Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

منهجية الاصطناعية لغير المتماثلة الفيروسين المستمدة الأنظمة الحيوية المزدوجة عبر الصلبة منهجية تستند الراتنج المرحلة

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52399
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Texas Christian University

Abstract

الكشف المبكر هو المفتاح لنجاح العلاج لمعظم الأمراض، وأمر لا بد منه ولا سيما لتشخيص وعلاج أنواع عديدة من السرطان. التقنيات الأكثر شيوعا المستخدمة والتصوير طرائق مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، البوزيترون الانبعاثات التضاريس (PET)، والطوبوغرافيا بالكمبيوتر (CT) وهما الأمثل لفهم الهيكل المادي للمرض ولكن يمكن إلا أن يكون أداؤها مرة واحدة كل أربع ل ستة أسابيع بسبب استخدام مواد التصوير والتكلفة الإجمالية. مع هذا في الاعتبار، وتطوير "نقطة الرعاية" التقنيات، مثل أجهزة الاستشعار التي تقييم مرحلة المرض و / أو فعالية العلاج في مكتب الطبيب، والقيام بذلك في الوقت المناسب، من شأنه إحداث ثورة في بروتوكولات العلاج. 1 كما وسيلة لاستكشاف أجهزة الاستشعار الفيروسين استنادا للكشف عن جزيئات ذات الصلة بيولوجيا 2، وقد وضعت وسائل لإنتاج الفيروسين البيوتين الحيوي تقارن الموصوفة هنا. وسوف يركز هذا التقرير على نظام البيوتين-الفيروسين-السيستين التي يمكن أن يجمد على سطح الذهب.

Introduction

أجهزة الاستشعار والأجهزة الصغيرة التي تستخدم تقنية التعرف الجزيئية البيولوجية كمنصة لتحليل انتقائي وتستخدم لخصوصيتها، والسرعة، ومنخفضة التكلفة. أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية للكشف عن الجزيئات الحيوية هي في طليعة هذا المجال نظرا لبساطتها، وفعالية التكاليف، وحساسية عالية. 1،3 تشريح العام لهذه المجسات هو القطب مجهزة جزيء الاعتراف محدد لعلامة البيولوجية للاهتمام . ملزمة من العلامات البيولوجية من قبل جزيء الاعتراف يؤدي إلى التغيير المحلي من إمكانات أو الحالية التي يمكن الكشف عنها بواسطة قياس بسيط. حتى الآن شاردة الاعتراف يمكن أن تتراوح من الانزيمات، والأجسام المضادة 4-8، 9-12 خلايا بأكملها، 13-16 مستقبلات، 17-20 21-23 الببتيدات وDNA 24 وركزت بشكل كبير على الكبيرة، الجزيئات البيولوجية. 25-28 أبحاث وتتركز الجهود في هذا المجال بشكل رئيسي على immunosensors عرجإعادة لالمناعي وثبتوا مع مجموعة أساسية نشط الأكسدة والاختزال (مثل الفيروسين) وتستخدم للكشف عن الأجسام المضادة من الفائدة. وقد استبعدت هذه الدراسات من التطبيقات السريرية بسبب ضعف الدقة واستهلاك الوقت النابعة من المضاعفات الناجمة عن استخدام مستضد / الأجسام المضادة. وقد ركزت 1،3 الاهتمام المتزايد على الكشف عن جزيئات صغيرة (أقل من 1 كجم / مول) من الطب الحيوي والمواد الغذائية والفوائد البيئية بالإضافة إلى الأمن الوطني. 29 وأفضل الأمثلة المعروفة من أجهزة الاستشعار البيولوجي هي مراقبين الجلوكوز الاختبار الذاتي، والتي لها شاشة المطبوعة أقطاب انزيم بالإضافة إلى بحجم الجيب متر amperometric. هذه الأنظمة عادة ما تستخدم طريقة الكولوم حيث يتم قياس المبلغ الإجمالي للتهمة التي تم إنشاؤها بواسطة تفاعل الأكسدة الجلوكوز على مدى فترة من الزمن. ويجب أن تكون الأجهزة المحمولة للتسويق وقوية وباليد للاستفادة سطحي للسكان ككل.

