Abstract
גילוי מוקדם הוא מפתח להצלחת טיפול ברוב המחלות, והכרחי במיוחד לאבחון וטיפול בסוגים רבים של הסרטן. הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש הן הדמיה שיטות כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), Positron פליטת טופוגרפיה (PET), וממוחשב טופוגרפיה (CT) והם אופטימליים להבנת המבנה הפיזי של המחלה, אך יכולות להתבצע רק פעם אחת בכל ארבעה עד שישה שבועות עקב השימוש של סוכני הדמיה ועלות כוללת. עם זה בחשבון, כמו ההתפתחות של "נקודת הטיפול" טכניקות, כגון חיישנים ביולוגיים, המעריכים את השלב של מחלה ו / או יעילות של טיפול במשרדו של המטפל ולעשות זאת מבעוד מועד, היה לחולל מהפכה פרוטוקולי טיפול. 1 אמצעי לחקר biosensors ferrocene מבוסס על זיהוי של מולקולות ביולוגיות רלוונטיות 2, שיטות פותחו כדי לייצר ביו-conjugates ferrocene ביוטין המתואר כאן. דו"ח זה יתמקד במערכת ביוטין-ferrocene-ציסטאין שיכול להיות משותקת על משטח זהב.
Introduction
חיישנים ביולוגיים הם התקנים קטנים המעסיקים טכנולוגיית זיהוי biomolecular כפלטפורמה לניתוח סלקטיביים, ומנוצלים לספציפיות שלהם, מהירות, ובעלות נמוכה. biosensors אלקטרוכימי לגילוי מולקולות הביולוגיים הוא בחוד החנית של תחום זה בשל הפשטות שלהם, עלות תועלת, ורגישות גבוהה. 1,3 האנטומיה הכללית של חיישנים אלה היא אלקטרודה מצוידת במולקולת הכרה ספציפית לסמן הביולוגי של עניין . הכריכה של הסמן הביולוגי על ידי מולקולת ההכרה מביאה לשינוי מקומי של פוטנציאל או נוכחי שיכול להיות מזוהה על ידי מדידה פשוטה. עד כה מחצית ההכרה יכולה לנוע בין אנזימים, נוגדנים 4-8, 9-12 תאים שלמים, 13-16 קולטנים, 17-20 פפטידים 21-23 ו -24 DNA והתמקד בעיקר במולקולות גדולות יותר, ביולוגיות. מחקר 25-28 מאמצים בתחום זה התמקדו בעיקר בimmunosensors wheמחדש אימונוגלובולינים הוא משותק עם ליבה פעילה חיזור (כגון ferrocene) ומשמשים לאיתור נוגדנים של עניין. מחקרים אלה לא נכללו ביישומים קליניים בשל דיוק עני וצריכת זמן נובעים מהסיבוכים הנובעים משימוש של אנטיגן / נוגדנים. תשומת לב גוברת 1,3 התמקדה בזיהוי של מולקולות קטנות (פחות מ 1 קילוגרם / mol) של יו-רפואי , מזון ואיכות הסביבה ריבית בנוסף לביטחון לאומי. 29 דוגמאות הידועות ביותר של התקני biosensor הם צגי גלוקוז בדיקה עצמית, שיש להם אלקטרודות אנזים מסך מודפסות מצמידים את מד אמפרומטריים כיס בגודל. מערכות אלו בדרך כלל לנצל שיטת coulometric כאשר הסכום הכולל של מטען שנוצר על ידי תגובת חמצון הגלוקוז נמדד על פני תקופה של זמן. מכשירים סחירים חייבים להיות ניידים, חזקים והחזיק ביד לעשות שימוש קליל לאוכלוסייה בכללותה.
תגי חיזור כגון ferrocene הם necessaר"י לספק זיהוי אלקטרוכימי של סמנים ביולוגיים או מולקולות קטנות בפתרון כמו רוב הסמנים הביולוגיים אינם במהות אלקטרוכימי פעילים. 30-38 Ferrocene היא מולקולה אורגנה-מתכתית שהיא סטנדרט זהב לאלקטרוכימיה, מה שהופך אותו לבחירה מצוינת להשתלבות biosensors אלקטרוכימיים. מינים פעילים חיזור מבוסס Ferrocene כבר זכו לתשומת לב רבה בשל גודלם הקטן, יציבות טובה, גישה נוחה סינתטית, שינוי כימי קל, lipophilicity היחסי, וקלות כוונון חיזור. 3,30-42 מולקולות קטנות המבוססים על הליבה שיש לי ferrocene נעשה שימוש נרחב כגלאים של יוני מתכת ומולקולות קטנות. 32-38,43 מערכות מיקוד מינים גדולים כגון מולקולות ביולוגיות נצלו את הקובץ המצורף של נוגדנים או אימונוגלובולינים גדולים לנגזרי ferrocene שכבר מוטבעים על גבי משטח אלקטרוכימיים. 1,3,39 , 44 בכל מקרה, התעצם הפוטנציאלי ונוכחיty של בני זוג רדוקס Fe III / II Fe שונה על צימוד מולקולרי, ובכך לייצר ידית ספקטרוסקופיות חדשה המעידה על הנוכחות של המולקולה אנליטי. שינוי זה נובע מהחפיפה הנרחבת המתרחשת בין pi-המערכת של טבעות cyclopentadienyl וד-אורביטלי הברזל. אם pi-המערכת היא שונה, כלומר, derivatized או הגיב, אז האינטראקציה מסלולית, בתורו, שינוי. זה ישפיע על הליבה פה וניתן לראות כשינוי בפוטנציאל של בני זוג Fe III / II פה. 40,45,46 תכונות אלו הופכות את מערכת כזו אטרקטיבית לשימוש כסוכן כימות בimmunoassay או biosensor אלקטרוכימי.
