Abstract
Erken teşhis çoğu hastalıkların başarılı tedavisi için bir anahtardır, ve birçok kanser türlerinin tanı ve tedavisi için özellikle zorunludur. kullanılan en yaygın teknikler Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), Pozitron Emisyon Topografi (PET) ve Bilgisayarlı Topografya (BT) gibi görüntüleme yöntemleri ve hastalığın fiziksel yapısını anlamak için en uygun ama sadece bir kez yapılan her dört edilebilir olan görüntüleme ajanları ve genel maliyet kullanımı nedeniyle altı hafta. Zihin, bu tür tedavi protokolleri devrim olur, hastalık ve / veya klinisyenin ofisinde tedavinin etkinliği aşamasına değerlendirmek ve zamanında bunu biyosensörlere gibi teknikler, "bakım noktası" geliştirilmesi. 1. As ile bu biyolojik ilgili moleküllerin 2 tespiti için ferosen tabanlı biyosensörler keşfetmek için bir araç, yöntemler burada tarif edilen ferrosen-biyotin biyo-konjugatlarını üretmek için geliştirilmiştir. Bu rapor, altın yüzey üzerinde immobilize edilebilir bir biyotin-ferrosen-sisteyin sistemi üzerinde durulacaktır.
Introduction
Biyosensörler seçici analiz için platform olarak biyomoleküler tanıma teknolojisini kullanır ve kendi özgüllüğü, hız ve düşük maliyetli için kullanılan küçük cihazlardır. Biyomoleküllerin tespiti için elektrokimyasal biyosensörler nedeniyle basitlik, maliyet etkinliği ve yüksek hassasiyet bu alanın ön planda bulunmaktadır. Bu sensörlerin 1,3 genel anatomisi ilgi biyolojik marker için spesifik bir tanıma molekülü ile donatılmış bir elektrod olup . Tanıma molekülü tarafından bir biyolojik bağlanması, basit bir ölçümü ile tespit edilebilir potansiyel ya da mevcut yerel bir değişim ile sonuçlanır. Enzimler 4-8 antikorları, 9-12 tüm hücreleri, 13-16 reseptörleri, 17-20 peptidler 21-23 ve DNA 24 ve büyük ölçüde daha büyük, biyolojik moleküller odaklanmıştır değişebilir tanıma parçasını Bugüne kadar. 25-28 Araştırma Bu alanda çalışmalar İmmunosensörler whe üzerinde yoğunlaşmış olmasıbir immünoglobulin bir redoks aktif çekirdeği ile hareketsiz hale getirilmiştir (örneğin ferrosen gibi) ve ilgilenilen bir antikoru belirlemek için kullanılan yeniden. Bu çalışmalar antijen / antikor kullanımından kaynaklanan komplikasyonlar kaynaklanan nedeniyle zayıf hassasiyet ve zaman tüketimi, klinik uygulamalar dışında tutulmuştur. 1,3 Büyüyen dikkat biyomedikal küçük moleküllerin tespit (az 1 kg / mol) odaklanmıştır , gıda ve ulusal güvenliğin yanı sıra çevre faiz. 29 biyosensör cihazların en iyi bilinen örnekleri cep boyutunda amperometik metre bağlanmış ekran baskılı enzim elektrotları sahip self-test glukoz monitörleri vardır. Bu sistemler, tipik haliyle glukoz oksidasyon reaksiyonu tarafından üretilen yükün toplam miktarı, belirli bir süre boyunca ölçülür bir kulometrik bir yöntem kullanmaktadır. Menkul cihazlar, taşınabilir, sağlam ve olmalıdır büyük nüfus için uyduruk faydalanmak için el.
Ferroken gibi redoks etiketleri necessa vardırEn biyomarkırlar özünde elektrokimyasal olarak aktif değil gibi ry çözeltide biyomarkerların veya küçük moleküllerin elektrokimyasal algılanmasını sağlamak için. 30-38 Ferrosen elektrokimyasal biyosensörler entegrasyon için mükemmel bir seçimdir elektrokimya için altın standart, bir organometalik moleküldür. Ferrosen-tabanlı redoks aktif türler zaten nedeniyle küçük boyutu, iyi bir istikrar, uygun sentetik erişimi kolay kimyasal modifikasyonu, göreceli Lipofillik ve redoks ayar kolaylığı büyük ilgi topladı. 3,30-42 Küçük moleküller var ferrosen çekirdek dayalı metal iyonları ve küçük moleküller detektör olarak yaygın şekilde kullanılmıştır. Biyomoleküller gibi daha büyük türlerin hedef 32-38,43 sistemleri elektrokimyasal yüzeyine gömülü olan ferrosen türevleri, büyük antikorlara veya immünoglobülin eki kullanmışlardır. 1,3,39 Her durumda, 44, potansiyel ve akım intensiFe III / Fe II redoks çiftinin Ty Böylece analit molekül mevcudiyetine işaret eden, yeni bir spektroskopik sap üretmeden, molekül birleştirme üzerine değiştirilmiştir. Bu değişiklik siklopentadienil halkaları pi-sistem ve demir D-orbitalleri arasında meydana kapsamlı örtüşme kaynaklanmaktadır. Pi-sistem değiştirilirse, yani, derive ya, ardından yörünge etkileşimi olacak, sırayla, değişim tepki gösterdi. Bu, Fe çekirdek etkiler ve demir III / Fe II çift potansiyel bir kayma olarak gözlenebilir. 40,45,46 Bu özellikler, bir elektrokimyasal bağışıklık ya da biyo-sensörün niceleme madde olarak kullanım için bu tür bir sistem cazip hale getirmektedir.