علامات الأكسدة مثل الفيروسين هي necessaراي لتوفير الكشف الكهروكيميائية من المؤشرات الحيوية أو جزيئات صغيرة في محلول حيث أن معظم المؤشرات الحيوية ليست نشطة في جوهرها electrochemically. 30-38 الفيروسين هو جزيء عضوي فلزي هذا هو المعيار الذهبي لالكيمياء الكهربائية، مما يجعله اختيارا ممتازا للاندماج في أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية. وقد حصل الأنواع النشطة الأكسدة القائم على الفيروسين بالفعل اهتماما كبيرا نظرا لصغر حجمها، والاستقرار جيدة، والوصول الاصطناعية مريحة وسهلة التعديل الكيميائي، بالانجذاب النسبي، وسهولة الأكسدة ضبط. 3،30-42 الجزيئات الصغيرة على أساس الأساسية الفيروسين ديك استخدمت على نطاق واسع كما كشف عن ايونات المعادن والجزيئات الصغيرة. 32-38،43 أنظمة استهداف الأنواع الكبيرة مثل الجزيئات الحيوية وقد استخدمت المرفق من الأجسام المضادة المناعية كبيرة أو لمشتقات الفيروسين التي تم جزءا لا يتجزأ من على سطح الكهروكيميائية. 1،3،39 (44 عاما) في كل حالة، وintensi الحاليين والمحتملينتم تغيير تاي من الحديد III / الحديد II زوجين الأكسدة على اقتران الجزيئي، وبالتالي إنتاج مقبض الطيفية جديدة تشير إلى وجود جزيء تحليلها. وينشأ هذا التغيير من التداخل المكثف الذي يحدث بين نظام بي من الحلقات cyclopentadienyl والحديد د-المدارات. إذا تم تعديل نظام بي، أي derivatized أو رد فعل، ثم سوف التفاعل المداري، بدوره، التغيير. وسوف يؤثر هذا جوهر الحديد، ويمكن أن يحتفل به بوصفه تحولا في إمكانات الزوجين الحديد III / الحديد II. 40،45،46 هذه الخصائص تجعل مثل هذا النظام جذابة للاستخدام كعامل تحديدها بشكل كمي في المناعية الكهروكيميائية أو جهاز الاستشعار البيولوجي.

من أجل إنتاج أنظمة الفيروسين تحتوي محددة لقدرات جهاز الاستشعار البيولوجي هو الأمثل لتعديل عصابة حزب المحافظين واحدة مع مستقبلات الحيوي محدد لجزيء المستهدفة والاستفادة من عصابة حزب المحافظين غيرها من حبل الجزيئي للقراءات الكهروكيميائية أو كهربائيtrode (الشكل 1). وتحدى التوليف لهذه المشتقات الفيروسين غير المتماثلة التي كتبها التفاعلات الجانبية وتشكيل الأنواع مثنوي والبوليمرية شكلت بناء الجزيئات عبر ربط. 47 ومع ذلك، واقتران الكيمياء انتاج السندات أميد هو الطريق الأكثر مباشرة لتوفير المشتقات بسيطة من الفيروسين التي تنطوي على مكونات بيولوجية مثل هذه كما الببتيدات ونواتج تفاعلاتها. لذلك، وتقنيات المرحلة الصلبة المتقدمة أولا في 1950s من قبل ميريفيلد لتخليق الببتيد يمكن تطبيقها على المركبات الفلزية العضوية التي تحتوي على الفيروسين. من خلال استخدام استبداله متعامد جزيء حمض 1'-Fmoc-الأمينية-الفيروسين-1-الكربوكسيلية، وهو نظام الفيروسين التي يمكن أن تحتوي على شاردة مستقبلات (البيوتين)، قراءات الكهروكيميائية (الفيروسين)، والمكون مستوقف-رابط (السيستين) لديها تم بناؤها والمفصلة هنا. ويناقش تركيب هذا-المكورات الحيوي وكذلك دليل على تجميد على سطح الذهب. هذا تمثيلا العملنهاية الخبر أول عرض للنظام يتألف من البيوتين، الفيروسين والأحماض الأمينية لتجميد على سطح الذهب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليف البيوتين-FC-السيستين (1)