על מנת לייצר מערכות ferrocene מכיל ספציפיות ליכולות biosensor זה הוא אופטימלי לשנות טבעת Cp אחד עם יו-קולטן ספציפי למולקולת מטרה ולנצל את טבעת Cp אחרת כמו לקשור מולקולרי לקריאה או elec אלקטרוכימייםtrode (איור 1). הסינתזה של נגזרי ferrocene א-סימטריים אלה נתקל בתגובות לוואי והיווצרותם של מיני dimeric ופולימרים נוצרו על cross-linking מולקולאריים. 47 עם זאת, כימיה צימוד ייצור קשר אמיד היא הדרך הישירה ביותר כדי לספק נגזרים פשוטים של ferrocene מעורב רכיבים ביולוגיים כגון כפפטידים ומטבוליטים שלהם. לכן, ניתן ליישם טכניקות שלב מוצקות ראשון שפותחו בשנת 1950 על ידי Merrifield לסינתזת פפטיד לתרכובות אורגנו-מתכתיות המכילות ferrocene. באמצעות השימוש במולקולה להחליף orthogonally 1-קרבוקסיליות 1'-Fmoc-אמינו-ferrocene-החומצה, מערכת ferrocene שיכול להכיל מחצית קולט (ביוטין), קריאה אלקטרוכימיים (ferrocene), ומרכיב משתק-מקשר (ציסטאין) יש נבנה ומפורט במסמך זה. הסינתזה של ביו-המצומד זה נדונה, כמו גם ראיות לקיבוע על משטח זהב. represen עבודה זוts המצגת הראשונה של מערכת המורכבת של ביוטין, ferrocene וחומצת אמינו לקיבוע על משטח זהב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של ביוטין-FC-ציסטאין (1)
- שיטות שלב מוצקות לייצר שרף הנכנס 1.
- הנח שרף ביוטין טעון (250 מ"ג, 0.145 mmol) לתוך מזרק fritted ולהתנפח השרף על ידי ציור את dimethylformamide (5 מיליליטר) ולוחץ את המזרק על שייקר מעבדה במשך 20 דקות. לגרש את הפתרון ולחזור dimethylformamide נפיחות עוד פעם אחת.
- הסר את קבוצת הגנת Fmoc על ידי הוספת 4-6 מיליליטר של piperidine 20% בdimethylformamide למזרק ואחרי 10-15 דקות של רועד. חזור על תהליך deprotection עם עוד 4-6 מיליליטר של piperidine. לשטוף את השרף עם רצף של dimethylformamide 3x, 3x dimethylformamide: מתנול (1: 1), מתנול 3x: dichloromethane (1: 1), dichloromethane 3x, ~ 5 מיליליטר כל אחד. האם מבחן ninhydrin (+) בדגימה קטנה (~ 10) של חרוזים כדי לאשר deprotection מוצלח על ידי הנוכחות של כחול על חימום.
- מערבבים תמיסה המכילה חומצה 1'-Fmoc-אמינו--1-קרבוקסיליות ferrocene(203.3 מ"ג, .4350 mmol), 1-hydroxybenzotriazole מימה (מ"ג 58.8, .413 mmol), diisopropyl carbodiimide (.0673 מיליליטר, .435 mmol), (.0757 מיליליטר, .435 mmol) diisopropyl אתיל אמין, ו4: תערובת 1 של dichloromethane ו dimethylformamide. לצייר את זה לתוך מזרק fritted ועדינות לנער על מעבדה שייקר במשך 6 שעות. ואז לגרש את הפתרון מן המזרק ולשטוף כפי שתואר לעיל.
- בצע את בדיקת ninhydrin (-) כפי שתואר לעיל כדי לאשר צימוד. מבחן ninhydrin עדיין יכול להיות שימושי במאשר צימוד למרות הצבע הכתום של חרוז נגזר מהחיבור של הברזל המכיל מחצית.