Biyosensör kapasiteleri için özel ferrosen ihtiva eden sistemlerin üretilmesi amacıyla, bir hedef molekül için spesifik biyo-reseptörü ile bir Cp halkasının değiştirme ve elektrokimyasal okuma veya elektroda bir molekül halata gibi Cp halkasının kullanılması en uygunudurTrode (Şekil 1). Bu asimetrik ferrosen türevlerinin sentezi yan reaksiyonların ve moleküller arası çapraz bağlanma üzerine oluşan dimerik ve polimerik türlerinin oluşumu sebebi ile zorlanır. 47 Bununla birlikte, bir amid bağı üreten birleştirme kimyası biyolojik bileşenleri gibi ilgili ferrosen basit türevler sağlamak için en kısa yol olduğu peptidler ve bunların metabolitleri gibi. Bu nedenle, ilk olarak peptid sentezi için Merrifield tarafından 1950'li yıllarda geliştirilen bir katı faz teknikleri ferrosen içeren organometalik bileşikler için uygulanabilir. Yer alır dik ikame 1'-Fmoc-amino-ferrosen-1-karboksilik asit molekülünün, bir alıcı parçasını (biyotin), elektrokimyasal okuma (ferrosen) ve hareketsiz kılma-bağlayıcı bileşen (sistein) içeren bir ferrosen sistemi kullanılmasıyla inşa ve burada ayrıntılı olarak. Bu biyo-konjugat sentezi altın yüzeyinde immobilizasyon için kanıtların yanı sıra ele alınmaktadır. Bu çalışma Temsilci VekiliBiotin, ferrosen ve bir altın yüzeye immobilizasyon için bir amino asitten oluşan bir sistemin birinci sunum ts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biyotin-Fc-sistein 1. N- (1)
- Katı faz yöntemleri 1 reçineye bağlı üretmek.
- Bir fritli şırınga içine biyotin yüklenmiş reçine (250 mg, 0.145 mmol), koyun ve dimetilformamid (5 mi) içine çekilmesi ve 20 dakika süre ile bir laboratuar karıştırıcısı üzerinde şırınga çalkalayarak, reçineyi kabartmak. Çözüm sınırdışı ve bir kez daha şişme dimetilformamid tekrarlayın.
- Çalkalama 10-15 dakika süre ile bir şırınga dimetilformamid içinde% 20 piperidin içinde 6/4 ml ilave etmek suretiyle Fmoc koruyucu grubu kaldırmak. Piperidin başka 4-6 ml korumanın kaldırılması işlemi tekrarlayın. ~, 3x diklorometan 5 ml her biri metanol (1: 1), 3x metanol: diklorometan (1: 1) 3x dimetilformamid sekansı 3x dimetilformamid reçinenin yıkayın. Isıtma üzerine mavi varlığı başarılı korumasının kaldırılması onaylamak için boncuk küçük bir örnekleme (~ 10) üzerinde bir ninhidrin testi (+) yapın.
- 1'-Fmoc-amino-ferrosen-1-karboksilik asit ihtiva eden bir çözelti karıştırın(203,3 mg, 0,4350 mmol), 1-hidroksibenzotriazol hidrat (58.8 mg, 0.413 mmol), diisopropil karbodiimid (0,0673 mi, 0.435 mmol), diizopropil etil amin (0,0757 mi, 0.435 mmol) ve 4: diklorometan 1 karışımı Dimetilformamit içine yerleştirilir. Sırlı şırınganın içine bu çizin ve 6 saat süreyle bir laboratuar çalkalayıcı üzerinde yavaşça çalkalayın. Daha sonra şırınga çözüm çıkarmak ve daha önce tarif edildiği gibi yıkama yapılır.
- Kaplin doğrulamak için, yukarıda anlatıldığı gibi (-) ninhidrin testi gerçekleştirir. Ninhidrin testi hala parçasını içeren demir eki elde edilen boncuk portakal rengi rağmen kaplin teyit de yararlı olabilir.