  1. طرق المرحلة الصلبة لإنتاج الراتنجات ملزمة 1.
    1. وضع البيوتين الراتنج تحميل (250 ملغ، 0.145 ملمول) في حقنة fritted وتنتفخ الراتنج عن طريق وضع ثنائي ميثيل الفورماميد (5 مل)، وتهز حقنة على شاكر مختبر لمدة 20 دقيقة. طرد الحل وأكرر ثنائي ميثيل الفورماميد تورم واحد مزيد من الوقت.
    2. إزالة مجموعة حماية Fmoc بإضافة 4-6 مل من 20٪ تأكسد في ثنائي ميثيل الفورماميد إلى حقنة تليها 10-15 دقيقة من اهتزاز. كرر العملية مع deprotection 4-6 مل أخرى من تأكسد. غسل الراتنج مع سلسلة من 3X ثنائي ميثيل الفورماميد، 3X ثنائي ميثيل الفورماميد: الميثانول (1: 1)، والميثانول بقوة 3x: ثنائي كلورو ميثان (1: 1)، 3X ثنائي كلورو ميثان، ~ 5 مل لكل منهما. هل اختبار النينهيدرين (+) على عينات صغيرة (~ 10) من الخرز لتأكيد deprotection ناجحة من خلال وجود اللون الأزرق عند التسخين.
    3. خلط محلول يحتوي على حمض 1'-Fmoc-الأمينية-الفيروسين-1-الكربوكسيلية(203.3 ملغ، 0.4350 ملمول)، 1-hydroxybenzotriazole هيدرات (58.8 ملغ، 0.413 ملمول)، diisopropyl carbodiimide (0.0673 مل، 0.435 ملمول)، diisopropyl إيثيل أمين (0.0757 مل، 0.435 ملمول)، و 4: 1 من خليط ثنائي كلورو ميثان و ثنائي ميثيل الفورماميد. رسم هذا في حقنة fritted ويهز بلطف على شاكر المختبر لمدة 6 ساعة. ثم طرد الحل من الحقنة ويغسل كما هو موضح سابقا.
    4. إجراء اختبار النينهيدرين (-) على النحو المبين أعلاه لتأكيد اقتران. اختبار النينهيدرين يمكن أن يكون لا يزال مفيدا في تأكيد اقتران على الرغم من اللون البرتقالي من حبة مشتقة من المرفق من الحديد تحتوي على شاردة.
    5. ثم إزالة المجموعة Fmoc من خلال إضافة 20٪ تأكسد في ثنائي ميثيل الفورماميد وغسلها كما هو موضح أعلاه. اختبار النينهيدرين (+) وينبغي أن تستخدم لتأكيد إزالة Fmoc.
    6. يعد حل تتألف من Fmoc-السيستئين (TRT) -OH (254.8 ملغ، 0.4350 ملمول)، 1-hydroxybenzotriazole هيدرات (58.8 ملغ، 0.4125 ملمول)، diisopropyl carbodiimide (0.0673 مل، 0.4350ملمول)، diisopropyl أمين إيثيل (0.0757 مل، 0.4350 ملمول)، و 4: 1 من خليط ثنائي كلورو ميثان وثنائي ميثيل الفورماميد. إضافة هذه السيستين اقتران كوكتيل الحقنة fritted ويهز بلطف لمدة 6 ساعات. غسل باستخدام بروتوكول سبق وصفها.
    7. تأكيد اقتران باستخدام اختبار النينهيدرين (-)، تليها إزالة المكون Fmoc مع 20٪ تأكسد والغسيل. التحقق من محطة المجانية أمين باستخدام اختبار النينهيدرين (+).
  2. انشقاق من 1 من الراتنج.
    1. جعل حل TFA (9.45 مل)، والماء (0.25 مل)، 1،2-ethanedithiol (0.25 مل)، وسيلاني triisopropyl (0.1 مل)، إضافة إلى حقنة ويهز بلطف لمدة 4 ساعات.
    2. جمع الناتجة الحل الأحمر والبني في أنبوب إيبندورف وتتبخر TFA ببطء باستخدام تيار من الهواء.
    3. إضافة ايثر الباردة (~ 15 مل) إلى أنبوب إيبندورف لترسيب 1، التي ستشكل الإثارة لطيف. عزل المنتج عن طريق الطرد المركزي (1 غرام، 5 دقائق). تيالدجاجة تكرار دورات الغسيل ايثر (~ 60 مل الكل) وأجهزة الطرد المركزي للحصول على (1)، أحمر / البني صلبة.

2. توصيف وتحليل 1

  1. تأكد من أن الهوية مباريات الربط والتركيب هو مبين في الشكل 2 باستخدام 1 H (16 بالاشعة) و 13 C NMR (512 بالاشعة) في الميثانول بالديوتيريوم (300 ميكرولتر) وتحليل ESI-MS.
    تتوقع النتائج التالية:
    1 H NMR الطيف (CD 3 OD) δ / جزء في المليون: 1،407-1،684 (م، 6H)، 2.245 (ر، 2H)، 2،665-3،150 (م، 12H)، 4.015 (ر، 1H)، 4.104 (د، 2H )، 4.274 (ف، 1H)، 4.426 (د، 2H)، 4.479 (ف، 1H)، 4.595 (ر، 1H) و 13 C NMR الطيف (CD 3 OD) δ / جزء في المليون: 24،644 (CH 2)، 25.472 (CH 2)، 28.051 (CH 2)، 28.300 (CH 2)، 35.474 (CH 2)، 38.698 (CH 2)، 39.241 (CH 2)، 39.717 (CH 2)، 55،340 / 55،538 (CP-حلقة)، 60،286 (CH)، 61.964 (CH)، 62،521 / 62،821 (CP-حلقة)، 66،038 / 66،170 (CP-حلقة)، 69،153 / 69،328 (CP-حلقة)، 71،468 / 71،593 (CP-حلقة)، 76.466 (CH)، 171.770 (C = O)، 175،361 (C = O).
    ESI-MS (م / ض): وجدت: 639.00 [1 + نا] +، النظرية: 639.1 [1 + نا] + وHR-MS (م / ض): وجدت: 617.2049 [1 + H] +، النظرية: 617.1622 [1 + H] +.
  2. أداء HPLC، تحليل العناصر لتأكيد تكوين معزولة 1.
    تنفيذ المخططات الاستشرابية HPLC باستخدام C8 عكس العمود المرحلة مع 100٪ MeOH بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة. ملاحظة: كانت الأوقات الاحتفاظ HPLC: 3،198-4،674 دقيقة.

