grupo Fmoc mediante la adición de 20% de piperidina en dimetilformamida y se lavó como se describe anteriormente. El ensayo de ninhidrina (+) se debe utilizar para confirmar la eliminación de Fmoc.
    6. Preparar una solución compuesta de Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-hidroxibenzotriazol hidrato (58,8 mg, 0,4125 mmol), diisopropil carbodiimida (0,0673 ml, 0,4350mmol), diisopropiletilamina (0,0757 ml, 0,4350 mmol), y una mezcla 4: 1 de diclorometano y dimetilformamida. Añadir este cóctel acoplamiento cisteína la jeringa poroso y agite suavemente durante 6 horas. Lave usando el protocolo descrito anteriormente.
    7. Confirmar el acoplamiento mediante la prueba de la ninhidrina (-), seguido de la eliminación del componente de Fmoc con piperidina al 20% y lavado. Verifique el terminal libre amina mediante la prueba de la ninhidrina (+).
  2. La escisión de 1 de la resina.
    1. Prepare una solución de TFA (9,45 ml), agua (0,25 ml), 1,2-etanoditiol (0,25 ml), y silano triisopropilo (0,1 ml), añadirlo a la jeringa y agite suavemente durante 4 horas.
    2. Recoger la solución rojo-marrón resultante en un tubo Eppendorf y se evapora el TFA lentamente usando una corriente de aire.
    3. Añadir éter dietílico frío (~ 15 ml) al tubo Eppendorf para precipitar 1, que formará agitación suave. Aislar el producto a través de centrifugación (1 g, 5 min). Trepetición de gallina ciclos de lavados de éter de dietilo (~ 60 ml total) y centrifugar para obtener 1 como un sólido rojo / marrón.

2. Caracterización y Análisis de 1

  1. Confirmar que la identidad coincide con la conectividad y la composición que se muestra en la Figura 2 usando 1 H (16 scans) y 13 C NMR (512 exploraciones) en metanol deuterado (300 l) y el análisis ESI-MS.
    Cuente con los siguientes resultados:
    Espectro de RMN 1H (CD3OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4,426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) y 13 C espectro de RMN (CD3OD) δ / ppm: 24,644 (CH 2), 25.472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28,300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38,698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (anillo Cp), 60,286 (CH), 61.964 (CH), 62.521 / 62.821 (Cp-ring), 66.038 / 66.170 (Cp-ring), 69.153 / 69.328 (Cp-ring), 71.468 / 71.593 (anillo Cp), 76.466 (CH), 171.770 (C = O), 175,361 (C = O).
    ESI-MS (m / z): Encontrado: 639.00 [1 + Na] +, teórico: 639,1 [1 + Na] + y HR-MS (m / z): Encontrado: 617,2049 [1 + H] +, teórico: 617.1622 [1 + H] +.
  2. Realizar HPLC, análisis elemental para confirmar la composición de aislado 1.
    Llevar a cabo cromatogramas de HPLC usando una columna de fase inversa C8 con 100% de MeOH a un caudal de 0,5 ml / min. Nota: los tiempos de retención de HPLC fueron: 3,198 a 4,674 min.

3. Inmovilización de 1 sobre una superficie de oro

  1. Polímero Cut respaldado diapositivas de oro en cuadrados de ~ 0,25 en 2.
  2. Llenar un vaso de precipitados de 50 ml con una solución de agua DI de 1 (~ 1 mM).
  3. Añadir la diapositiva de oro al vaso de precipitados y cubrir con un vidrio de reloj. Todosow el portaobjetos de vidrio para incubar O / N a temperatura ambiente sin agitación.
  4. Retire la diapositiva oro de la solución y permitir que se seque al aire.
  5. Obtener la digitalización de imágenes de microscopía electrónica utilizando un microscopio electrónico de barrido (o equivalente) para observar inmovilizado 1.

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Representative Results

La forma unida a resina de 1 se muestra en la Figura 2. La unión covalente del componente de ferroceno da lugar a una coloración naranja a las perlas de resina que es persistente con lavado continuo e indicativo de una plancha inmovilizada que contiene el complejo en comparación con la absorción de hierro por el componente PEG de la perla de resina. La forma libre de resina de 1 es idéntico en color a las perlas de resina. Después de la eliminación del compuesto de la resina de los granos, la pureza y rendimiento (68%) como resultado de los métodos es muy superior a la metodología de solución típica. El análisis elemental del producto mostró que 1 se aisló como la sal de TFA: Calculado (Encontrado) para C 26 H 36 O 6 FeN 4 S 2 4TFA: C, 38,07 (38,90); H, 3,76 (4,20); N, 7,83 (7,70). El rendimiento resultante (105,1 mg, 68%) a partir de una reacción típica se basa en los resultados de los análisis elementales. El análisis de RMN en metanol deuterado provided espectro de 1H RMN (CD3OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4.104 (d, 2H), 4,274 (q, 1H), 4,426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) y 13 espectro de RMN de C (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH 2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28,300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38,698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (anillo Cp) , 60.286 (CH), 61.964 (CH), 62.521 / 62.821 (Cp-ring), 66.038 / 66.170 (Cp-ring), 69.153 / 69.328 (Cp-ring), 71.468 / 71.593 (anillo Cp), 76.466 (CH ), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). Tiempos de retención de HPLC fueron: 3,198 a 4,674 min. Los múltiples picos observados en el análisis de HPLC se confirmó que eran sales de TFA de 1 como se describe anteriormente utilizando el análisis elemental. La espectrometría de masas correlacionada con la estructura que se muestra en la Figura 2: ESI-MS (m / z): Encontrado: 639,00 [1 + Na] +,Teórica: 639.1 [1 + Na] + y HR-MS (m / z): Encontrado: 617,2049 [1 + H] +, teórico: 617,1622 [1 + H] +. Los espectros de absorción electrónica se obtuvieron en agua y mostraron λ max (ε, M -1 cm -1) 268 (4,779.8), 434 (324,26).