- Sonra dimetilformamid içinde% 20 piperidin ile eklenmesi ile Fmoc grubunun çıkarılması ve yukarıda tarif edildiği gibi yıkanmıştır. Ninhidrin testi (+) Fmoc kaldırma teyit etmek için kullanılmalıdır.
- (0,0673 ml Fmoc-Cys (Trt) oluşan bir çözelti -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-hidroksibenzotriazol hidrat (58.8 mg, 0,4125 mmol), diisopropil karbodiimid hazırlanması, 0,4350mmol), diizopropil etil amin (0,0757 mi, 0,4350 mmol) ve 4: diklorometan ve dimetilformamid 1 karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Bu sistein bağlama KOKTEYLİ sırlı şırınga ekleyin ve hafifçe 6 saat çalkalanır. Daha önce tarif edilen protokol kullanılarak yıkanır.
- % 20 piperidin ile yıkama ile, Fmoc bileşeni uzaklaştırılarak elde edilmiş, (-) ninhidrin testi ile bağlanması kontrol edin. Ninhidrin testi (+) kullanarak amin ücretsiz terminali doğrulayın.
- Reçineden 1 yarılması.
- Bir TFA çözeltisi (9.45 mi), su (0.25 mi), 1,2-etanditiol (0.25 mi) ve triizopropil silan (0.1 mi) yapmak şırınga ekleyin ve 4 saat için hafifçe çalkalanır.
- Bir Eppendorf tüpü içinde elde edilen kırmızı-kahverengi bir çözelti toplayın ve yavaş yavaş bir hava akımı kullanılarak TFA buharlaşır.
- Soğuk dietil eter ekleyin (~ 15 mi) Eppendorf tüpüne narin ajitasyon oluşturacak olan, 1 çökeltildi. Santrifüj ile ürünü (1 g, 5 dakika) izole edin. Tdietil eter yıkama (~ 60 ml toplam) ve santrifüj tavuk tekrar çevrimi, kırmızı / kahverengi bir katı olarak 1 elde edildi.
2. Karakterizasyonu ve 1 Analizi
- Kimlik 1 H (16 tarama) ve dötere metanol (300 ul) ve ESI-MS analizi 13 ° C NMR (512 tarama) ile, Şekil 2'de gösterilen bağlantı ve bileşim ile uyumlu olduğunu kontrol edin.
Aşağıdaki sonuçlar bekliyoruz:
1H-NMR spektrumu (CD3OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2.245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4.015 (t, 1 H), 4.104 (d, 2H ), 4,274 (k, 1 H), 4.426 (d, 2H), 4,479 (k, 1 H), 4,595 (t, 1 H) ve 13 ° C NMR spektrum (CD3OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH2), 28,051 (CH2), 28,300 (CH2), 35,474 (CH2), 38,698 (CH2), 39,241 (CH2), 39,717 (CH2), 55,340 / 55,538 (Co-halka), 60,286 (CıLH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Co-bağ), 66,038 / 66,170 (Co-bağ), 69,153 / 69,328 (Cp-bağ), 71,468 / 71,593 (Co-bağ), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O).
ESI-MS (m / z): Bulunan: 639.00 [1 + Na] +, teorik: 639,1 [1 + Na] + HR-MS (m / z): Bulunan: 617,2049 [1 + H] +, teorik: 617.1622 [1 + H] +. - HPLC, izole 1 bileşimini onaylamak için element analizi yapın.
Bir C8 ile yürütmek HPLC kromatogramları, 0.5 ml / dk'lık bir akış hızında% 100 MeOH ile ters fazlı kolon. Not: HPLC alıkoyma süreleri: 3,198-4,674 dak.
Gold Yüzey üzerinde 1 3. İmmobilizasyonu
- Kesme polimer 2'de ~ 0.25 kareler halinde altın slaytlar destekli.
- 1 (~ 1 mm) bir DI su çözeltisi ile bir 50 ml beher doldurun.
- Beher altın slayt ekleyin ve bir saat camı ile kaplayın. Tümakış cam slayt, herhangi bir çalkalama ile oda sıcaklığında O / N inkübe edilmesi.
- Çözelti altın slayt çıkarın ve havada kuru izin.