- ואז להסיר את קבוצת Fmoc על ידי התוספת של 20% בpiperidine dimethylformamide ורחץ כפי שתואר לעיל. מבחן ninhydrin (+) יש להשתמש כדי לאשר את הסרת Fmoc.
- הכן, 1-hydroxybenzotriazole מימה (מ"ג 58.8, .4125 mmol), diisopropyl carbodiimide פתרון המורכב מFmoc-Cys (TRT) אה (254.8 מ"ג, .4350 mmol) (.0673 מיליליטר, .4350mmol), diisopropyl אמין אתיל (.0757 מיליליטר, .4350 mmol), ושל 4: 1 תערובת של dichloromethane וdimethylformamide. הוסף קוקטייל צימוד ציסטאין זה מזרק fritted ועדינות לנער במשך 6 שעות. לשטוף באמצעות הפרוטוקול שתואר קודם לכן.
- לאשר צימוד באמצעות בדיקת ninhydrin (-), ואחריו ההסרה של רכיב Fmoc עם piperidine 20% וכביסה. ודא מסוף החופשי אמין באמצעות בדיקת ninhydrin (+).
- מחשוף של 1 מהשרף.
- הפוך פתרון של TFA (9.45 מיליליטר), מים (0.25 מיליליטר), 1,2-ethanedithiol (0.25 מיליליטר), וsilane triisopropyl (0.1 מיליליטר), להוסיף אותו למזרק וללחוץ בעדינות במשך 4 שעות.
- לאסוף את הפתרון חום-אדום וכתוצאה מכך צינור Eppendorf ולהתאדות TFA באמצעות זרם של אוויר לאט.
- הוספת אתר diethyl קר (~ 15 מיליליטר) לצינור Eppendorf כדי לזרז 1, אשר יהווה תסיסה עדינה. לבודד את המוצר באמצעות צנטריפוגה (ז 1, 5 דקות). Tמחזורים חוזרים תרנגולת של כביסות אתר diethyl (~ 60 מיליליטר סה"כ) ו צנטריפוגות כדי להשיג 1 כאדום / חום מוצק.
2. אפיון וניתוח של 1
- ודא שהזהות תואמת את הקישוריות והרכב שמוצג באיור 2 באמצעות H 1 (16 סריקות) ו- 13 C NMR (512 סריקות) במתנול deuterated (300 μl) וניתוח ESI-MS.
מצפה את התוצאות הבאות:
1 ספקטרום NMR H (CD 3 OD) δ / עמודים לדקה: 1.407-1.684 (מ ', 6 שעות), 2.245 (t, 2H), 2.665-3.150 (מ', 12H), 4.015 (t, 1H), 4.104 (ד, 2H ), 4.274 (q, 1H), 4.426 (ד, 2H), 4.479 (q, 1H), 4.595 (t, 1H) ו -13 ספקטרום NMR C (CD 3 OD) δ / עמודים לדקה: 24.644 (CH 2), 25.472 (CH 2), 28.051 (CH 2), 28.300 (CH 2), 35.474 (CH 2), 38.698 (CH 2), 39.241 (CH 2), 39.717 (CH 2), 55.340 / 55.538 (CP-טבעת), 60.286 (CH), 61.964 (CH), 62.521 / 62.821 (CP-טבעת), 66.038 / 66.170 (CP-טבעת), 69.153 / 69.328 (CP-טבעת), 71.468 / 71.593 (CP-טבעת), 76.466 (CH), 171.770 (C = O), 175.361 (C = O).
ESI-MS (m / z): נמצא: 639.00 [1 + Na] +, תיאורטי: 639.1 [1 + Na] + וHR-MS (m / z): נמצא: 617.2049 [1 + H] +, תיאורטי: 617.1622 [1 + H] +. - בצע HPLC, ניתוח יסודות כדי לאשר את ההרכב של 1 מבודד.
לבצע chromatograms HPLC באמצעות C8 הפוך טור שלב עם 100% MeOH בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר / דקה. הערה: פעמים שמירת HPLC היו: 3.198-4.674 דקות.
3. קיבוע של 1 על משטח זהב
- פולימר Cut מגובה שקופיות זהב לריבועים של ~ 0.25 ב 2.
- מלא כוס 50 מיליליטר עם פתרון מים DI של 1 (~ 1 מ"מ).
- הוסף את שקופיות זהב לכוס ומכסה בזכוכית שעון. כלow שקופיות הזכוכית כדי לדגור O / N ב RT ללא תסיסה.
- הסר את שקופית זהב מהפתרון ולאפשר לו להתייבש באוויר.