Los métodos utilizados para incubar un pequeño tobogán de oro en una solución de bioconjugado 1 están representados en el dibujo esquemático en la Figura 3. Una fina capa de oro de nuevo con material polimérico se añadió a una solución de 1 y se dejó incubar O / N. El portaobjetos de oro se lavó con agua DI y se deja secar. Al mismo tiempo, una diapositiva de oro fue co-incubaron en agua DI y se lavó de la misma manera. Imágenes de SEM de las dos muestras, que se muestran en la Figura 4, mostraron que se modificó la superficie de la corredera de oro co-incubaron con 1. Esto indica que lainteracciones tiolato de 1 proporcionan un anclaje de unión a la superficie de oro.

Figura 1
Figura 1. Fundamentos de un biosensor. Un ejemplo específico de un biosensor electroquímico para detectar directamente un objetivo en solución.

Figura 2
Figura 2. Los métodos sintéticos utilizados para producir 1. Los métodos utilizados para incubar un pequeño tobogán de oro en una solución de bioconjugado 1 están representados en el dibujo esquemático en la Figura 3. Una fina capa de oro de nuevo con material polimérico se añadió a una solución de 1 y se dejó incubar O / N. El portaobjetos de oro se lavó con agua DI y se deja secar. Al mismo tiempo, una diapositiva de oro fue co-incubaron en agua DI y se lavó de la misma manera. Imágenes de SEM de las dos muestras, Que se muestra en la Figura 4, mostró que se modificó la superficie de la corredera de oro co-incubaron con 1. Esto indica que las interacciones tiolato de 1 proporcionan un anclaje de unión a la superficie de oro.

Figura 3
Figura 3. Dibujo esquemático que representa la inmovilización de 1 sobre un porta de oro. El proceso implica disolver el bioconjugado en agua y añadiendo la diapositiva oro. La incubación O / N es seguido por lavado de la diapositiva. Análisis para la inmovilización éxito se lleva a cabo mediante microscopía electrónica de barrido muestra en la Figura 4.

Figura 4
Figura 4. imágenes de SEM de capas de oro sobre una película de plástico de polímero (A). Sans de incubación 1 y (b) fode incubación con si- 1 en agua O / N y el enjuague con agua.

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Discussion

La síntesis de derivados del ferroceno asimétricas es un reto en solución. Por ejemplo, los intentos para producir 1 en solución resultó en bajos rendimientos del producto deseado (menos de 20%). Asimismo, las reacciones que utilizan el ácido carboxílico 1'-amino-ferroceno (sans Fmoc) y resina de biotina unido resultaron en producto insoluble consistente con el producto polimerizado reportado por Baristic et al. y el producto mínimo 47. Esto se complica aún más por el ferroceno y sus derivados siendo sensible a la luz y que los congéneres de aminoácidos son propensos a dimerizar en disolución. Estas cuestiones hacen extensivas reacciones y workups desafiante. Sin embargo, esta reactividad se puede evitar utilizando métodos en fase sólida primero desarrollados por Merrifield para la síntesis de péptidos. La síntesis de los sistemas de ferroceno péptido ha llamado la atención por varios grupos y ha conducido a una biblioteca de sistemas peptídicos ferroceno asimétricos. 46,48-52 El trabajodescribe en este documento se detalla la síntesis de los primeros ferroceno asimétrica bio-conjugados que contienen biotina-ferroceno-cisteína. Este compuesto sirve como un modelo a través del cual otros receptores de moléculas pequeñas podrían ser considerados para la detección de moléculas biológicamente relevantes. En este trabajo se utilizó como una correa de inmovilización a una superficie de oro.