- 1 hareketsiz gözlemlemek için bir tarama elektron mikroskopu (ya da eşdeğeri) kullanılarak, elektron mikroskobu görüntülerini taramak elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 reçineye bağlı bir şekilde, Şekil 2 'de gösterilmiştir. ferrosen bileşeni kovalent bağlanması ile demir emilimini karşı sürekli yıkama ile kalıcı ve kompleks ihtiva eden bir hareketsiz demir göstergesidir reçine boncukları turuncu bir renk tonu meydana getirir bir reçine tanesi PEG bileşeni. 1 reçineden serbest form reçine boncukları renk aynıdır. Reçineden boncuklardan bileşiği çıkarılmasının ardından, yöntem elde edilen saflık ve verimle (% 68), tipik bir çözüm yöntemi çok daha üstündür. Cı 26 için hesaplanan (bulunan) 'H 36 Fen 6 O 4S 2 4TFA: Ürünün element analizi 1 TFA tuzu halinde izole edilmiştir gösterdi: C, 38,07 (38,90); H 3.76 (4.20); N, 7.83 (7.70). Tipik bir reaksiyonda elde edilen verim (105.1 mg,% 68), temel analiz sonuçlarına dayanmaktadır. Dötere metanol ata NMR analiziaryans 1 'H-NMR spektrumu (CD3OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2.245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4.015 (t, 1 H), 4.104 (d, 2H), 4,274 (k, 1 H), 4.426 (d, 2H), 4,479 (k, 1 H), 4,595 (t, 1 H) ve 13 ° C NMR spektrum (CD3OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH2), 28,051 (CH2), 28,300 (CH2), 35,474 (CH2), 38,698 (CH2), 39,241 (CH2), 39,717 (CH2), 55,340 / 55,538 (Co-halka) , 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Co-bağ), 66,038 / 66,170 (Co-bağ), 69,153 / 69,328 (Co-bağ), 71,468 / 71,593 (Co-bağ), 76,466 (CH ), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). HPLC alıkoyma süreleri: 3,198-4,674 Min. HPLC analizi gözlenen çok sayıda tepe element analizleri kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi 1 TFA tuzları olduğu teyit edilmiştir. Yapısına korelasyon Kütle spektrometrisi, Şekil 2'de gösterilen: ESI-MS (m / z): Bulunan: 639.00 [1 + Na] +Teorik: 639,1 [1 + Na] + HR-MS (m / z): Bulunan: 617,2049 [1 + H] +, teorik: 617,1622 [1 + H] +. Elektronik emme spektrumları su içinde alınmış ve λ maks gösterdi (ε, M-1 cm -1) 268 (4,779.8), 434 (324,26).
Bioconjugate 1 'in bir çözelti küçük bir altın slayt inkübe için kullanılan yöntemler, Şekil 3' de şematik bir çizimi gösterilmektedir. arka polimerik malzeme ile altın ince bir tabaka 1 ihtiva eden bir çözeltiye ilave edildi ve / N O kuluçkaya bırakılmıştır. Altın Lam daha sonra deiyonize su ile yıkandı ve kurumaya bırakıldı. Bağlantılı olarak, altın slayt DI suyla birlikte inkübe edildi ve aynı şekilde yıkandı. Şekil 4'te gösterilen iki numune, SEM görüntüleri, altın slayt 1 ile birlikte kuluçkaya sathı modifiye edilmiş olduğunu göstermiştir. Bu belirtir1 tiyolat etkileşimleri altın yüzeyine bağlanma bir çapa sağlar.
Bir biyosensör 1. Temel Şekil. Elektrokimyasal biyosensör spesifik bir örneği, doğrudan çözelti içinde bir hedef tespit etmek.
Bioconjugate 1 'in bir çözelti küçük bir altın slayt inkübe etmek için kullanılmalıdır 1. yöntem üretilmesi için kullanılan Şekil 2. Sentetik yöntemler Şekil 3'de şematik bir çizimi gösterilmektedir. Arka polimerik malzeme ile altın bir ince tabaka ihtiva eden bir çözeltiye ilave edildi 1 / N O kuluçkaya bırakıldı ve. Altın Lam daha sonra deiyonize su ile yıkandı ve kurumaya bırakıldı. Bağlantılı olarak, altın slayt DI suyla birlikte inkübe edildi ve aynı şekilde yıkandı. Iki numune SEM görüntüleriŞekil 4'te gösterildiği gibi, altın slayt 1 ile birlikte kuluçkaya sathı modifiye edilmiş olduğunu göstermiştir. Bu 1 tiolat etkileşimleri altın yüzeye bağlanma çapa sağlamak olduğunu göstermektedir.
Şekil altın slayta 1 immobilizasyon temsil 3. şematik çizim. Proses suyu olarak biokonjugatlannı çözülmesi ve altın slayt ekleyerek içerir. Kuluçka O / N sürgünün yıkama işlemi takip etmektedir. Başarılı bir hareketsizleştirme için analiz, Şekil 4'de gösterilen tarama elektron mikroskobu ile gerçekleştirilir.