- להשיג סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים (או שווה ערך) כדי לצפות במשותק 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטופס מחויב השרף של 1 מוצג באיור 2. הקובץ המצורף קוולנטיים של רכיב ferrocene מוליד גוון כתום לחרוזי השרף שהוא עקשן עם שטיפה רציפה ומעיד על ברזל משותק מכיל מורכב בניגוד לספיגת ברזל על ידי מרכיב PEG של גרגרי השרף. הטופס ללא שרף של 1 הוא זהה בצבע לחרוזי השרף. לאחר פינוי המתחם מהשרף-חרוזים, את הטוהר והתשואה (68%) כתוצאה מהשיטות הוא עדיף בהרבה על המתודולוגיה פתרון טיפוסית. ניתוח יסודות של המוצר הראה כי 1 היה מבודד כמו מלח TFA: Calcd (נמצא) לC 26 H 36 FEN 6 O 4 S 2 4TFA: C, 38.07 (38.90); H, 3.76 (4.20); N, 7.83 (7.70). התשואה וכתוצאה מכך (105.1 מ"ג, 68%) מתגובה אופיינית מבוססת על תוצאות ניתוח יסודות. ניתוח NMR בprov מתנול deuteratedספקטרום NMR H IDed 1 (OD CD 3) δ / עמודים לדקה: 1.407-1.684 (מ ', 6 שעות), 2.245 (t, 2H), 2.665-3.150 (מ', 12H), 4.015 (t, 1H), 4.104 (ד, 2H), 4.274 (q, 1H), 4.426 (ד, 2H), 4.479 (q, 1H), 4.595 (t, 1H) ו -13 ספקטרום NMR C (CD OD 3) δ / עמודים לדקה: 24.644 (CH 2), 25.472 (CH 2), 28.051 (CH 2), 28.300 (CH 2), 35.474 (CH 2), 38.698 (CH 2), 39.241 (CH 2), 39.717 (CH 2), 55.340 / 55.538 (CP-טבעת) , 60.286, 61.964 (CH) (CH), 62.521 / 62.821 (CP-טבעת), 66.038 / 66.170 (CP-טבעת), 69.153 / 69.328 (CP-טבעת), 71.468 / 71.593 (CP-טבעת), 76.466 (CH ), 171.770 (C = O), 175.361 (C = O). פעמים שמירת HPLC היו: 3.198-4.674 דקות. הפסגות מרובות נצפו בניתוח HPLC אושרו להיות מלחי TFA של 1 כפי שתוארו לעיל באמצעות ניתוח יסודות. ספקטרומטר מסת קורלציה למבנה שמוצג באיור 2: ESI-MS (m / z): נמצא: 639.00 [1 + Na] +,תיאורטי: 639.1 [1 + Na] + וHR-MS (m / z): נמצא: 617.2049 [1 + H] +, תיאורטי: 617.1622 [1 + H] +. ספקטרום קליטה אלקטרוני התקבל במים והראה מקסימום λ (ε, M -1 -1 סנטימטר) 268 (4,779.8), 434 (324.26).
השיטות המשמשות לדגירת שקופיות זהב קטנה בפתרון של bioconjugate 1 מיוצגות בציור סכמטי באיור 3. שכבה דקה של זהב חזרה עם חומר פולימרים נוסף לפתרון של 1 ואפשרה לדגירת O / N. שקופית הזהב הייתה אז לשטוף במי DI ולהתייבש. במקביל, שקופיות זהב הייתה שיתוף מודגרות במי DI ורחצו באותו אופן. SEM תמונות של שתי דגימות, מוצגות באיור 4, הראו כי פני השטח של שקופית זהב שיתוף הודגרו עם 1 שונו. זה מצביע על כךאינטראקציות thiolate של 1 לספק עוגן של התקשרות למשטח הזהב.
איור 1. יסודות של biosensor. דוגמא ספציפית של biosensor אלקטרוכימי כדי לזהות ישירות יעד בפתרון.
2. שיטות סינטטי איור משמשות לייצור 1. השיטות המשמשות לדגירת שקופיות זהב קטנה בפתרון של bioconjugate 1 מיוצגות בציור סכמטי באיור 3. שכבה דקה של זהב חזרה עם חומר פולימרים נוסף לפתרון של 1 ואיפשר לדגירת O / N. שקופית הזהב הייתה אז לשטוף במי DI ולהתייבש. במקביל, שקופיות זהב הייתה שיתוף מודגרות במי DI ורחצו באותו אופן. SEM תמונות של שתי דגימות, מוצג באיור 4, הראה כי פני השטח של שקופית זהב שיתוף הודגרו עם 1 שונו. זה מצביע על כך אינטראקציות thiolate של 1 לספק עוגן של התקשרות למשטח הזהב.
איור 3. ציור סכמטי המייצג את חוסר התנועה של 1 על לשקופית זהב. התהליך כרוך המסת bioconjugate במים והוספת שקופיות זהב. O דגירה / N ואחריו שטיפה של השקופית. ניתוח לקיבוע מוצלח מתבצע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מוצג באיור 4.