3. الشلل 1 على سطح الذهب

  1. قطع البوليمر أيد الشرائح الذهبية في ساحات ~ 0.25 في 2.
  2. ملء كوب 50 مل بمحلول الماء DI من 1 (~ 1 ملم).
  3. إضافة الشريحة الذهب إلى الكأس، وتغطي مع الزجاج ووتش. جميعآه الشريحة الزجاجية لاحتضان O / N في RT مع أي الانفعالات.
  4. إزالة الشريحة الذهب من الحل والسماح لتجف في الهواء.
  5. الحصول على مسح الصور المجهر الإلكتروني باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (أو ما يعادلها) لمراقبة يجمد 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويظهر على شكل الراتنج ملزمة من 1 في الشكل 2. المرفق التساهمية المكون الفيروسين يثير للون البرتقالي إلى الخرز الراتنج التي هي مستمرة مع الغسيل المستمر ومما يشير إلى حدوث الحديد يجمد يحتوي المجمع على العكس من امتصاص الحديد من قبل عنصر PEG من حبة الراتنج. شكل خالية من الراتنج من 1 مطابق في اللون إلى الخرز الراتنج. بعد إزالة المجمع من الراتنج الخرز، ونقاء والغلة (68٪) الناتجة عن الطرق هو أعلى بكثير من منهجية حل نموذجي. وأظهر تحليل العناصر من المنتج الذي تم عزله 1 كما الملح TFA: Calcd (وجدت) لC 26 H 36 الفين 6 O 4 S 2 4TFA: C، 38.07 (38.90)؛ H، 3.76 (4.20)؛ N، 7.83 (7.70). ويستند العائد الناتج (105.1 ملغ، 68٪) من رد فعل نموذجي على نتائج تحليل عنصري. تحليل NMR في بالديوتيريوم الميثانول الأقليمعيديد 1 H NMR الطيف (CD 3 OD) δ / جزء في المليون: 1،407-1،684 (م، 6H)، 2.245 (ر، 2H)، 2،665-3،150 (م، 12H)، 4.015 (ر، 1H)، 4.104 (د، 2H)، 4.274 (ف، 1H)، 4.426 (د، 2H)، 4.479 (ف، 1H)، 4.595 (ر، 1H) و 13 C NMR الطيف (CD 3 OD) δ / جزء في المليون: 24،644 (CH 2)، 25،472 (CH 2)، 28.051 (CH 2)، 28.300 (CH 2)، 35.474 (CH 2)، 38.698 (CH 2)، 39.241 (CH 2)، 39.717 (CH 2)، 55،340 / 55،538 (CP-حلقة) ، 60.286 (CH)، 61.964 (CH)، 62،521 / 62،821 (CP-حلقة)، 66،038 / 66،170 (CP-حلقة)، 69،153 / 69،328 (CP-حلقة)، 71،468 / 71،593 (CP-حلقة)، 76.466 (CH )، 171،770 (C = O)، 175،361 (C = O). وكانت مرات الاحتفاظ HPLC: 3،198-4،674 دقيقة. وأكد قمم متعددة لوحظ في تحليل HPLC لتكون أملاح TFA من 1 كما هو موضح أعلاه باستخدام التحليل العنصري. مطياف الكتلة المترابطة للهيكل هو مبين في الشكل 2: ESI-MS (م / ض): وجدت: 639.00 [1 + نا] +،النظرية: 639.1 [1 + نا] + وHR-MS (م / ض): وجدت: 617.2049 [1 + H] +، النظرية: 617.1622 [1 + H] +. وقد تم الحصول على أطياف الامتصاص الإلكترونية في المياه وأظهر λ ماكس (ε، M -1 سم -1) 268 (4،779.8)، 434 (324.26).

وتتمثل الأساليب المستخدمة لاحتضان شريحة ذهبية صغيرة في محلول من bioconjugate 1 في الرسم التخطيطي في الشكل (3). تمت إضافة طبقة رقيقة من الذهب مرة أخرى مع المواد البوليمرية الى حل ل1 وسمح لاحتضان O / N. ثم تغسل الشريحة ذهب بماء DI وسمح لتجف. وفي الوقت نفسه، كان شريحة الذهب شارك المحتضنة في الماء DI وغسلها بنفس الطريقة. الصور SEM اثنين من العينات، كما هو موضح في الشكل (4)، وأظهرت أن سطح الشريحة الذهب شارك حضنت مع 1 تم التعديل عليها. هذا يدل على أنالتفاعلات thiolate من 1 توفر مرساة الحجز على سطح الذهب.

الشكل (1)
الشكل 1. أساسيات لجهاز الاستشعار البيولوجي. ومن الأمثلة المحددة لجهاز الاستشعار البيولوجي الكهروكيميائية للكشف عن مباشرة هدفا في الحل.

الشكل 2
ويمثل الشكل 2. أساليب الاصطناعية المستخدمة لإنتاج 1. الطرق المستخدمة لاحتضان شريحة ذهبية صغيرة في محلول من bioconjugate 1 في الرسم التخطيطي في الشكل (3). تمت إضافة طبقة رقيقة من الذهب مرة أخرى مع المواد البوليمرية الى حل ل 1 وسمح لاحتضان O / N. ثم تغسل الشريحة ذهب بماء DI وسمح لتجف. وفي الوقت نفسه، كان شريحة الذهب شارك المحتضنة في الماء DI وغسلها بنفس الطريقة. الصور SEM من العينتين، كما هو موضح في الشكل (4)، وأظهرت أن سطح الشريحة الذهب شارك حضنت مع 1 تم التعديل عليها. هذا يشير إلى أن التفاعلات thiolate من 1 توفر مرساة الحجز على سطح الذهب.