Plastik bir polimer film üzerine tabakalı altın Şekil 4. SEM görüntüleri (A). Inkübasyon sans 1 ve (B) 'following su O / N, 1 ile inkübasyon ve su ile durulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
asimetrik ferosen türevlerinin sentezi çözeltisi içinde zordur. Örneğin, çözelti, arzu edilen ürün (% 20 den az) olarak düşük miktarlarda ürün olarak sonuçlanmıştır 1 üretmek için çalışır. Benzer şekilde, 1'-amino-ferrosen karboksilik asit (sans Fmoc) ve reçine bağlı biotini kullanan reaksiyonlar Baristic ark polimerize ürünle tutarlı çözünmeyen bir ürün ile sonuçlanmıştır. ve en az bir ürün. 47 Bu da Ferrocenenin ile komplike ve türevleri ışığa duyarlı olmak ve amino kongenerleri çözeltide dimerize eğilimli yani. Bu konular geniş reaksiyonlar ve tetkikleri zorlu olun. Bununla birlikte, bu tepkime, ilk peptitlerin sentezi Merrifield tarafından geliştirilen bir katı faz yöntemleri kullamlarak atlatılabilir. ferrosen-peptid sistemlerin sentezi çeşitli gruplar tarafından ilgi topladı ve asimetrik peptid-ferrosen sistemlerin bir kütüphane yol açmıştır. 46,48-52 işbiyotin-ferrosen-sistein içeren birinci asimetrik ferrosen biyo-konjugatlarının sentezi burada ayrıntılı tarif edilen. Bu bileşik, başka bir küçük molekül reseptörleri biyolojik ilgili moleküllerin saptanması için kabul edilebilir, üzerinden bir model olarak hizmet vermektedir. Bu çalışmada, bir altın yüzeye bir hareketsiz bağlama ipi olarak kullanıldı.
Sentezin ilk faz, bir amin bazlı bağlayıcı kullanılarak katı hal reçine üzerine immobilize bir biyotin çekirdeği elde etmek için yapıldı. K -Biotin- N 'Fmoc-etilendiamin reçine Biyotin NovaTag reçine ticari olarak satın alınabilir ve biyo-konjügat-1 arasında bir temel olarak kullanılmıştır. Fmoc-amino koruyucu grup, test başarılı deproteksiyonu teyit ninhidrin dimetilformamid içinde piperidin% 20 çözeltisi ve bir pozitif (mavi) kullanılarak uzaklaştırılmıştır. Reçineye bağlı biyotin serbest amin, daha sonra, diizopropil etil amin oluşan bir birleştirme kokteyli ferrosen çapa kullanıldıdiizopropil karbodiimid, ve 1-hidroksibenzotriazol hidrat. 40,46 ferrosen habercilerin bir dizi bu tür amaçlar için uygun olan ve ferrosen karboksilik asit ve 1-Fmoc-amino-ferrosen karboksilik asit yer alır. Eski sistem verimleri kullanımı sadece bir biyotin apendiks ile değiştirilmiş siklopentadienil halkalardan biri olan biyo-eşleniklerini ikame mono. ikinci ferrosen türevi, bir karboksilik asit ve bir Fmoc korumalı amino grubu ile siklopentadienil halkalarının ortogonal ikame oluşur. Bu ikame 1 gibi biyo-eşlenikler üretmek üzere siklopentadienil halkalarının ayrı modifikasyonu sağlayan ferrosen iç kısmın uzatılmış asimetrik değişimine olanak sağlar. Şekil 2'de gösterildiği gibi açık sarı bir boncuk biyotin-reçine çekirdeğe ferrosen başarılı çiftlenmesi sonucu, parlak turuncu bir renk tonu dönüştü.
Sentezin bir sonraki aşamasında bağlayıcıların çeşitli takılabilirReçineye bağlı ferrosen kongeneri serbest amine. Amino asit ihtiva eden bir tiolat olduğu gibi bu sistemin amaçları için, sistein kullanılmıştır. Aşağıda ele alındığı gibi tiolat bileşeni, bir altın yüzeye biyo-konjügatın bağlantı sağlar. Fmoc-Cys (MMT) -OH reçineye bağlı sistem arasındaki reaksiyon ile devam sistein ile modifikasyonu. Dimetilformamid içinde% 20 piperidin ile Fmoc grubunun çıkarılması 1 reçineye bağlı formları elde edilir. Reçineye bağlı biyo-konjügat, trifloroasetik asit (TFA), su ve triizopropil silan çözeltisi kullanılarak biyo-organometalik sistemler ayrılması ile katı destekten çıkarılmıştır. Elemental ve NMR analizi ile teyit edildiği gibi asit çözeltisi ve soğuk dietil eter ilave buharlaştırılması 1 bir kırmızı-turuncu bir katı madde kararlı olduğu TFA tuzu olarak biyo-konjügatı 1 elde edildi. Saflık HPLC analizi ile teyit edilmiştir.