איור 4. תמונות SEM של זהב שכבות על גבי סרט פלסטיק פולימר. () Sans הדגירה 1 ו- (ב) foדגירה llowing עם 1 בO מים / N ושטיפה במים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסינתזה של נגזרי ferrocene סימטריים מאתגרת בפתרון. לדוגמא, מנסה לייצר 1 בפתרון הביא לתשואות נמוכות של המוצר הרצוי (פחות מ -20%). כמו כן, תגובות ניצול 1'-אמינו-ferrocene חומצה קרבוקסילית (sans Fmoc) וביוטין מחויב השרף הביאו מוצר מסיס בקנה אחד עם מוצר polymerized שדווח על ידי et al Baristic. ומוצר מינימאלי. 47 זה מסתבך עוד יותר על ידי ferrocene ונגזרותיו להיות רגיש לאור ושקרוב באמינו נוטה dimerize בפתרון. סוגיות אלו הופכות את תגובות וטיפולים נרחבים מאתגרות. עם זאת תגובתיות זו ניתן לעקוף באמצעות שיטות שלב מוצקות ראשון שפותחו על ידי Merrifield לסינתזה של פפטידים. הסינתזה של מערכות ferrocene-peptide זכתה לתשומת לב על ידי מספר קבוצות והובילה לספרייה של מערכות פפטיד-ferrocene א-סימטריים. 46,48-52 העבודהמתואר כאן מפרט את הסינתזה של יו-conjugates ferrocene א-סימטרי הראשון המכיל ביוטין-ferrocene-ציסטאין. תרכובת זו משמשת כמודל שדרכו קולטנים מולקולה קטנים אחרים יכולים להיחשב לצורך זיהוי של מולקולות רלוונטיות מבחינה ביולוגית. בעבודה זו נוצל כלקשור קיבוע למשטח זהב.
השלב הראשון של סינתזה היה להשיג ליבת ביוטין משותקת על שרף מצב מוצק באמצעות מקשר אמין מבוסס. שרף -Fmoc-ethylenediamine N -Biotin- 'N ניתן לרכוש מסחרי כמו ביוטין NovaTag שרף ושמש כבסיס ליו-המצומד 1. קבוצת הגנת Fmoc-אמינו הוסרה באמצעות פתרון 20% מpiperidine בdimethylformamide וחיובי (כחול) ninhydrin בדיקה אישרה deprotection המוצלח. האמין ללא ביוטין מאוגד השרף שימש אז לעגן ferrocene באמצעות קוקטייל צימוד המורכב מdiisopropyl האמין אתיל,carbodiimide diisopropyl, ומימה 1-hydroxybenzotriazole. 40,46 מגוון של מבשרי ferrocene זמינים למטרות אלה וכוללים חומצה קרבוקסילית ferrocene וחומצה קרבוקסילית 1'-Fmoc-אמינו-ferrocene. שימוש בתשואות מערכת לשעבר מונו להחליף ביו-conjugates שיש רק אחד של טבעות cyclopentadienyl שונה עם תוספת ביוטין. נגזר ferrocene האחרון מורכב מהחלפה המאונכות של טבעות cyclopentadienyl עם חומצה קרבוקסילית וקבוצת אמינו מוגנת-Fmoc. החלפה כזו מאפשרת שינוי סימטרי מורחב של ליבת ferrocene מאפשרת שינוי נפרד של טבעות cyclopentadienyl לייצר ביו-conjugates כגון 1. חרוזים הצהובים בהירים השתנו לגוון כתום בהיר על צימוד מוצלח של ferrocene לליבת יוטין-השרף, כפי שמוצגים באיור 2.
בשלב הבא של סינתזת מגוון linkers יכול להיות מחוברלאמין ללא משלימת ferrocene מאוגדת שרף. למטרות של מערכת זו, ציסטאין נוצל כפי שהוא thiolate המכיל חומצת אמינו. מרכיב thiolate מאפשר חיבור של יו-המצומד למשטח זהב, כפי שנראה להלן. שינוי עם ציסטאין המשיך על ידי תגובה של המערכת מחויבת השרף עם אה Fmoc-Cys (MMT). להסרת מקבוצת Fmoc עם piperidine 20% בdimethylformamide מניבה צורות השרף מחויבת של 1. ביו-לצמד-מחויב שרף הוסר מהתמיכה המוצקה על ידי מחשוף של המערכות ביו-אורגן-מתכתי באמצעות פתרון של חומצת trifluoroacetic (TFA), מים וsilane triisopropyl. אידוי של הפתרון ותוספת של אתר diethyl קר החומצה הניב ביו-המצומד 1 כלהיות מלח אדום-כתום מוצק נחוש TFA של 1 כפי שאושר על ידי ניתוח היסודות וNMR. טוהר אושר על ידי ניתוח HPLC.