La primera fase de la síntesis era obtener un núcleo biotina inmovilizada sobre una resina de estado sólido utilizando un enlazador basado en amina. Resina Fmoc-etilendiamina El N -Biotin- N 'se puede adquirir comercialmente como el NovaTag Resina biotina y se usó como la base de bio-1 conjugado. El grupo protector Fmoc-amino se eliminó usando una solución al 20% de piperidina en dimetilformamida y una positiva (azul) ninhidrina prueba confirmó la desprotección con éxito. La amina libre de la biotina unido a la resina se utilizó entonces para anclar ferroceno usando un cóctel de acoplamiento compuesta de diisopropil etil amina,carbodiimida de diisopropilo, e hidrato de 1-hidroxibenzotriazol. 40,46 Una variedad de precursores del ferroceno están disponibles para tales fines, e incluyen ácido carboxílico de ferroceno y ácido carboxílico 1'-Fmoc-amino-ferroceno. El uso de los anteriores rendimientos del sistema monosustituido bio-conjugados que tienen sólo uno de los anillos de ciclopentadienilo modificados con un apéndice biotina. El derivado de ferroceno este último está compuesto de sustitución ortogonal de los anillos de ciclopentadienilo con un ácido carboxílico y un grupo amino protegido con Fmoc. Dicha sustitución permite la modificación asimétrica extendida del núcleo ferroceno permiten las modificaciones separada de los anillos de ciclopentadienilo para producir bio-conjugados tales como 1. Las perlas de color amarillo claro cambiaron en una tonalidad de color naranja brillante tras el acoplamiento con éxito de la ferroceno al núcleo biotina con resina como se muestra en la Figura 2.

En la siguiente fase de la síntesis de una gran variedad de enlazadores se podría unira la amina libre del ferroceno congénere unido a la resina. A los efectos de este sistema, la cisteína se utilizó ya que es un tiolato que contiene ácido amino. El componente de tiolato permite la fijación de la bio-conjugado a una superficie de oro, como se discute a continuación. Modificación con cisteína procedido por reacción del sistema ligado con resina Fmoc-Cys (MMT) -OH. La eliminación del grupo Fmoc con piperidina al 20% en dimetilformamida proporciona los resina forma unida de 1. El bio-conjugado unido a la resina se retiró del soporte sólido por escisión de los sistemas de bio-organometálico utilizando una solución de ácido trifluoroacético (TFA), agua y silano de triisopropilo. La evaporación de la solución de ácido y la adición de éter dietílico frío cedió bio-conjugado 1 como un sólido decidida a ser la sal de TFA rojo-naranja de 1 según lo confirmado por el análisis elemental y RMN. Se confirmó la pureza mediante análisis de HPLC.

Para mostrar la prueba de principio para lacomponente cisteína proporcionar una correa de fijación para bio-conjugado 1, la deposición de 1 en una superficie de oro fue explorado. La afinidad Au-S conocida permite la inmovilización facile de 1 en una superficie de oro polímero respaldado. En este experimento, la superficie de oro fue limpiado y pulido suavemente. El portaobjetos se sumergió en una solución de agua ~ 1 mM de 1 y se dejó establecer O / N. A continuación, la superficie de Au se lavó con agua destilada y se secó con un Kimwipe. Las diapositivas de oro fueron evaluados para su modificación mediante SEM. Las imágenes mostradas en la Figura 4 son representativos de una monocapa de 1 haber formado sobre la superficie de oro. Las imperfecciones en la superficie se postulan para ser un resultado de "agujeros" en la monocapa de 1 y están bajo una mayor exploración por nuestro grupo.

, Los métodos sintéticos generales para producir bioconjugados ferroceno que puedenser inmovilizado sobre una superficie de oro son reportados. La obra es la novela en que la síntesis de compuestos de ferroceno asimétricas es cuestionada por una serie de reacciones secundarias que conducen a bajos rendimientos y pureza. Como ferroceno-bioconjugados similares a 1 tienen aplicaciones como biosensores potenciales, la superación de estas dificultades sintético es de suma importancia. El uso de métodos de fase sólida similares a la síntesis de péptidos en fase sólida, un bioconjugado bien caracterizado 1 que contiene biotina-ferroceno-cisteína ha sido producido. Además, SEM se usó para mostrar que este sistema es capaz de adherirse a una superficie de oro gracias a la fracción tiolato del componente de cisteína. En general, la metodología sintética sencilla proporcionada en este documento puede modificarse fácilmente para las secuencias de péptidos y sistemas de bio-conjugado para una serie de aplicaciones.

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Acknowledgments

KG fue apoyado por la subvención P-1760 Fundación RA Welch, TCU Instituto Andrews de Matemáticas y Educación la Ciencia (a KG), TCU Investigación y Creatividad Actividad Grant (a KG) y TCU SERC Grant (a JHS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotin Novatag Resin NovaBiochem 8550510001
TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe Fisher NC9299151
piperidine Acros P/3520/PB05
ninhydrin test Sigma-Aldrich 60017-1ea
1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid Omm Scientific Special Order
N,N′-Diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407-5G
Fmoc-Cys(Trt)-OH Novabiochem 8520080025
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T5408
1,2-ethanedithiol Sigma-Aldrich 2930
triisopropyl silane Sigma-Aldrich 233781
Eppendorf tubes (20 ml) any source
methanol any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
dichloromethane any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
dimethylformamide any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
centrifuge any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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