Için prensip kanıtı göstermek içinBir altın yüzeyinde biyo-konjugat 1, 1 birikimi için bir bağlantı urgan sağlayan sistein bileşeni araştırılmıştır. iyi bilinen Au-S afinite polimer destekli altın yüzeyinde 1 uyduruk immobilizasyon sağlar. Bu deneyde, altın yüzeyi temizlenmiş ve yavaşça cilalanır. Lam daha sonra bir 1 ~ 1 mm su çözeltisi içine daldırılır ve / N O ayarlamak için bırakılmıştır. Au yüzey daha sonra damıtılmış su ile yıkandı ve Kimwipe kurutulmuştur. altın slaytlar sonra SEM kullanılarak değişiklik için değerlendirildi. Şekil 4'te gösterilen çizimin altın yüzey üzerinde oluşturulan olan 1, bir tek tabaka temsil etmektedir. yüzey kusurları 1 tek tabaka 'delikler' bir sonucu olarak öne ve bizim grup tarafından daha fazla keşif altındadır.
Genel olarak, sentetik yöntemler bu can ferosen Bioconjugatlar üretmek içinaltın yüzeyi üzerinde hareketsiz hale rapor edilmiştir. çalışma asimetrik ferrosen bileşiklerinin bu sentezde, yeni düşük verim ve saflık yol açan yan reaksiyonlarda oluşan bir dizi ile meydan olmasıdır. 1 benzer ferrosen-Bioconjugatlar potansiyel biyosensörler gibi uygulamalar var gibi, bu sentetik zorlukların üstesinden çok önemlidir. Katı-faz peptid sentezi benzer katı faz yöntemleri kullanarak, biyotin-ferrosen-sistein içeren, iyi karakterize edilmiş Bioconjugate 1 üretilmiştir. Ayrıca, SEM, bu sistem sistein bileşeninin tiolat kısma altın yüzeyi ile bağlı mümkün olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Genel olarak, burada sağlanan basit sentetik metodoloji kolayca uygulamalar için bir dizi peptid dizileri ve biyo-konjuge sistemler için de tadil edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KG RA Welch Vakfı hibe P-1760 tarafından desteklenen, Matematik & (KG) Fen Eğitimi TCU Andrews Enstitüsü, TCU Araştırma ve Yaratıcılık Faaliyet Hibe (KG) ve (EHS için) TCU SERC Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin Novatag Resin | NovaBiochem | 8550510001 | |
| TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe | Fisher | NC9299151 | |
| piperidine | Acros | P/3520/PB05 | |
| ninhydrin test | Sigma-Aldrich | 60017-1ea | |
| 1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid | Omm Scientific | Special Order | |
| N,N′-Diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407-5G | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Novabiochem | 8520080025 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T5408 | |
| 1,2-ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 2930 | |
| triisopropyl silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Eppendorf tubes (20 ml) | any source | ||
| methanol | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dichloromethane | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dimethylformamide | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| centrifuge | any source |
References
- Wang, J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics. Biosens Bioelectron. 21 (10), 1887-1892 (2006).
- Scarborough, J. H., Brusoski, K., Brewer, S., Green, K. N. Solid phase synthesis of ferrocene-biotin bioconjugates and reactivity with avidin. A paradigm for development of electrochemical biosensors. , Texas Christian University. Fort Worth, Texas. (2014).
- Zhang, S., Zheng, F., Wu, Z., Shen, G., Yu, R. Highly sensitive electrochemical detection of immunospecies based on combination of Fc label and PPD film/gold nanoparticle amplification. Biosens Bioelectron. 24 (1), 129-135 (2008).
- Gobi, K. V., Mizutani, F. Layer-by-layer construction of an active multilayer enzyme electrode applicable for direct amperometric determination of cholesterol. Sensors and Actuators. 80 (3), 272-277 (2001).
- Gobi, K. V., Mizutani, F. Amperometric detection of superoxide dismutase at cytochrome c-immobilized electrodes: Xanthine oxidase and ascorbate oxidase incorporated biopolymer membrane for in-vivo analysis. Analytical Sciences. 17 (1), 11-15 (2001).
- Gobi, K. V., Sato, Y., Mizutani, F. Mediatorless superoxide dismutase sensors using cytochrome c-modified electrodes: Xanthine oxidase incorporated polyion complex membrane for enhanced activity and in vivo analysis. Electroanalysis. 13 (5), 397-403 (2001).
- Shankaran, D. R., Uehara, N., Kato, T. A metal dispersed sol-gel biocomposite amperometric glucose biosensor. Biosensor.., & Bioelectronics. 18 (5-6), 721-728 (2003).
- Yamamoto, K., Xu, F., Shi, G. Y., Kato, T. On-line biosensor for detection of glucose, choline and glutamate simultaneously integrated with microseparation system. Journal of Pharmacological Sciences. 91, 211p-211 (2003).