כדי להציג הוכחה של עיקרון למרכיב ציסטאין מתן לקשור קובץ מצורף ליו-המצומד 1, בתצהיר של 1 על משטח זהב שנחקר. זיקת Au-S הידוע מאפשרת לקיבוע קליל של 1 על משטח זהב פולימר מגובה. בניסוי זה, משטח הזהב נוקה ומלוטש בעדינות. השקופית אז טבלו פתרון מים ~ 1 מ"מ של 1 ואפשרה להגדיר O / N. משטח Au לאחר מכן לשטוף במים מזוקקים ומיובש עם Kimwipe. שקופיות הזהב אז הוערכו לשינוי באמצעות SEM. התמונות שמוצגים באיור 4 מייצגות monolayer של 1 שנוצר על פני השטח הזהב. הפגמים במשטח הם מניחים שזו תוצאה של 'חורים' בשכבה של 1 ונמצאים תחת חקירה נוספת על ידי הקבוצה שלנו.
, השיטות סינתטיות בסך הכל לייצר bioconjugates ferrocene שיכולותלהיות משותק על משטח זהב מדווחים. העבודה היא רומן בסינתזה של תרכובות שferrocene א-סימטריים הוא לערער על ידי מערך של תגובות לוואי שהובילו לתשואות וטוהר נמוכים. כמו שיש לי ferrocene-bioconjugates דומה ל1 יישומים כמו חיישנים ביולוגיים פוטנציאליים, להתגבר על קשיים אלה סינטטיים הוא בעל חשיבות עליונה. שימוש בשיטות מוצק שלב דומה לסינתזת פפטיד מוצק שלב, bioconjugate מאופיין היטב 1 המכיל ביוטין-ferrocene-ציסטאין הופק. יתר על כן, SEM שימש כדי להראות כי מערכת זו היא היכולת לדבוק משטח זהב הודות למחצית thiolate של רכיב ציסטאין. בסך הכל, מתודולוגיה סינתטית הפשוטה הניתנת במסמך זה יכול בקלות להיות שונה עבור רצפי פפטיד ומערכות ביו-המצומד למערך של יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KG נתמכה על ידי P-1,760 מענק RA וולש הקרן, TCU אנדרוס מכון למתמטיקה וחינוך מדעי (לק"ג), מחקר TCU ויצירתיות הפעילות גרנט (לק"ג) וTCU SERC גרנט (לJHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin Novatag Resin | NovaBiochem | 8550510001 | |
| TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe | Fisher | NC9299151 | |
| piperidine | Acros | P/3520/PB05 | |
| ninhydrin test | Sigma-Aldrich | 60017-1ea | |
| 1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid | Omm Scientific | Special Order | |
| N,N′-Diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407-5G | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Novabiochem | 8520080025 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T5408 | |
| 1,2-ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 2930 | |
| triisopropyl silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Eppendorf tubes (20 ml) | any source | ||
| methanol | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dichloromethane | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dimethylformamide | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| centrifuge | any source |
References
- Wang, J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics. Biosens Bioelectron. 21 (10), 1887-1892 (2006).
- Scarborough, J. H., Brusoski, K., Brewer, S., Green, K. N. Solid phase synthesis of ferrocene-biotin bioconjugates and reactivity with avidin. A paradigm for development of electrochemical biosensors. , Texas Christian University. Fort Worth, Texas. (2014).
- Zhang, S., Zheng, F., Wu, Z., Shen, G., Yu, R. Highly sensitive electrochemical detection of immunospecies based on combination of Fc label and PPD film/gold nanoparticle amplification. Biosens Bioelectron. 24 (1), 129-135 (2008).
- Gobi, K. V., Mizutani, F. Layer-by-layer construction of an active multilayer enzyme electrode applicable for direct amperometric determination of cholesterol. Sensors and Actuators. 80 (3), 272-277 (2001).
- Gobi, K. V., Mizutani, F. Amperometric detection of superoxide dismutase at cytochrome c-immobilized electrodes: Xanthine oxidase and ascorbate oxidase incorporated biopolymer membrane for in-vivo analysis. Analytical Sciences. 17 (1), 11-15 (2001).
- Gobi, K. V., Sato, Y., Mizutani, F. Mediatorless superoxide dismutase sensors using cytochrome c-modified electrodes: Xanthine oxidase incorporated polyion complex membrane for enhanced activity and in vivo analysis. Electroanalysis. 13 (5), 397-403 (2001).
- Shankaran, D. R., Uehara, N., Kato, T. A metal dispersed sol-gel biocomposite amperometric glucose biosensor. Biosensor.., & Bioelectronics. 18 (5-6), 721-728 (2003).
- Yamamoto, K., Xu, F., Shi, G. Y., Kato, T. On-line biosensor for detection of glucose, choline and glutamate simultaneously integrated with microseparation system. Journal of Pharmacological Sciences. 91, 211p-211 (2003).