الشكل (3)
الشكل 3. رسم تخطيطي يمثل الشلل من 1 إلى شريحة الذهب. وتنطوي العملية على حل bioconjugate في الماء وإضافة شريحة الذهب. حضانة O / يتبع N قبل غسل الشريحة. ويتم تحليل لتجميد ناجحة خارج باستخدام المجهر الإلكتروني هو مبين في الشكل (4).

الشكل (4)
الشكل 4. الصور SEM من الذهب الطبقات على فيلم البلاستيك البوليمر. (A) بلا حضانة 1 و (B) FOالنماذج التالية الحضانة مع 1 في الماء O / N والشطف بالماء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توليف مشتقات الفيروسين غير المتماثلة يتحدى في الحل. على سبيل المثال، محاولات لإنتاج 1 في نتج الحل في عوائد منخفضة من المنتج المطلوب (أقل من 20٪). وبالمثل، أدت ردود فعل الاستفادة 1'-الأمينية-الفيروسين حمض الكربوكسيلية (بلا Fmoc) وراتنج البيوتين ملزمة في المنتج غير قابل للذوبان يتفق مع المنتج بلمرة التي أبلغ عنها Baristic وآخرون. والحد الأدنى من المنتج. 47 معقد هذا أيضا الفيروسين ومشتقاته يجري ضوء حساسية وأن المتجانسين الأمينية عرضة لdimerize في الحل. هذه القضايا تجعل ردود فعل واسعة workups تحديا. ولكن هذا التفاعل يمكن التحايل باستخدام أساليب المرحلة الصلبة وضعت لأول مرة من قبل ميريفيلد لتوليف الببتيد. تركيب أنظمة الفيروسين الببتيد قد حصل الاهتمام من قبل عدة مجموعات وأدى إلى مكتبة نظم الببتيد الفيروسين غير المتماثلة. 46،48-52 العملالموصوفة هنا تفاصيل تركيب أول الفيروسين غير المتماثلة الحيوي تقارن التي تحتوي على البيوتين-الفيروسين السيستين. يخدم هذا المركب نموذجا من خلالها أخرى مستقبلات جزيء صغير يمكن النظر للكشف عن جزيئات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. في هذا العمل استخدمت بمثابة حبل تجميد على سطح الذهب.

وكانت المرحلة الأولى من التوليف للحصول على يجمد البيوتين الأساسية على راتنج الحالة الصلبة باستخدام رابط القائم على أمين. --Fmoc الإيثيلين الراتنج N -Biotin- N 'يمكن شراؤها تجاريا باسم البيوتين NovaTag الراتنج، وكان يستخدم كأساس للالحيوي المكورات 1. تم إزالة مجموعة حماية Fmoc-الأمينية باستخدام محلول 20٪ من تأكسد في ثنائي ميثيل الفورماميد والإيجابي (الأزرق) النينهيدرين اختبار وأكد deprotection ناجحة. ثم استخدم أمين مجانا من البيوتين محددة الراتنج لترسيخ الفيروسين باستخدام كوكتيل اقتران تتألف من diisopropyl أمين الإيثيل،diisopropyl carbodiimide، وهيدرات 1-hydroxybenzotriazole. 40،46 مجموعة متنوعة من السلائف الفيروسين تتوفر لمثل هذه الأغراض وتشمل حمض الكربوكسيلية الفيروسين وحمض الكربوكسيلية 1'-Fmoc-الأمينية-الفيروسين. استخدام عوائد النظام السابق مونو استبدال الحيوي تقارن جود واحدة من حلقات cyclopentadienyl المعدلة مع أطرافهم البيوتين فقط. وتضم مشتقات الفيروسين الأخيرة من استبدال متعامد من الحلقات cyclopentadienyl مع حمض الكربوكسيلية وجماعة الأمينية Fmoc المحمية. هذا الاستبدال يسمح للتعديل غير المتماثلة الموسع للالأساسية الفيروسين السماح لتعديل منفصل من حلقات cyclopentadienyl لإنتاج الحيوي تقارن مثل 1. حبات الصفراء الخفيفة تغيرت الى هوى برتقالية زاهية على اقتران الناجح لالفيروسين حتى النخاع البيوتين الراتنج كما هو مبين في الشكل (2).

في المرحلة التالية من التوليف يمكن أن تعلق مجموعة متنوعة من linkersإلى أمين الحرة للبد الراتنج الفيروسين متجانس. لأغراض هذا النظام، وقد استخدمت السيستين كما هو thiolate تحتوي على الأحماض الأمينية. يسمح المكون thiolate لمرفق للمكورات الحيوي على سطح الذهب، كما هو مبين أدناه. التعديل مع السيستين شرع من رد فعل النظام ملزمة الراتنج مع Fmoc-السيستئين (MMT) -OH. إزالة مجموعة Fmoc مع 20٪ تأكسد في ثنائي ميثيل الفورماميد غلة الراتنج ملزمة أشكال 1. تم إزالة الحيوي المكورات محددة الراتنج من دعم قوي من قبل انشقاق النظم الحيوية العضويه باستخدام محلول حامض trifluoroacetic (TFA) والمياه وtriisopropyl سيلاني. تبخر محلول حمض وإضافة ايثر البارد أسفرت الحيوي المكورات 1 كمادة صلبة مصممة على أن تكون الملح TFA الأحمر البرتقالي من 1 نحو ما أكده تحليل العناصر وNMR. وأكد النقاء من خلال تحليل HPLC.