- Luppa, P. B., Kaiser, T., Cuilleron, C. Y. Ligand-binding studies of sex hormone-binding globulin with 17alpha-dihydrotestosterone derivatives as ligands using a surface plasmon resonance biosensor. Clinical Chemistry. 47 (6), A9-A9 (2001).
- Luppa, P. B., Sokoll, L. J., Chan, D. W. Immunosensors - principles and applications to clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 314 (1-2), 1-26 (2001).
- Mallat, E., Barcelo, D., Barzen, C., Gauglitz, G., Abuknesha, R. Immunosensors for pesticide determination in natural waters. Trac-Trends in Analytical Chemistry. 20 (3), 124-132 (2001).
- Pemberton, R. M., Hart, J. P., Mottram, T. T. An electrochemical immunosensor for milk progesterone using a continuous flow system. Biosensor.., & Bioelectronics. 16 (9-12), 715-723 (2001).
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, W., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Annals of Biomedical Engineering. 27 (6), 697-711 (1999).
- May, K. M. L., Wang, Y., Bachas, L. G., Anderson, K. W. Development of a whole-cell-based biosensor for detecting histamine as a model toxin. Analytical Chemistry. 76 (14), 4156-4161 (2004).
- Taylor, C. J., Bain, L. A., Richardson, D. J., Spiro, S., Russell, D. A. Construction of a whole-cell gene reporter for the fluorescent bioassay of nitrate. Analytical Biochemistry. 328 (1), 60-66 (2004).
- Philp, J. C., et al. Whole cell immobilised biosensors for toxicity assessment of a wastewater treatment plant treating phenolics-containing waste. Analytica Chimica Acta. 487 (1), 61-74 (2003).
- Subrahmanyam, S., Piletsky, S. A., Turner, A. P. F. Application of natural receptors in sensors and assays. Analytical Chemistry. 74 (16), 3942-3951 (2002).
- Ryberg, E., et al. Identification and characterisation of a novel splice variant of the human CB1 receptor. Febs Letters. 579 (1), 259-264 (2005).
- Cooper, M. A. Advances in membrane receptor screening and analysis. Journal of Molecular Recognition. 17 (4), 286-315 (2004).
- Kumbhat, S., et al. A novel receptor-based surface-plasmon-resonance affinity biosensor for highly sensitive and selective detection of dopamine. Chemistry Letters. 35 (6), 678-679 (1246).
- Yemini, M., Reches, M., Gazit, E., Rishpon, J. Peptide nanotube-modified electrodes for enzyme-biosensor applications. Analytical Chemistry. 77 (16), 5155-5159 (2005).
- Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77 (21), 6976-6984 (2005).
- Drummond, T. G., Hill, M. G., Barton, J. K. Electrochemical DNA sensors. Nature Biotechnology. 21 (10), 1192-1199 (2003).
- Piunno, P. A. E., Krull, U. J. Trends in the development of nucleic acid biosensors for medical diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (5), 1004-1011 (2005).
- Dechtrirat, D., et al. Electrochemical displacement sensor based on ferrocene boronic acid tracer and immobilized glycan for saccharide binding proteins and E. coli. Biosensor.., & Bioelectronics. 58, 1-8 (2014).
- Lacina, K., et al. Combining ferrocene, thiophene and a boronic acid: a hybrid ligand for reagentless electrochemical sensing of cis-diols. Tetrahedron Letters. 55 (21), 3235-3238 (2014).
- Takahashi, S., Anzai, J. Recent Progress in Ferrocene-Modified Thin Films and Nanoparticles for Biosensors. Materials. 6 (12), 5742-5762 (2013).
- Liu, L., et al. Amplified voltammetric detection of dopamine using ferrocene-capped gold nanoparticle/streptavidin conjugates. Biosensor.., & Bioelectronics. 41, 730-735 (2013).
- Shankaran, D. R., Gobi, K. V. A., Miura, N. Recent advancements in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small molecules of biomedical, food and environmental interest. Sensors and Actuators B-Chemical. 121 (1), 158-177 (2007).
- Szarka, Z., Kuik, Á, Skoda-Földes, R., Kollár, L. Aminocarbonylation of 1,1′-diiodoferrocene, two-step synthesis of heterodisubstituted ferrocene derivatives via homogeneous catalytic carbonylation/coupling reactions. Journal of Organometallic Chemistry. 689 (17), 2770-2775 (2004).
- Niu, H. T., et al. Imidazolium-based macrocycles as multisignaling chemosensors for anions. Dalton Trans. (28), 3694-3700 (2008).
- Qing, G. -Y., Sun, T. -L., Wang, F., He, Y. -B., Yang, X. Chromogenic Chemosensors forN-Acetylaspartate Based on Chiral Ferrocene-Bearing Thiourea Derivatives. European Journal of Organic Chemistry. (6), 841-849 (2009).