- Luppa, P. B., Kaiser, T., Cuilleron, C. Y. Ligand-binding studies of sex hormone-binding globulin with 17alpha-dihydrotestosterone derivatives as ligands using a surface plasmon resonance biosensor. Clinical Chemistry. 47 (6), A9-A9 (2001).
- Luppa, P. B., Sokoll, L. J., Chan, D. W. Immunosensors - principles and applications to clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 314 (1-2), 1-26 (2001).
- Mallat, E., Barcelo, D., Barzen, C., Gauglitz, G., Abuknesha, R. Immunosensors for pesticide determination in natural waters. Trac-Trends in Analytical Chemistry. 20 (3), 124-132 (2001).
- Pemberton, R. M., Hart, J. P., Mottram, T. T. An electrochemical immunosensor for milk progesterone using a continuous flow system. Biosensor.., & Bioelectronics. 16 (9-12), 715-723 (2001).
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, W., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Annals of Biomedical Engineering. 27 (6), 697-711 (1999).
- May, K. M. L., Wang, Y., Bachas, L. G., Anderson, K. W. Development of a whole-cell-based biosensor for detecting histamine as a model toxin. Analytical Chemistry. 76 (14), 4156-4161 (2004).
- Taylor, C. J., Bain, L. A., Richardson, D. J., Spiro, S., Russell, D. A. Construction of a whole-cell gene reporter for the fluorescent bioassay of nitrate. Analytical Biochemistry. 328 (1), 60-66 (2004).
- Philp, J. C., et al. Whole cell immobilised biosensors for toxicity assessment of a wastewater treatment plant treating phenolics-containing waste. Analytica Chimica Acta. 487 (1), 61-74 (2003).
- Subrahmanyam, S., Piletsky, S. A., Turner, A. P. F. Application of natural receptors in sensors and assays. Analytical Chemistry. 74 (16), 3942-3951 (2002).
- Ryberg, E., et al. Identification and characterisation of a novel splice variant of the human CB1 receptor. Febs Letters. 579 (1), 259-264 (2005).
- Cooper, M. A. Advances in membrane receptor screening and analysis. Journal of Molecular Recognition. 17 (4), 286-315 (2004).
- Kumbhat, S., et al. A novel receptor-based surface-plasmon-resonance affinity biosensor for highly sensitive and selective detection of dopamine. Chemistry Letters. 35 (6), 678-679 (1246).
- Yemini, M., Reches, M., Gazit, E., Rishpon, J. Peptide nanotube-modified electrodes for enzyme-biosensor applications. Analytical Chemistry. 77 (16), 5155-5159 (2005).
- Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77 (21), 6976-6984 (2005).
- Drummond, T. G., Hill, M. G., Barton, J. K. Electrochemical DNA sensors. Nature Biotechnology. 21 (10), 1192-1199 (2003).
- Piunno, P. A. E., Krull, U. J. Trends in the development of nucleic acid biosensors for medical diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (5), 1004-1011 (2005).
- Dechtrirat, D., et al. Electrochemical displacement sensor based on ferrocene boronic acid tracer and immobilized glycan for saccharide binding proteins and E. coli. Biosensor.., & Bioelectronics. 58, 1-8 (2014).
- Lacina, K., et al. Combining ferrocene, thiophene and a boronic acid: a hybrid ligand for reagentless electrochemical sensing of cis-diols. Tetrahedron Letters. 55 (21), 3235-3238 (2014).
- Takahashi, S., Anzai, J. Recent Progress in Ferrocene-Modified Thin Films and Nanoparticles for Biosensors. Materials. 6 (12), 5742-5762 (2013).
- Liu, L., et al. Amplified voltammetric detection of dopamine using ferrocene-capped gold nanoparticle/streptavidin conjugates. Biosensor.., & Bioelectronics. 41, 730-735 (2013).
- Shankaran, D. R., Gobi, K. V. A., Miura, N. Recent advancements in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small molecules of biomedical, food and environmental interest. Sensors and Actuators B-Chemical. 121 (1), 158-177 (2007).
- Szarka, Z., Kuik, Á, Skoda-Földes, R., Kollár, L. Aminocarbonylation of 1,1′-diiodoferrocene, two-step synthesis of heterodisubstituted ferrocene derivatives via homogeneous catalytic carbonylation/coupling reactions. Journal of Organometallic Chemistry. 689 (17), 2770-2775 (2004).
- Niu, H. T., et al. Imidazolium-based macrocycles as multisignaling chemosensors for anions. Dalton Trans. (28), 3694-3700 (2008).
- Qing, G. -Y., Sun, T. -L., Wang, F., He, Y. -B., Yang, X. Chromogenic Chemosensors forN-Acetylaspartate Based on Chiral Ferrocene-Bearing Thiourea Derivatives. European Journal of Organic Chemistry. (6), 841-849 (2009).