لإظهار دليل على مبدأ لتم استكشاف مكون السيستين توفير حبل المرفقات للالحيوي المكورات 1، ترسب 1 على سطح الذهب. المعروفة الاتحاد الافريقي-S تقارب يسمح لتجميد سطحي من 1 على البوليمر المدعومة من سطح الذهب. في هذه التجربة، تم تنظيف السطح الذهب ومصقول بلطف. ثم تراجع الشريحة في حل والمياه ~ 1 ملم من 1 وسمح لوضع O / N. ثم تم غسلها السطح الاتحاد الافريقي مع الماء المقطر وتجفيفها مع Kimwipe. ثم تم تقييمها الشرائح الذهب للتعديل باستخدام SEM. الصور هو مبين في الشكل 4 هي تمثيلية من أحادي الطبقة من 1 بعد أن شكلت على سطح الذهب. وافترض عيوب في السطح لتكون نتيجة ل"الثقوب" في أحادي الطبقة من 1 وتحت مزيد من الاستكشاف من قبل مجموعتنا.

وعموما، فإن الأساليب الاصطناعية لإنتاج bioconjugates الفيروسين التي يمكن أنأن يجمد على سطح الذهب والإبلاغ عنها. العمل هو هو وتحدى الرواية في ذلك تجميع المركبات الفيروسين غير المتماثلة من قبل مجموعة من التفاعلات الجانبية المؤدية إلى العوائد المنخفضة والنقاء. كما الفيروسين-bioconjugates مماثلة إلى 1 لها تطبيقات مثل أجهزة الاستشعار المحتملة، والتغلب على هذه الصعوبات الاصطناعية هو الهدف الأسمى. باستخدام طرق المرحلة الصلبة أقرب إلى التوليف الببتيد المرحلة الصلبة، وقد أنتج bioconjugate تتميز كذلك يحتوي على البيوتين 1-الفيروسين السيستين. وعلاوة على ذلك، تم استخدام SEM لإظهار أن هذا النظام قادر على الانضمام إلى سطح الذهب بفضل شاردة thiolate المكون السيستين. وعموما، فإن منهجية الاصطناعية بسيطة المقدمة هنا يمكن بسهولة تعديل لمتواليات الببتيد والنظم الحيوية المتقارن لمجموعة من التطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد كغ من قبل المنحة P-1760 مؤسسة RA ولش، TCU معهد اندروز الرياضيات وعلوم التربية (لKG)، بحوث TCU والإبداع آخر غرانت (لKG) وTCU SERC غرانت (لJHS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotin Novatag Resin NovaBiochem 8550510001
TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe Fisher NC9299151
piperidine Acros P/3520/PB05
ninhydrin test Sigma-Aldrich 60017-1ea
1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid Omm Scientific Special Order
N,N′-Diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407-5G
Fmoc-Cys(Trt)-OH Novabiochem 8520080025
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T5408
1,2-ethanedithiol Sigma-Aldrich 2930
triisopropyl silane Sigma-Aldrich 233781
Eppendorf tubes (20 ml) any source
methanol any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
dichloromethane any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
dimethylformamide any source dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
centrifuge any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics. Biosens Bioelectron. 21 (10), 1887-1892 (2006).
  2. Scarborough, J. H., Brusoski, K., Brewer, S., Green, K. N. Solid phase synthesis of ferrocene-biotin bioconjugates and reactivity with avidin. A paradigm for development of electrochemical biosensors. , Texas Christian University. Fort Worth, Texas. (2014).
  3. Zhang, S., Zheng, F., Wu, Z., Shen, G., Yu, R. Highly sensitive electrochemical detection of immunospecies based on combination of Fc label and PPD film/gold nanoparticle amplification. Biosens Bioelectron. 24 (1), 129-135 (2008).
  4. Gobi, K. V., Mizutani, F. Layer-by-layer construction of an active multilayer enzyme electrode applicable for direct amperometric determination of cholesterol. Sensors and Actuators. 80 (3), 272-277 (2001).
  5. Gobi, K. V., Mizutani, F. Amperometric detection of superoxide dismutase at cytochrome c-immobilized electrodes: Xanthine oxidase and ascorbate oxidase incorporated biopolymer membrane for in-vivo analysis. Analytical Sciences. 17 (1), 11-15 (2001).
  6. Gobi, K. V., Sato, Y., Mizutani, F. Mediatorless superoxide dismutase sensors using cytochrome c-modified electrodes: Xanthine oxidase incorporated polyion complex membrane for enhanced activity and in vivo analysis. Electroanalysis. 13 (5), 397-403 (2001).
  7. Shankaran, D. R., Uehara, N., Kato, T. A metal dispersed sol-gel biocomposite amperometric glucose biosensor. Biosensor.., & Bioelectronics. 18 (5-6), 721-728 (2003).
  8. Yamamoto, K., Xu, F., Shi, G. Y., Kato, T. On-line biosensor for detection of glucose, choline and glutamate simultaneously integrated with microseparation system. Journal of Pharmacological Sciences. 91, 211p-211 (2003).
  9. Luppa, P. B., Kaiser, T., Cuilleron, C. Y. Ligand-binding studies of sex hormone-binding globulin with 17alpha-dihydrotestosterone derivatives as ligands using a surface plasmon resonance biosensor. Clinical Chemistry. 47 (6), A9-A9 (2001).