- Romero, T., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A multiresponsive two-arm ferrocene-based chemosensor molecule for selective detection of mercury. Dalton Trans. (12), 2121-2129 (2009).
- Zapata, F., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A selective redox and chromogenic probe for Hg(II) in aqueous environment based on a ferrocene-azaquinoxaline dyad. Inorg Chem. 48 (24), 11566-11575 (2009).
- Alfonso, M., Tarraga, A., Molina, P. Ferrocene-based multichannel molecular chemosensors with high selectivity and sensitivity for Pb(II) and Hg(II) metal cations. Dalton Trans. 39 (37), 8637-8645 (2010).
- Zapata, F., Caballero, A., Molina, P., Tarraga, A. A ferrocene-quinoxaline derivative as a highly selective probe for colorimetric and redox sensing of toxic mercury(II) cations. Sensors (Basel). 10 (12), 11311-11321 (2010).
- Thakur, A., Sardar, S., Ghosh, S. A highly selective redox, chromogenic, and fluorescent chemosensor for Hg2+ in aqueous solution based on ferrocene-glycine bioconjugates). Inorg Chem. 50 (15), 7066-7073 (2011).
- Sathyaraj, G., Muthamilselvan, D., Kiruthika, M., Weyhermüller, T., Nair, B. U. Ferrocene conjugated imidazolephenols as multichannel ditopic chemosensor for biologically active cations and anions. Journal of Organometallic Chemistry. 716, 150-158 (2012).
- Kwon, S. J., Kim, E., Yang, H., Kwak, J. An electrochemical immunosensor using ferrocenyl-tethered dendrimer. Analyst. 131 (3), 402-406 (2006).
- Pinto, A., Hoffmanns, U., Ott, M., Fricker, G., Metzler-Nolte, N. Modification with Organometallic Compounds Improves Crossing of the Blood-Brain Barrier of [Leu(5)]-Enkephalin Derivatives in an In Vitro Model System. Chembiochem. 10 (11), 1852-1860 (2009).
- Barisic, L., et al. The first ferrocene analogues of muramyldipeptide. Carbohydr Res. 346 (5), 678-684 (2011).
- Brusoski, K., Green, K. N. Novel click derivatives of ferrocene and their applications toward construction of electrochemical biosensors. Abstracts of Papers, 243rd ACS National Meetin.., & Exposition. 2012 Mar 25-29, San Diego, CA, United States, , BIOL-28. (2012).
- Bucher, C., Devillers, C. H., Moutet, J. -C., Royal, G., Saint-Aman, E. Anion recognition and redox sensing by a metalloporphyrin–ferrocene–alkylammonium conjugate. New Journal of Chemistry. 28, 1584-1589 (2004).
- Tanaka, S., Yoshida, K., Kuramitz, H., Sugawara, K., Nakamura, H. Electrochemical detection of biotin using an interaction between avidin and biotin labeled with ferrocene at a perfluorosulfonated ionomer modified electrode. Analytical Sciences. 15 (9), 863-866 (1999).
- Real-Fernandez, F., et al. Ferrocenyl glycopeptides as electrochemical probes to detect autoantibodies in multiple sclerosis patients' sera. Biopolymers. 90 (4), 488-495 (2008).
- Husken, N., Gasser, G., Koster, S. D., Metzler-Nolte, N. Four-potential' ferrocene labeling of PNA oligomers via click chemistry. Bioconjug Chem. 20 (8), 1578-1586 (2009).
- Barisic, L. Croatica Chemica Acta. 75, 199-210 (2002).
- Kirin, S. I., Noor, F., Metzler-Nolte, N. Manual Solid-Phase Peptide Synthesis of Metallocene–Peptide Bioconjugates. Journal of Chemical Education. 84 (1), 108-111 (2007).
- Barisic, L., et al. Helically chiral ferrocene peptides containing 1 '-aminoferrocene-1-carboxylic acid subunits as turn inducers. Chemistry-a European Journal. 12 (19), 4965-4980 (2006).
- Mahmoud, K., Long, Y. -T., Schatte, G., Kraatz, H. -B. Electronic communication through the ureylene bridge: spectroscopy, structure and electrochemistry of dimethyl 1′,1′-ureylenedi(1-ferrocenecarboxylate). Journal of Organometallic Chemistry. 689 (13), 2250-2255 (2004).
- Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. Synthesis and electrochemical investigation of oligomeric ferrocene amides: Towards ferrocene polyamides. Journal of Inorganic and Organometallic Polymers and Materials. 16 (3), 201-210 (2006).
- Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. A bioorganometallic approach for the electrochemical detection of proteins: A study on the interaction of ferrocene-peptide conjugates with papain in solution and on au surfaces. Chemistry-a European Journal. 13 (20), 5885-5895 (2007).