- Romero, T., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A multiresponsive two-arm ferrocene-based chemosensor molecule for selective detection of mercury. Dalton Trans. (12), 2121-2129 (2009).
- Zapata, F., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A selective redox and chromogenic probe for Hg(II) in aqueous environment based on a ferrocene-azaquinoxaline dyad. Inorg Chem. 48 (24), 11566-11575 (2009).
- Alfonso, M., Tarraga, A., Molina, P. Ferrocene-based multichannel molecular chemosensors with high selectivity and sensitivity for Pb(II) and Hg(II) metal cations. Dalton Trans. 39 (37), 8637-8645 (2010).
- Zapata, F., Caballero, A., Molina, P., Tarraga, A. A ferrocene-quinoxaline derivative as a highly selective probe for colorimetric and redox sensing of toxic mercury(II) cations. Sensors (Basel). 10 (12), 11311-11321 (2010).
- Thakur, A., Sardar, S., Ghosh, S. A highly selective redox, chromogenic, and fluorescent chemosensor for Hg2+ in aqueous solution based on ferrocene-glycine bioconjugates). Inorg Chem. 50 (15), 7066-7073 (2011).
- Sathyaraj, G., Muthamilselvan, D., Kiruthika, M., Weyhermüller, T., Nair, B. U. Ferrocene conjugated imidazolephenols as multichannel ditopic chemosensor for biologically active cations and anions. Journal of Organometallic Chemistry. 716, 150-158 (2012).
- Kwon, S. J., Kim, E., Yang, H., Kwak, J. An electrochemical immunosensor using ferrocenyl-tethered dendrimer. Analyst. 131 (3), 402-406 (2006).
- Pinto, A., Hoffmanns, U., Ott, M., Fricker, G., Metzler-Nolte, N. Modification with Organometallic Compounds Improves Crossing of the Blood-Brain Barrier of [Leu(5)]-Enkephalin Derivatives in an In Vitro Model System. Chembiochem. 10 (11), 1852-1860 (2009).
- Barisic, L., et al. The first ferrocene analogues of muramyldipeptide. Carbohydr Res. 346 (5), 678-684 (2011).
- Brusoski, K., Green, K. N. Novel click derivatives of ferrocene and their applications toward construction of electrochemical biosensors. Abstracts of Papers, 243rd ACS National Meetin.., & Exposition. 2012 Mar 25-29, San Diego, CA, United States, , BIOL-28. (2012).
- Bucher, C., Devillers, C. H., Moutet, J. -C., Royal, G., Saint-Aman, E. Anion recognition and redox sensing by a metalloporphyrin–ferrocene–alkylammonium conjugate. New Journal of Chemistry. 28, 1584-1589 (2004).
- Tanaka, S., Yoshida, K., Kuramitz, H., Sugawara, K., Nakamura, H. Electrochemical detection of biotin using an interaction between avidin and biotin labeled with ferrocene at a perfluorosulfonated ionomer modified electrode. Analytical Sciences. 15 (9), 863-866 (1999).
- Real-Fernandez, F., et al. Ferrocenyl glycopeptides as electrochemical probes to detect autoantibodies in multiple sclerosis patients' sera. Biopolymers. 90 (4), 488-495 (2008).
- Husken, N., Gasser, G., Koster, S. D., Metzler-Nolte, N. Four-potential' ferrocene labeling of PNA oligomers via click chemistry. Bioconjug Chem. 20 (8), 1578-1586 (2009).
- Barisic, L. Croatica Chemica Acta. 75, 199-210 (2002).
- Kirin, S. I., Noor, F., Metzler-Nolte, N. Manual Solid-Phase Peptide Synthesis of Metallocene–Peptide Bioconjugates. Journal of Chemical Education. 84 (1), 108-111 (2007).
- Barisic, L., et al. Helically chiral ferrocene peptides containing 1 '-aminoferrocene-1-carboxylic acid subunits as turn inducers. Chemistry-a European Journal. 12 (19), 4965-4980 (2006).
- Mahmoud, K., Long, Y. -T., Schatte, G., Kraatz, H. -B. Electronic communication through the ureylene bridge: spectroscopy, structure and electrochemistry of dimethyl 1′,1′-ureylenedi(1-ferrocenecarboxylate). Journal of Organometallic Chemistry. 689 (13), 2250-2255 (2004).
- Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. Synthesis and electrochemical investigation of oligomeric ferrocene amides: Towards ferrocene polyamides. Journal of Inorganic and Organometallic Polymers and Materials. 16 (3), 201-210 (2006).
- Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. A bioorganometallic approach for the electrochemical detection of proteins: A study on the interaction of ferrocene-peptide conjugates with papain in solution and on au surfaces. Chemistry-a European Journal. 13 (20), 5885-5895 (2007).