  10. Luppa, P. B., Sokoll, L. J., Chan, D. W. Immunosensors - principles and applications to clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 314 (1-2), 1-26 (2001).
  11. Mallat, E., Barcelo, D., Barzen, C., Gauglitz, G., Abuknesha, R. Immunosensors for pesticide determination in natural waters. Trac-Trends in Analytical Chemistry. 20 (3), 124-132 (2001).
  12. Pemberton, R. M., Hart, J. P., Mottram, T. T. An electrochemical immunosensor for milk progesterone using a continuous flow system. Biosensor.., & Bioelectronics. 16 (9-12), 715-723 (2001).
  13. Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, W., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Annals of Biomedical Engineering. 27 (6), 697-711 (1999).
  14. May, K. M. L., Wang, Y., Bachas, L. G., Anderson, K. W. Development of a whole-cell-based biosensor for detecting histamine as a model toxin. Analytical Chemistry. 76 (14), 4156-4161 (2004).
  15. Taylor, C. J., Bain, L. A., Richardson, D. J., Spiro, S., Russell, D. A. Construction of a whole-cell gene reporter for the fluorescent bioassay of nitrate. Analytical Biochemistry. 328 (1), 60-66 (2004).
  16. Philp, J. C., et al. Whole cell immobilised biosensors for toxicity assessment of a wastewater treatment plant treating phenolics-containing waste. Analytica Chimica Acta. 487 (1), 61-74 (2003).
  17. Subrahmanyam, S., Piletsky, S. A., Turner, A. P. F. Application of natural receptors in sensors and assays. Analytical Chemistry. 74 (16), 3942-3951 (2002).
  18. Ryberg, E., et al. Identification and characterisation of a novel splice variant of the human CB1 receptor. Febs Letters. 579 (1), 259-264 (2005).
  19. Cooper, M. A. Advances in membrane receptor screening and analysis. Journal of Molecular Recognition. 17 (4), 286-315 (2004).
  20. Kumbhat, S., et al. A novel receptor-based surface-plasmon-resonance affinity biosensor for highly sensitive and selective detection of dopamine. Chemistry Letters. 35 (6), 678-679 (1246).
  21. Yemini, M., Reches, M., Gazit, E., Rishpon, J. Peptide nanotube-modified electrodes for enzyme-biosensor applications. Analytical Chemistry. 77 (16), 5155-5159 (2005).
  22. Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77 (21), 6976-6984 (2005).
  23. Drummond, T. G., Hill, M. G., Barton, J. K. Electrochemical DNA sensors. Nature Biotechnology. 21 (10), 1192-1199 (2003).
  24. Piunno, P. A. E., Krull, U. J. Trends in the development of nucleic acid biosensors for medical diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (5), 1004-1011 (2005).
  25. Dechtrirat, D., et al. Electrochemical displacement sensor based on ferrocene boronic acid tracer and immobilized glycan for saccharide binding proteins and E. coli. Biosensor.., & Bioelectronics. 58, 1-8 (2014).
  26. Lacina, K., et al. Combining ferrocene, thiophene and a boronic acid: a hybrid ligand for reagentless electrochemical sensing of cis-diols. Tetrahedron Letters. 55 (21), 3235-3238 (2014).
  27. Takahashi, S., Anzai, J. Recent Progress in Ferrocene-Modified Thin Films and Nanoparticles for Biosensors. Materials. 6 (12), 5742-5762 (2013).
  28. Liu, L., et al. Amplified voltammetric detection of dopamine using ferrocene-capped gold nanoparticle/streptavidin conjugates. Biosensor.., & Bioelectronics. 41, 730-735 (2013).
  29. Shankaran, D. R., Gobi, K. V. A., Miura, N. Recent advancements in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small molecules of biomedical, food and environmental interest. Sensors and Actuators B-Chemical. 121 (1), 158-177 (2007).
  30. Szarka, Z., Kuik, Á, Skoda-Földes, R., Kollár, L. Aminocarbonylation of 1,1′-diiodoferrocene, two-step synthesis of heterodisubstituted ferrocene derivatives via homogeneous catalytic carbonylation/coupling reactions. Journal of Organometallic Chemistry. 689 (17), 2770-2775 (2004).
  31. Niu, H. T., et al. Imidazolium-based macrocycles as multisignaling chemosensors for anions. Dalton Trans. (28), 3694-3700 (2008).
  32. Qing, G. -Y., Sun, T. -L., Wang, F., He, Y. -B., Yang, X. Chromogenic Chemosensors forN-Acetylaspartate Based on Chiral Ferrocene-Bearing Thiourea Derivatives. European Journal of Organic Chemistry. (6), 841-849 (2009).
  33. Romero, T., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A multiresponsive two-arm ferrocene-based chemosensor molecule for selective detection of mercury. Dalton Trans. (12), 2121-2129 (2009).
  34. Zapata, F., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A selective redox and chromogenic probe for Hg(II) in aqueous environment based on a ferrocene-azaquinoxaline dyad. Inorg Chem. 48 (24), 11566-11575 (2009).
  35. Alfonso, M., Tarraga, A., Molina, P. Ferrocene-based multichannel molecular chemosensors with high selectivity and sensitivity for Pb(II) and Hg(II) metal cations. Dalton Trans. 39 (37), 8637-8645 (2010).
  36. Zapata, F., Caballero, A., Molina, P., Tarraga, A. A ferrocene-quinoxaline derivative as a highly selective probe for colorimetric and redox sensing of toxic mercury(II) cations. Sensors (Basel). 10 (12), 11311-11321 (2010).
  37. Thakur, A., Sardar, S., Ghosh, S. A highly selective redox, chromogenic, and fluorescent chemosensor for Hg2+ in aqueous solution based on ferrocene-glycine bioconjugates). Inorg Chem. 50 (15), 7066-7073 (2011).
  38. Sathyaraj, G., Muthamilselvan, D., Kiruthika, M., Weyhermüller, T., Nair, B. U. Ferrocene conjugated imidazolephenols as multichannel ditopic chemosensor for biologically active cations and anions. Journal of Organometallic Chemistry. 716, 150-158 (2012).
  39. Kwon, S. J., Kim, E., Yang, H., Kwak, J. An electrochemical immunosensor using ferrocenyl-tethered dendrimer. Analyst. 131 (3), 402-406 (2006).
  40. Pinto, A., Hoffmanns, U., Ott, M., Fricker, G., Metzler-Nolte, N. Modification with Organometallic Compounds Improves Crossing of the Blood-Brain Barrier of [Leu(5)]-Enkephalin Derivatives in an In Vitro Model System. Chembiochem. 10 (11), 1852-1860 (2009).
  41. Barisic, L., et al. The first ferrocene analogues of muramyldipeptide. Carbohydr Res. 346 (5), 678-684 (2011).
  42. Brusoski, K., Green, K. N. Novel click derivatives of ferrocene and their applications toward construction of electrochemical biosensors. Abstracts of Papers, 243rd ACS National Meetin.., & Exposition. 2012 Mar 25-29, San Diego, CA, United States, , BIOL-28. (2012).
  43. Bucher, C., Devillers, C. H., Moutet, J. -C., Royal, G., Saint-Aman, E. Anion recognition and redox sensing by a metalloporphyrin–ferrocene–alkylammonium conjugate. New Journal of Chemistry. 28, 1584-1589 (2004).
  44. Tanaka, S., Yoshida, K., Kuramitz, H., Sugawara, K., Nakamura, H. Electrochemical detection of biotin using an interaction between avidin and biotin labeled with ferrocene at a perfluorosulfonated ionomer modified electrode. Analytical Sciences. 15 (9), 863-866 (1999).
  45. Real-Fernandez, F., et al. Ferrocenyl glycopeptides as electrochemical probes to detect autoantibodies in multiple sclerosis patients' sera. Biopolymers. 90 (4), 488-495 (2008).
  46. Husken, N., Gasser, G., Koster, S. D., Metzler-Nolte, N. Four-potential' ferrocene labeling of PNA oligomers via click chemistry. Bioconjug Chem. 20 (8), 1578-1586 (2009).
  47. Barisic, L. Croatica Chemica Acta. 75, 199-210 (2002).
  48. Kirin, S. I., Noor, F., Metzler-Nolte, N. Manual Solid-Phase Peptide Synthesis of Metallocene–Peptide Bioconjugates. Journal of Chemical Education. 84 (1), 108-111 (2007).
  49. Barisic, L., et al. Helically chiral ferrocene peptides containing 1 '-aminoferrocene-1-carboxylic acid subunits as turn inducers. Chemistry-a European Journal. 12 (19), 4965-4980 (2006).
  50. Mahmoud, K., Long, Y. -T., Schatte, G., Kraatz, H. -B. Electronic communication through the ureylene bridge: spectroscopy, structure and electrochemistry of dimethyl 1′,1′-ureylenedi(1-ferrocenecarboxylate). Journal of Organometallic Chemistry. 689 (13), 2250-2255 (2004).
  51. Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. Synthesis and electrochemical investigation of oligomeric ferrocene amides: Towards ferrocene polyamides. Journal of Inorganic and Organometallic Polymers and Materials. 16 (3), 201-210 (2006).
  52. Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. A bioorganometallic approach for the electrochemical detection of proteins: A study on the interaction of ferrocene-peptide conjugates with papain in solution and on au surfaces. Chemistry-a European Journal. 13 (20), 5885-5895 (2007).

Tags

الكيمياء، العدد 97، الفيروسين، البيوتين، والبيولوجية، المكورات، والتوليف الببتيد المرحلة الصلبة، والراتنج، غير المتماثلة، الببتيد، الأحماض الأمينية، والذهب
منهجية الاصطناعية لغير المتماثلة الفيروسين المستمدة الأنظمة الحيوية المزدوجة عبر الصلبة منهجية تستند الراتنج المرحلة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scarborough, J. H., Gonzalez, P.,… More

Scarborough, J. H., Gonzalez, P., Rodich, S., Green, K. N. Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology. J. Vis. Exp. (97), e52399, doi:10.3791/52399 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter